Abstract

ácido lisofosfatídico (LPA) desempenha um papel crítico na proliferação e migração de células cancerígenas do cólon; No entanto, os eventos de sinalização a jusante subjacentes a estes processos permanecem pouco caracterizados. O objectivo deste estudo foi o de investigar os percursos de sinalização desencadeada por LPA para regular os mecanismos envolvidos na progressão do cancro colo-rectal (CRC). Temos usado três modelos de linhas celulares de CRC, e inicialmente analisados ​​o perfil de expressão de receptores de LPA (LPAR). Então, nós tratamos as células com LPA e eventos relacionados com o seu potencial tumorigénico, como a migração, invasão, crescimento independente de ancoragem, a proliferação, bem como ciclo de apoptose e celular foram avaliados. Utilizou-se a técnica de matriz de chips para analisar o perfil de expressão do gene global que ocorre após o tratamento com o LPA, e identificou-se as vias de sinalização celulares relacionadas com o ciclo celular. A inibição destas vias verificou as conclusões da análise do transcriptoma. Verificou-se que as linhas celulares expressavam LPAR1, -2 e -3 de uma maneira diferencial e que 10 uM LPA não afectou a migração celular, invasão e crescimento independente de ancoragem, mas foi capaz de induzir a proliferação e progressão do ciclo celular em células HCT-116 . Embora LPA nesta concentração não induziu actividade de transcrição de β-catenina, promoveu a activação de Rho e STAT-3. Além disso, os inibidores Rock e STAT-3 impediu a proliferação LPA-induzido, mas a inibição ROCHA não impediu a ativação STAT-3. Finalmente, observou-se que o LPA regula a expressão de genes relacionados com o ciclo celular e que a inibição combinada da rocha e STAT-3 impediu a progressão do ciclo celular e aumento da expressão induzida pelo LPA de ciclinas E1, A2 e B1 para um maior grau do que quer inibidor sozinho. No geral, estes resultados demonstram que LPA aumenta o potencial proliferativo de HCT-116 células de adenocarcinoma de cólon através de um mecanismo que envolve a cooperação entre as vias Rho-rock e STAT3 envolvidas no controle do ciclo celular

Citation:. Leve F, Peres- Moreira RJ, Binato R, Abdelhay e, Morgado Díaz-JA (2015) LPA Induz cancro do cólon Proliferação celular através de uma cooperação entre a rocha e STAT-3 Acesso. PLoS ONE 10 (9): e0139094. doi: 10.1371 /journal.pone.0139094

editor: Shrikant Anant, Universidade de Kansas School of Medicine, Estados Unidos

Recebido: 15 de junho de 2015; Aceito: 09 de setembro de 2015; Publicação: 29 de setembro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Leve et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pela Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado de Rio de Janeiro (FAPERJ) e Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia em Câncer INCT (573806 /2008-0 e 170,026 /2008) para JAMD; e Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado de Rio de Janeiro (FAPERJ) (26/11703/2013) para JAMD

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

ácido lisofosfatídico (LPA) é uma ocorrência natural presente lisofosfolípido bioativo na maioria dos tecidos e fluidos biológicos. LPA pode ser gerado por ambos lisofosfolipase D (liso-PLD), tais como autotaxina (ATX), ou por meio de fosfolipase A2 ou A1 (PLA1 e PLA2, respectivamente) [1]. ATX foi identificado pela primeira vez em melanoma maligno como um factor quimiotáctico necessário para a invasão de melanoma [2], e ATX /Lyso-PLD são expressas de forma aberrante em muitos cancros humanos e na doença inflamatória do intestino [1,3]. Além disso, níveis elevados de LPA foram encontradas no plasma e fluido ascítico de pacientes com cancro do ovário [4]; Da mesma forma, níveis elevados de lisofosfatidileolino (LPC), um precursor de LPA, foram encontrados no plasma de cancro colo-rectal (CRC) pacientes [5]. Embora o aumento nos níveis de LPA em fluidos de pacientes com CCR ainda não foi demonstrado directamente, Lin

et ai. [6] demonstraram que a administração oral de LPA para a APC

Min /+ ratinhos, que é um modelo amplamente usado no CRC, quase duplicou o número de pólipos no intestino. Juntos, estes estudos suportam a noção de que a LPA desempenha um papel importante na CRC patologia, que é o terceiro tipo de câncer mais frequente em homens eo segundo mais frequente em mulheres em todo o mundo [7].

