(CSCs) é um pré-requisito importante para pesquisa CSC. No momento, os pesquisadores geralmente ganham CSCs de alta pureza por meio de citometria de fluxo triagem e expandi-los pela cultura esfera de curto prazo. No entanto, ainda é incerto se podemos ampliar CSCs de alta pureza através da cultura esfera de longo prazo. Propusemos um modelo matemático utilizando equações diferenciais ordinárias para derivar a variação contínua do rácio de CSC na cultura esfera de longo prazo e estima os parâmetros do modelo com base em uma cultura esfera de longo prazo de células MCF-7 de células estaminais. Descobrimos que a relação de CSC na cultura esfera longo prazo apresentados como diminuiu gradualmente deriva e pode ser estável a um nível inferior. Além disso, verificou-se que os parâmetros do modelo embutidos poderia explicar o padrão de crescimento principal da CSCs e células cancerosas diferenciadas em cultura esfera longo prazo

Citation:. Peng T, Qinghua M, Zhenning T, Kaifa W, Jun J ( 2011) Long-Term Sphere Cultura não é possível manter uma alta proporção de células-tronco cancerosas: um modelo matemático e Experiment. PLoS ONE 6 (11): e25518. doi: 10.1371 /journal.pone.0025518

editor: Sui Huang, Instituto de Biologia de Sistemas, Estados Unidos da América

Recebido: 01 de abril de 2011; Aceito: 07 de setembro de 2011; Publicação: 16 de novembro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Peng et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. A pesquisa foi apoiado pelo Fundo de Ciência Natural Nacional da República Popular da China (no. 30872517). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

na última década, mais e mais evidências tem demonstrado que os tumores se originam de uma subpopulação de células que têm células auto-renovação e capacidade de diferenciação multidirecional, chamado tronco cancerosas (CSCs) ou células tumorais iniciar (TICs) [ ,,,0],1] – [3]. Além disso, os CSCs foram confirmados como sendo a origem de recorrência e metástase do cancro [4] – [6]. Portanto, a investigação sobre CSCs tornou-se um ponto focal da investigação oncológica.

A aquisição abundante de alta pureza CSCs é um requisito importante para a investigação CSC. Em 2003, Al-Hajj et al. primeiro relatou que apenas um pequeno grupo de células de câncer de mama que têm um CD44

+ CD24

– /baixa fenótipo têm a capacidade de sustentar a formação de tumores [7]. Assim, os CSCs de alta pureza pode ser obtida por meio de triagem de citometria de fluxo. No entanto, a baixa proporção de CSCs entre células cancerosas significa que dificilmente pode obter CSCs suficientes para novas experiências imediatamente após citometria de fluxo de classificação. Dario Ponti et al. demonstraram que as células de câncer de mama podem formar mammospheres quando cultivadas sem soro em placas não aderentes e que esse método poderia enriquecer CD44

+ CD24

– /CSCs baixos de câncer de mama [8]. Além disso, glioma, carcinoma colorrectal e outros tipos de CSCs foram cultivadas utilizando o mesmo método. Portanto, CSCs foram ampliados por meio da cultura esfera [9] – [12]. No entanto, se a cultura esfera longo prazo pode manter uma alta proporção de CSCs não é clara.

Symmetric e divisão assimétrica dois tipos de padrões de crescimento das CSCs [13], [14]. Um CSC pode dividir-se em qualquer uma das duas CSCs idênticos, através de divisão simétrica ou de um CSC e uma célula cancerosa diferenciada através da divisão assimétrica. Além disso, as células cancerosas diferenciados pode se transformar em CSCs, mediante a transição epitelial-mesenquimal (EMT) [15]. Enquanto isso, as células cancerosas diferenciadas misturados com CSCs de citometria de fluxo triagem e derivados de divisão assimétrica também proliferam quando cultivadas. No entanto, a influência dos processos acima mencionados sobre a relação CSC em cultura em suspensão sem soro é desconhecido.

Para prever a variação contínua do rácio de CSC na cultura esfera de longo prazo, foi proposto pela primeira vez um modelo de cinética diferencial usando comum equações que consideraram a divisão simétrica e assimétrica de CSCs, bem como a proliferação e transformação das células cancerosas diferenciadas. A análise teórica mostrou que haveria uma relação estável de uma cultura em CSCs esfera de longo prazo, dependendo dos parâmetros do modelo e proporção inicial de CCC. Para substanciar o nosso resultado teórico, nós projetamos uma cultura esfera de longo prazo de câncer de mama humano células MCF-7-tronco. Com base nos dados experimentais, utilizando um algoritmo adaptativo de Metropolis-Hastings (M-H) para levar a cabo um de Monte-Carlo (MCMC) simulação extenso de cadeia de Markov, obteve-se os valores dos parâmetros estimados. De acordo com as simulações numéricas baseadas em dados experimentais, verificou-se que a proporção observada de CSCs poderia ser capturado por nosso modelo e que os parâmetros ajustados tinha um significado experimental.