Através da sua ligação para o específico G receptores -protein-acoplados (GPCRs), LPA medeia muitas respostas biológicas no câncer. Em células CRC, LPA aumenta a proliferação [8], a protecção apoptose [9], a migração [10] e adaptação à hipoxia [11]. É bem aceito que a resposta celular ao LPA depende do padrão de LPA receptores (LPARs) expressão porque varia amplamente entre os diferentes tecidos e tipos de células. Existem actualmente seis LPARs reconhecidos, LPA

1-6, que são sobre-expressos em diferentes tipos de cancros, incluindo CRC [12,13,14]. Entre estes LPAR, as LPAR clássicas bem conhecidas, o LPA

1-3, pertencem ao gene de diferenciação de células endoteliais da família (EDG) de GPCRs e têm sido descritos para regular a comportamentos diferentes em células de CRC. Por exemplo, utilizando ARN de interferência específico, demonstrou-se que LPA

2 e LPA

3 mas não LPA

1 são alvos para a proliferação induzida pelo LPA de HCT-116 e LS174T [8]. Além disso, demonstrou-se que LPA

1 medeia o espalhamento celular LPA-estimulada de células DLD-1 e que utiliza um sistema de shRNA-lentivírus [15]. Além disso, LPA

3 knockdown aumenta a migração e invasão de HCT-116 células [16].

LPARs desencadear uma série de vias de sinalização a jusante. É bem estabelecido que o LPA produz respostas do citoesqueleto Rho-dependentes, tais como a formação de fibras de stress [17], que são estruturas relacionadas com a migração das células. De facto, mostrámos que em células Caco-2, a migração celular induzida pelo LPA é dependente de Rho-ROCK [10]. Além disso, a sinalização Rho-Rock, também foi relatado para desempenhar um papel na regulação da proliferação de células [18]. Apesar de alguns estudos já demonstraram que LPA estimula a proliferação de células cancerígenas do cólon tais como HCT-116 e SW480 [8,19], a participação sinalização Rho-ROCK neste evento não foi abordada.

O transdutor de sinal e activador de transcrição 3 (STAT-3) é um factor de transcrição envolvidos em processos tumorigénese. Constitutiva de ativação STAT-3 está associada a vários cancros humanos e comumente sugere mau prognóstico [20]. foi previamente mostrado que ROCHA estimula a ativação de STAT-3 a Janus quinase 1 (JAK 1); STAT-3 e JAK 1 cooperam para controlar actomiosina contractilidade para mediar a migração amebóide arredondada em células de melanoma [21]. Além disso, observou-se que o LPA induz a motilidade celular através da fosforilação de STAT-3 em células de cancro do ovário [22]. Curiosamente, STAT-3 fosforilação está implicado no crescimento de células do cancro do cólon HCT-116 [23]. No entanto, desconhece-se se LPA ativa STAT-3 em células CRC ou provoca a ativação da participação Rho-ROCK nesta via de sinalização.

Assim, o objetivo deste estudo foi analisar o papel que desempenha na LPA diferentes processos biológicos de progressão da CRC, como a migração, invasão e proliferação, e para determinar os mecanismos subjacentes a esses eventos. Aqui, demonstramos que o LPA aumenta a proliferação de células HCT-116 por meio de uma cascata que integra RhoA-ROCK e sinalização de STAT-3 para controlar a expressão de ciclina e a progressão do ciclo celular.

Materiais e Métodos

Anticorpos e reagentes

L-α-lisofosfat�ico ácido (cat oleoyl de sódio não L7260..), de coelho anti-LPA

1 (N-terminal; cat. No. SAB4500689), de coelho anti-LPA

2 (cat. no. HPA019616), de coelho anti-LPA

3 (cat. no. HPA013421), anti-ciclina B1 (cat. no. SAB4503501), dicloridrato de 40,6-diamidino-2-fenilindole (DAPI ;.. N ° Cat 32670) e peroxidase de rábano conjugada com anticorpo de cabra anti-coelho e anti-IgG de rato foram obtidos a partir de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). Coelho monoclonal anti-STAT-3 (cat no 9139..), Anticorpo monoclonal de ratinho (pTyr 705..; N�cat 9131), fosfo-STAT3 anti, policlonal de coelho tubulina anti-α (cat no 2144..), Coelho monoclonal anti -GSK-3β (cat no 9315.), anti-fosfo-GSK-3β (pSer9;.. N�cat 9336)., anticorpo monoclonal de ratinho anti-β-catenina (.. N�cat 9582) e anti-GAPDH (N�cat . 2118) foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology (Danvers, MA, EUA). STA-21 ((S) -Ochromycinone deoxytetrangomycin;.. N�cat SC-200757), anti-ciclina A2 (.. Gato não sc-596) e de ratinho anti-ciclina E1 (.. Gato não sc-247) foram comprados de Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, EUA). Obteve-se a 488 conjugado com anticorpo secundário Alexa (cat. no. A11008) a partir de Molecular Probes (Eugene, OR, EUA). Y-27632 ((R) – (+) – trans-N- (4-Piridil) -4- (1-aminoetil) -ciclo-hexanocarboxamida;. Gato não US1688000). Foi adquirido de Calbiochem Merck (Darmstadt, Alemanha)

cultura celular e tratamentos LPA

as linhas de células humanas de adenocarcinoma colorectal Caco-2 (HTB-37TM) e HT-29 (HTB-38TM), o colorectal humano linha de células de carcinoma HCT-116 ( CCL-247TM) e a linha celular de cancro do ovário OVCAR-3 (HTB-161) foram obtidas da American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA, EUA). As células de cancro do cólon foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Invitrogen) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS), penicilina G (60 mg /L) e estreptomicina (100 mg /L) a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2 /ar. As células foram subcultivadas semanalmente com 0,05% de tripsina /EDTA a 0,02% em solução de PBS. As células de adenocarcinoma do ovário foram cultivadas em meio de Roswell Park Memorial Institute (RPMI 1640) (Sigma-Aldrich) que foi suplementado com 20% de FBS, penicilina G (60 mg /L) e estreptomicina (100 mg /L) a 37 ° C em numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2 /ar. células Caco-2 possuem um fenótipo diferenciado, quando eles formam uma monocamada confluente, com baixo potencial invasivo e metastático; as células HT-29 são moderadamente diferenciado, enquanto as células HCT-116 têm um fenótipo indiferenciada e alto potencial tumorigénico. Assim, estas células representam diferentes fases de progressão CRC. As culturas de células foram mudadas para meio isento de soro durante 24 h antes do tratamento de LPA 10 ^ M, conforme relatado anteriormente [10].

inibidores selectivos farmacológicos foram adicionados às culturas de células 1 hora antes do tratamento de LPA e estiveram presentes durante todo o tratamento, tal como indicado. Os inibidores foram diluídos em DMSO e armazenado a -20 ° C. Cada solução concentrada foi diluída imediatamente antes da utilização a dar concentrações finais de 10 mM Y-27632 (ROCHA) e 10 mM STA-21 (STAT-3).

Western-blot análise

A As células tratadas foram homogeneizados em tampão de lise (1% Triton X-100, 0,5% desoxicolato de sódio, 0,2% de SDS, NaCl 150 mM, EDTA a 2 mM, Hepes 10 mM, pH 7,4) contendo NaF 20 mM, ortovanadato 1 mM, e um cocktail inibidor de protease (Sigma, MO, diluição 1: 100) durante 30 min a 4 ° C. Os lisados ​​homogeneizados foram submetidas a centrifugação a 10.000 g durante 10 min a 4 ° C. Os sobrenadantes foram recolhidos e armazenados a -80 ° C para análise subsequente. Quantidades iguais de proteína (30 a 60 ug /pista), quantificada pelo kit de ensaio de proteína BCA (BioRad, Hercules, CA, EUA), foram preparados por ebulição, após a adição de tampão de amostra de desnaturação; eles foram separados electroforeticamente por SDS-PAGE em 7,5, 10 ou 12% de gel e transferidos para membranas de nitrocelulose usando uma célula de transferência semi-seco (BioRad) a 10 V durante 60 min. As membranas foram bloqueadas durante 1 h com TBS-T (Tris-HCl a 20, pH 7,6, NaCl 137 mM e 0,1% de Tween-20) contendo 5% de baixo teor de gordura ou leite em pó com 1% de BSA (Sigma); elas foram incubadas durante a noite com os anticorpos primários seguintes: anti-LPA