Materiais e Métodos

Modelo Descrição

Vamos e denotam os tamanhos populacionais de CSCs e células cancerosas diferenciados no tempo

na cultura esfera de longo prazo, respectivamente. Uma vez que as células são cultivadas num prato não-aderentes e existem nutrientes suficientes neste ambiente artificial, pode-se supor que as alterações observadas ao longo de um intervalo de tempo curto, por exemplo de comprimento, são proporcionais aos tamanhos da população, isto é, onde as constantes são chamados a taxa de natalidade rede ou taxa intrínseca de crescimento da população, respectivamente. Nós vemos e como sendo uma função suave de. Em seguida, dividir por e passando ao limite dá as seguintes equações diferenciais:

Uma vez que o padrão de crescimento dos CSCs inclui simétrica e assimétrica divisão [13], [14] e porque as células cancerosas diferenciados pode se transformar em CSCs através de certas modalidades , tais como EMT [15], algumas células cancerosas diferenciadas e CSCs irão surgir durante a proliferação de CSCs e células cancerosas diferenciadas, respectivamente. Para simplificar o modelo, definimos o processo de divisão assimétrica que um CSC divide-se em um CSC e uma célula de câncer diferenciado que a CSC divide primeiro simetricamente em duas CSCs e, em seguida, um deles se converte em uma célula de câncer diferenciado. Tomando-se como a taxa de conversão a partir de CSCs para células cancerosas diferenciadas no processo de proliferação CSC e como a taxa de conversão a partir de células cancerosas diferenciadas para os CSCs no processo de proliferação de células cancerosas diferenciadas, que podem utilizar o seguinte modelo matemático para descrever o crescimento interactiva dos CSCs e células cancerosas diferenciadas em uma cultura esferas de longo prazo: (1) onde e e todos os parâmetros são constantes não-negativas

Experimental Procedimento

cultura celular

cancro da mama humano MCF-7 (células de Xangai Cell Bank, Academia chinesa de Ciências) foram cultivadas aderente com meio DMEM (Hyclone), 10% de soro fetal de vitela (Hyclone) e 100 U /ml de penicilina-estreptomicina a solução A. CD44

+ CD24

– /CSCs baixos a partir de células MCF-7 foram obtidas por meio de citometria de fluxo e classificação foram inoculados com 1000 células /mL num sistema de cultura de células estaminais para formar mammospheres como descrito anteriormente [8]. Em pratos não aderentes, CSCs foram cultivadas em suspensão utilizando meio DMEM-F12 isento de soro (1:01, Hyclone), suplementado com 20 ng /ml de EGF (BD Biosciences), 20 ng /ml de bFGF (BD Biosciences), 4 mg /ml B27 (Invitrogen) e penicilina-estreptomicina 100 U /ml de solução A. Os mammospheres foram dissociadas a cada 10-12 dias por digestão enzimática com 0,25% de solução de tripsina-EDTA (Invitrogen) a 37 ° C durante 3 minutos e a dispersão mecânica. células individuais foram liberados por pipetagem suave e filtrada através de um filtro de células 70 ^ m. A suspensão de células foi centrifugado a 500 g durante 3 min. Após sobrenadante rejeitado, as células isoladas foram inoculadas com 1000 células /ml e cultivadas para formar mammospheres nas condições acima mencionadas.

citometria de fluxo.

triagem de citometria de fluxo e ensaios foram realizados utilizando BD FACS II FACSAria classificador (BD Biosciences) para escolher CD44

+ CD24

– /baixa CSCs de células MCF-7 aderentes e detectar o CD44

+ CD24

– /baixa relação CSC em mammospheres. As células aderentes ou mammospheres foram dissociadas enzimaticamente e mecanicamente, tal como acima mencionado e filtrou-se através de um peneiro de 40 um a fazer a suspensão de célula única. Em seguida, pelo menos 1 x 10

5 células foram centrifugadas a 500 g durante 3 min a 4 ° C, ressuspenso em 10 ul de conjugado com PE anti-CD44 (BD Biosciences) e 10 uL de FITC-conjugado anti-CD24 (BD Biosciences) e depois incubou-se a 4 ° C no escuro durante 30 minutos. Enquanto isso, as células foram incubadas, respectivamente, com isotipo de CD44 e CD24, como controlo negativo, e conjugado com PE anti-CD44 conjugado com FITC ou anti-CD24 como controlo positivo única, respectivamente. As células marcadas foram lavadas 3 vezes e, em seguida, analisados ​​pelo classificador de SCAF. Cada análise detectou 10.000 células.

Resultados

análise teórica do Modelo (1)

Em matemática, a transformada de Laplace é um operador linear de uma função com um argumento real ( ), e que pode transformar para uma função com um argumento complexa, que é definida como. A transformada inversa de Laplace é dada pelo complexo integrante, em que é um número real, de modo que o percurso do contorno de integração é na região de convergência de. Uma vez que a transformada de Laplace tem a propriedade útil que muitos relacionamentos e operações durante o originais correspondem a relações mais simples e operações durante as imagens, pode ser utilizado para resolver equações diferenciais e integrais. Deixei . A transformada de Laplace de equações diferenciais (1) (2) A partir dessas equações (2) depois de alguns cálculos, nós obtainwhere são as raízes reais da equação quadrática de uma variável.