1 (1: 500), anti-LPA

2 (1: 500), anti-LPA

3 (1: 500), anti -α-tubulina (1: 1000), anti-GAPDH (1: 3000), anti-β-catenina (1: 1000), anti-GSK3-β (1: 1000), anti-fosfo-GSK3-β (Ser9 ) (1: 1000), anti-STAT-3 (1: 1000), anti-fosfo-STAT-3 (Tyr 705) (1: 1000), anti-ciclina A2 (1: 2000), anti-ciclina E1 ( 1: 2000) e anti-ciclina B1 (1: 2000). Após a lavagem, as membranas foram incubadas durante 1 h com conjugado com peroxidase de cabra anti-coelho ou de murganho anti-IgG (1: 5000). Em seguida, as membranas foram lavadas, e as bandas de proteína foram visualizadas usando um kit de quimioluminescência aumentada (GE Healthcare UK Limited, Buckinghamshire, Reino Unido). As imagens da banda de três experimentos independentes foram quantificados por densidade óptica usando LABWORKS 4.6 software (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).

RhoA ensaio de activação

As actividades da proteína Rho foram determinados usando um específico G-LISA

TM

RhoA Activation Assay Biochem Kit

TM (citoesqueleto, CO, EUA) seguindo as instruções do fabricante. Resumidamente, Rhotekin RBD ligado às placas foi utilizado para precipitar GTP Rho-ligado a partir do lisado celular. O RhoA activa foi detectada utilizando um anticorpo específico contra a Rho e foi visualizado utilizando uma reacção de quimioluminescência. O nível de ativação foi medida com a absorção fixado em 490 nm em espectrofotômetro de microplacas.

-cicatrização de feridas ensaio

monocamadas de células foram privadas de soro durante 24 h, tratada com LPA e riscado usando uma ponta de pipeta estéril. Para cada prato, três feridas foram feitas manualmente, e os três locais regulares feridas foram verificados sob um microscópio Axio Observer Z1 (Carl Zeiss, Inc., Jena, Alemanha) equipado com um Axio Cam HRc e um Axio Visão lançamento Analyzer 8.2 imagem; as feridas foram então seleccionadas e marcadas. Após lavagem com PBS, meios frescos contendo os inibidores foram adicionados para as células, as quais foram incubadas a 37 ° C, em DMEM isento de soro contendo 10 uM de LPA. As células não tratadas e tratadas foram autorizados a migrar para a área ferida e foram fotografadas tanto imediatamente após o ferimento (0 h) e 24 h após o ferimento. A distância entre as duas bordas da lesão foi quantificada utilizando Adobe Photoshop 6.0 a partir de três experiências independentes. Os valores são representados como percentagens e traçados no gráfico.

ensaio de invasão

Para testar a invasão de células tumorais, um Transwell com um filtro de policarbonato de 6,5 milímetros (tamanho de poro 8, Cat. N. 3422; Costar, Cambridge, MA) foi revestida com 20 uL de Matrigel® (N ° Cat 356230;.. BD Biosciences, San Diego, CA) diluído em DMEM (01:10) e incubado a 37 ° C durante 30 min. Caco-2 (2,5 x 10

4), HT-29 (2 x 10

4), HCT-116 (2 x 10

4) e de Ovcar-3 (2 x 10

4) células, em 200 ul de meio isento de soro com LPA, foram semeadas na câmara superior do Transwell. O meio de cultura com 20% de FBS foi adicionado como um quimioatractivo na cara inferior. Após 48 h de incubação, a superfície superior da membrana foi esfregada com uma mecha de algodão. As células invadidas na membrana inferior foram fixadas em etanol durante 10 minutos e coradas com violeta de cristal. O número de células não tratadas e tratadas invadidos foi expressa como a média de quatro campos aleatórios sob o microscópio. Os valores são representados como percentagens e traçados no gráfico. OVCAR-3 foi utilizado como um controlo positivo da eficácia LPA.

Anchorage-independente crescimento

Caco-2, HT-29 e HCT-116 células foram semeadas numa placa de 12 poços ( previamente cobertas com 1 ml de 0,6% de agarose semi-sólido) a uma densidade de 250 células /cavidade em uma solução de DMEM contendo 10% de SFB e 0,3% de agarose durante 30 min. DMEM com FBS a 10% que continha LPA quer ou não continha LPA (controlo) foi adicionado ao topo da solução semi-sólida e foi renovada a cada 3 dias. Após 14 dias, as colônias formadas foram fotografadas e contadas usando um Axio Observer Z1 (Carl Zeiss, Inc.) microscópio equipado com uma câmera Axiocam MRC5.

A viabilidade celular análise

HT-29 ( 1×10

3 células /ml) e HCT-116 (2 x 10

4 células /células mL) foram semeadas e cultivadas em placas de 96 poços e, após a depleção de FBS, tratados com uma das seguintes soluções: 10 LPA sozinho uM, 10 uM STA-21, 10 uM Y-27632, ou LPA em combinação com estes inibidores para os tempos indicados antes da incubação com MTT (Sigma Chemical Co.). As células foram mantidas durante 2 h a 37 ° C e centrifugou-se a 1500 g durante 5 min. O sobrenadante foi removido e os cristais foram dissolvidos em DMSO. A absorvância a 538 nm foi medida com um Spectra Max 190 espectrofotómetro (Molecular Devices Sunnyvale, CA).

proliferação celular ensaio

O método de violeta de cristal foi usada para medir a proliferação celular. Caco-2 (2×10

4 células /mL), HT-29 (10

3 células /ml) e HCT-116 (2×10

ml /4 células), as células foram cultivadas em placas de 96 poços e FBS foram depletados e tratadas como indicado com LPA e inibidores de STAT-3 e rocha por 24, 48 e 72 h e fixadas com etanol durante 10 min. A solução de violeta de cristal (0,05% de violeta de cristal e 20% de metanol) foi adicionado durante 10 min. As células foram lavadas duas vezes com água e, em seguida, solubilizado com metanol. A absorvância a 595 nm foi medida com um espectrofotómetro de espectros Max 190 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EUA). Os valores são representados como percentagens e traçados no gráfico.

apoptose e análise de sobrevivência

HT-29 e HCT-116 células (10

5-10

6 células /mL) foram cultivadas em placas de microtitulação de seis poços e foram-privadas de soro durante 24 h. Depois, eles foram tratados durante 24, 48 e 72 h, com LPA 10 ^ M. A apoptose foi detectada por um ensaio de Anexina V /iodeto de propídio (PI) a coloração para detectar células apoptóticas precoce, tardia células apoptóticas e células não apoptóticas nos tempos indicados. As células foram lavadas em PBS gelado e ressuspensas em 100 ul de Anexina V tampão (HEPES /NaOH a 0,1 M (pH 7,4), 1,4 M de NaCl, CaCl 25 mM

2) contendo anexina V-FITC e PI (obrigatório 1 ug /mL) durante 15 min. A análise FACS foi realizada utilizando um citómetro de fluxo FACSCalibur e o software CellQuest (BDBiosciences, San Jose, CA, EUA); as células negativas tanto para anexina V e PI foram considerados viáveis ​​(sobrevivência).

análise do ciclo celular

HCT-116 células (10

5-10

6 células /mL ) cultivadas em placas de microtitulação de seis poços foram esgotadas de FBS e tratou-se para 8, 12 e 16 h com LPA e /ou inibidores de STAT-3 ou ROCK. Após este período, as células foram colhidas por tripsinização e lavadas uma vez com PBS arrefecido em gelo. As células foram então coradas no escuro com 75 iodeto uM de propídio (Sigma) durante 10 minutos num tampão contendo Tris-HCl a 3,4 (pH 7,6), 10 mM de NaCl, 0,2% de Triton X-100 e 3500 U /L de ARNase. Uma análise do teor de ADN foi realizada por recolha de 10.000 eventos para a análise do ciclo celular e sub-G1 utilizando um citómetro de fluxo FACSCalibur (BD Transduction Labs, Lexington, KY, EUA) e da modificação Fit LT software.

Imunofluorescência

As células foram plaqueadas em lamelas que tinham sido colocados em placas de 24 poços, antecipadamente. Após o esvaziamento e o tratamento de FBS, as células foram lavadas em PBS suplementado com CaCl 100 mM de

2 e 100 mM de MgCl

2 (PBS /CM) e fixado em 100% de metanol durante 20 min. As amostras foram permeabilizadas com 0,5% de TX-100 em PBS durante 10 min. Mais tarde, as células foram incubadas em 50 mM de NHCl

4 em PBS durante 10 min e bloqueadas em BSA a 3% durante 1 h. As células foram incubadas com os anticorpos primários, anti-β-catenina (1: 250) e anti-STAT3 (1:50) durante 1 h, seguido de mais uma hora de incubação com Alexa 488-conjugado anti-coelho ou anti secundário anticorpos -mouse. Em seguida, as células foram incubadas com dicloridrato de 40,6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) (1: 1000) durante 3 min. As lamelas foram lavadas em PBS e montadas com

N

propil-galato, e coloração de células foi detectada utilizando um microscópio de imuno- fluorescência axio Observador Z1 equipado com um Axiocam HRc Rev. 3 e uma câmara de lançamento Axiovision 4,8. um programa de analisador de imagem (Carl Zeiss Inc., Alemanha) |

ensaio de luciferase para a actividade TCF

Dois genes repórter da luciferase diferentes TCF foram usados ​​neste ensaio:. um de tipo selvagem intacto TCF-luciferase construção repórter (Super 8 TOPFLASH) e uma construção repórter mutado TCF-luciferase (Super 8 FOPFLASH), o qual foi utilizado como um controlo negativo. HCT-116 (2×10

4) As células foram semeadas em placas de seis poços e transientemente transfectadas com 2 ug do SUPER 8 TOPFLASH ou FOPFLASH plasmídeo repórter, juntamente com 3 ul da FUGENE® 6 Transfection Reagent (Roche). Como um controlo para a eficiência da transfecção, 0,2 ug de um constructo de luciferase Renila foi incluído em cada transfecção. Após 24 h de transfeco, as culas foram lavadas duas vezes com PBS, FBS empobrecido durante 24 h e, em seguida, tratada com LPA 10 ^ M. As células foram colhidas 6 e 24 h após a transfecção, e os extractos foram preparados com 200 ul de tampão lise repórter (Promega). Renila e a actividade de luciferase foi ensaiada de acordo com o protocolo do fabricante utilizando um Dual-Luciferase Reporter Assay Kit de Sistema (Promega). A actividade da luciferase em cada poço foi normalizada para a actividade de renila. Três experimentos independentes, cada ensaiadas em triplicado, foram realizados em passagens celulares separadas.

Expression Chip dados da matriz de análise

RNA total a partir de células HCT-116 FBS-empobrecido que foram tratadas ou não com LPA durante 12h foram obtidos utilizando um RNeasy Mini Kit (Qiagen, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Cem nanogramas de ARN total foi usada para sintetizar o ARNc biotinilado de acordo com o ensaio de sentido alvo de rotulagem GeneChip transcrição inteira (WT) (

Affymetrix

,

EUA

). Depois, o ARNc biotinilado foi hibridado com o gene humano GeneChip 1,0 matriz ST (

Affymetrix

,

EUA

), lavadas e coradas de acordo com os protocolos do fabricante. As matrizes GeneChip foram digitalizados usando um scanner GeneChip® 3000. O Expression Affymetrix Console Software Versão 1.0 foi usada para criar valores de expressão resumidos (CHP-files), ea análise Multichip (RMA) algoritmo robusto foi aplicado. Os dados foram analisados ​​usando Partek

® software (https://www.partek.com) [24]; genes diferencialmente expressos com ≥ 2-fold-change foram utilizados como critérios para definir a sobre-expressão ou regulação para baixo. Os processos de análise de percurso e relacionados foram obtidos utilizando MetaCore

TM software (https://thomsonreuters.com/metacore) e Ingenuity

® software de análise de Caminho (https://www.ingenuity.com).

A análise estatística

A análise estatística de três experiências independentes foi realizada utilizando GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, San Diego, CA, EUA). As análises estatísticas de migração, invasão, crescimento independente de ancoragem, atividade TCF e densidade óptica de proteína foram realizadas utilizando testes t de Student; a análise do ciclo celular foi realizada utilizando um ANOVA de uma via com o pós-teste de Bonferroni; e uma ANOVA bicaudal com o pós-teste de Bonferroni foi realizada para o ensaio de proliferação celular. Os dados foram expressos como a média ± SEM. A diferença foi considerada estatisticamente significativa quando * P 0,05; ** P 0,01; *** P . 0.001

Resultados

células de câncer colorretal expressam receptores de LPA de maneira diferencial, mas o tratamento LPA não altera a migração celular, invasão ou crescimento independente de ancoragem

Inicialmente, investigou-se os níveis de receptores do LPA de expressão em três linhas de células de cancro do cólon, Caco-2, HT-29 e HCT-116, utilizando transferência de western. Fig 1 mostra que Caco-2, HT-29 e HCT-116 células expressam os receptores de LPA

1, LPA

2 e LPA

3 em modos diferenciais. As células Caco-2 invasivos de baixo grau apresentaram menores níveis de LPA

1 e LPA

3 em relação às outras linhas celulares e níveis mais altos de LPA

2 em relação ao HT-29. O HT-29 intermediariamente invasiva células expressaram níveis similares de todos os três receptores do LPA; e as células altamente invasivos HCT-116 apresentaram maiores níveis de receptores de LPA

2 e LPA

3, em comparação com células Caco-2 e HT-29 células, mas níveis mais baixos de LPA

1 em relação aos HT-29. Este resultado indica que, de facto, as três linhas de células são sensíveis a este biolido. Alguns estudos têm mostrado que o LPA medeia a migração celular numa vasta gama de tipos de células de cancro [25,26], e que têm anteriormente demonstrado que o LPA aumenta a migração de células Caco-2 [10]. Assim, queríamos avaliar os efeitos do LPA sobre eventos relacionados com a progressão do cancro em células cancerígenas do cólon com um maior potencial invasivo. Portanto, foi realizada de cicatrização de feridas, um ensaio de invasão celular e crescimento independente de ancoragem (AIG) em células Caco-2, HT-29 e células HCT-116. Verificou-se que o LPA não alterou a migração celular em células HT-29 e HCT-116 ou aumentar o potencial invasivo das linhas de células de cancro do cólon três; Além disso, o LPA não alterou a tumorigenicidade, tal como avaliadas pelo AIG (S1, S2 e S3 Figs, respectivamente).

Representante de Western blotting e análises densitométricas de Caco-2, HT-29 e células HCT-116 utilizando Os anticorpos específicos contra LPAR

1-3 (AC, respectivamente). células Caco-2 expressam altos níveis de LPA

2, células HT-29 expressam altos níveis de LPA

1-3 e HCT-116 células expressam altos níveis de LPA

2-3. As pontuações médias ± SEM. durante três experimentos independentes são mostrados.

O LPA não induzir a morte celular, mas aumenta a proliferação, promovendo a progressão de células para a fase S e, em seguida, o G2 /M fases

Porque LPA aumenta celular proliferação e a evasão de morte em células cancerígenas do cólon [8,9,27], decidimos avaliar se LPA modula a viabilidade celular em nosso estudo. Os nossos resultados indicam que após 48 e 72 h de tratamento, o LPA aumentou o número de células viáveis ​​HCT-116, mas não o número de células Caco-2 viáveis ​​e células HT-29 (Figura 2A). Uma vez que um aumento do número de células viáveis ​​pode indicar a indução da proliferação ou diminuição da morte celular por evasão apoptose, verificou-se se LPA poderia afectar a morte celular por incubação de HCT-116 células privadas de soro com LPA para 24, 48 e 72 h e, em seguida, manchando o células com Anexina V e PI (Fig 2B e 2C). LPA não alterou o número de células mortas, indicando que o aumento no número de células observado na Figura 2A ocorre através do aumento da proliferação celular e não a redução da morte. Para determinar se o crescimento de células HCT-116 induzida pelo LPA foi um resultado da alteração da regulação do ciclo celular, os perfis do ciclo celular foram monitorizados por uma análise de citometria de fluxo do conteúdo de ADN. Tal como mostrado na Fig 3, a distribuição nas fases do ciclo celular indicaram que o tratamento com o LPA para 8, 12 e 16 h promovida a progressão de células para a fase S e, em seguida, a G2 /M fases, durante o qual a população aumentada em comparação com o células privadas de soro.

células cancerígenas do cólon foram FBS jejum de 24 horas e em seguida tratados com LPA (10 mM) durante 24, 48 ou 72 h. O número relativo de células foi avaliado através de coloração com violeta de cristal (a), e a apoptose foi seguida pelo método de dupla coloração com anexina-V /PI (b). a) LPA aumentou o número relativo de células HCT-116, mas não células Caco-2 ou as células HT-29. As análises estatísticas foram realizadas utilizando

dois sentidos

ANOVA com

post-hoc Bonferroni

teste. ** P 0,01; *** P 0,001. pontuações médias ± SEM. durante três experimentos independentes são mostrados. b) análise de FACS através de anexina V-FITC coloração /PI mostrou que LPA não reduziu a morte celular em células HCT-116. Quatro populações de células diferentes foram detectados após a coloração de anexina V /PI das células HCT-116. As células vivas são agrupados na parte inferior esquerda do painel, as células início apoptóticos são agrupados na parte inferior direita do painel, as células tarde apoptóticos são agrupadas na parte superior direita do painel e células necróticas são agrupadas na parte superior esquerda do painel. FL1-H, Anexina V; FL2-H, PI. c) Os dados obtidos a partir do fluxo de citometria de análises são representados num gráfico. Não houve aumento no percentual de apoptose LPA-mediada.

As células foram FBS fome durante 24 h (cont, controle), tratados com LPA nos horários indicados, coradas com PI e analisados ​​utilizando FACS. a) A percentagem de células na fase G2 /M foi significativamente aumentada após 12 e 16 h de tratamento com LPA. M1: células em G1; M2: células na fase S; M3: células em G2 /M. b) O gráfico mostra a percentagem de células S e G2 /M, em relação ao grupo de controlo. A proporção de ADN em fase S foi calculada usando software ModfitLT. Os dados são apresentados como a média ± SEM de três experiências independentes. As análises estatísticas foram realizadas utilizando

one-way ANOVA

(*** p 0,001). PI, iodeto de propidio; FACS, separação de células activadas por fluorescência.

proliferação celular induzida pelo LPA de HCT-116 envolve Rho-ROCK sinalização ativação

Com base em estudos anteriores que mostram que a LPA ativa a pequena GTPase Rho [14] e que a Rho regula a proliferação das células em diferentes tipos de células [28], nós decidimos investigar se-LPA induzir proliferação de células HCT-116 é dependente de Rho-ROCK. As camadas de células foram privadas de soro durante 1 hora, seguido por tratamento com 10 uM de LPA nos tempos indicados; Em seguida, realizou o ensaio de actividade de Rho. S4 Figura mostra que o LPA induz a activação RhoA principalmente aos 5 e 15 minutos de tratamento. Este resultado corrobora estudos anteriores que mostram que a LPA ativa RhoA GTPase.

Em seguida, examinamos se LPA ativa ROCHA jusante de Rho e se esta via de sinalização é responsável pela modulação da proliferação celular. Assim, foi realizado um ensaio de violeta cristal e análise do ciclo celular após a inibição da rocha com Y-27632. Os resultados indicam que a inibição ROCHA impediu o aumento no número relativo de células após o tratamento com o LPA durante 48 h (Figura 4A). Além disso, o inibidor ROCHA impedido induzida pelo LPA progressão do ciclo celular (Fig 4B). Estes dados apoiam a noção de que o LPA induz a proliferação de células HCT-116 por meio de activação de Rho-ROCK.

monocamadas subconfluentes de células foram esgotadas de FBS durante 24 h e tratou-se com LPA nos tempos indicados. a) cristal coloração violeta de HCT-116 mostrou que o inibidor ROCHA Y-27632 (10 uM) impediu um aumento LPA-mediada no número relativo de células depois de 48 h de tratamento. As análises estatísticas foram realizadas utilizando

dois sentidos

ANOVA com

post-hoc Bonferroni

teste. *** P 0,001, versus controle; ### P 0,001, contra LPA. pontuações médias ± SEM. durante três experimentos independentes são mostrados. b) A análise de FACS através de coloração com PI mostrou que a inibição da rocha com Y-27632 impediu o aumento induzido por LPA na proporção de células na fase S-G2 /M. As análises estatísticas foram realizadas utilizando

one-way ANOVA

com

post-hoc Bonferroni

teste. Os dados são apresentados como média ± SEM. (*** P 0,001, vs controle; ## p 0,01, vs LPA)

LPA ativa STAT-3 para mediar a proliferação de células de forma independente Rho-ROCK

é bem sabido que ambos LPA e Rho podem desencadear diferentes vias de sinalização para modular a proliferação celular. Além disso, temos mostrado anteriormente que a LPA perturba junções aderentes em Caco-2 células através de Rho-ROCK sinalização [10], e de um estudo realizado por Yang

et al

.