Tomar o inverso transforma de ligações para (3) que são as soluções para o modelo (1).

Note que e. Podemos obtainwhich significa que a percentagem de CSCs em cultura uma esfera de longo prazo tendem a ter um tamanho estável. Nota thatUsing (3), temos (4) e (5) Devido (4) é mais simples do que, vamos usar (4) para estimar os parâmetros do modelo.

Vale a pena notar que podemos obter o estado estacionário de rácio por um método álgebra simples. No entanto, utilizando o método de álgebra, não podemos derivar os parâmetros do modelo explícitas ao nosso conhecimento (ver Apêndice S1). Assim, nós ainda usamos transformação Laplace aqui para fazer todo o papel parecem mais concordantes.

Resultados experimentais

O rácio CSC em MCF-7 células de câncer de mama foi de 1,8% (Figura 1A), que é consistente com o relatório anterior [16]. Depois de triagem de citometria de fluxo, uma análise post-tipo foi efectuada para determinar a pureza das populações de células classificadas. De alta pureza CD44

+ CD24

– /baixa CSCs cuja relação foi tão alta como 96,2% foram obtidos (Figura 1B). CD44

+ CD24

– /CSCs baixos de células MCF-7 ou células individuais a partir de mammospheres formadas esferas compactas dentro de 10-12 dias em cultura em suspensão sem soro. No entanto, juntamente com a esfera de processamento de cultura de longo prazo, as proporções observadas na CSC mammospheres apresentados como diminuiu gradualmente deriva (Figura 1B-G e Tabela 1) e, finalmente, estabilizado a cerca de 1,5%.

(A) A CSC proporção em células MCF-7 cultivadas com soro. (B) A pureza das populações CSC ordenadas detectado após a triagem de citometria de fluxo imediatamente. (C-G) A relação CSC em mammospheres cultivadas por 52, 84, 117, 150 e 160 dias, respectivamente.

Estimativas baseadas em modelo

Para calcular o percentagem de CSCs (Tabela 1), determinou-se primeiro a proporção de células cancerosas para os CSCs diferenciadas (Tabela 1). Para estimar e, empregamos um algoritmo adaptativo Metropolis-Hastings (MH) para realizar uma simulação extensa cadeia de Markov Monte-Carlo (MCMC) (Figura 2) descrito anteriormente [17], [18] e obtidos os valores estáveis ​​para 4 parâmetros (,,,). Assim, podemos concluir que as taxas de crescimento intrínsecas dos CSCs e células cancerosas diferenciadas e, respectivamente, e as taxas de conversão de CSCs para células cancerosas diferenciados e de diferenciadas células cancerosas para CSCs são e, respectivamente.

( A) série aleatória; (B) histograma. O algoritmo correu para 10.000 iterações com um burn-in de 3.000 iterações. As condições iniciais foram

e

.

Usando os valores estimados, nós traçamos a solução que melhor se ajusta por ajuste aos dados experimentais (Figura 3A). Além disso, plotamos a tendência a longo prazo de, o que mostrou que a proporção de células cancerosas diferenciadas para os CSCs irá estabilizar em cerca de 71 depois de 200 dias (Figura 3B). Isto significa que a percentagem de CSCs tenderá a ser de 1,4%.

(A) O melhor ajuste das para os dados experimentais. (B) A tendência de longo prazo de.

Análise de Sensibilidade

Foram utilizados coeficientes de sensibilidade locais (LSC) para medir a sensibilidade dos parâmetros, incluindo, e. Como relatado anteriormente [19], [20], sabemos que o LSC é definido como o grau de variação em função da concepção no âmbito pequenas alterações de cada variável de criação, o que pode ser calculado pela fórmula: (6) Uma vez que cada parâmetro tem diferentes dimensões , para comparar os coeficientes de sensibilidade de cada parâmetro, que padronizar (6) aswhere é o intervalo de variação do parâmetro.

Tomando a soma dos quadrados dos desvios (SSD) como função da concepção e aumentando ou diminuindo 1% , 2%, 3%, 4% e 5% de cada parâmetro, obteve-se o correspondente LSCs. Como não havia um LSC após cada alteração do parâmetro, havia dez LSC para cada parâmetro. Por conseguinte, a média e o desvio padrão de LSCs foram calculados para cada parâmetro (Figura 4). One-way ANOVA foi utilizada para comparar as diferenças, e teste de T2 de Tamhane foi utilizado para comparações múltiplas, devido à variância desigual. Sabemos que os meios de (716.5037 ± 528.0119) e (925.3620 ± 688.3240) são significativamente maiores do que as de (± 73,4361 4,8421) e (75,3665 ± 13,7670). Porque um coeficiente de sensibilidade maior corresponde a um grau mais elevado de sensibilidade, pode-se concluir que e, as taxas de crescimento intrínsecas das CSCs e células cancerosas diferenciadas, respectivamente, são os parâmetros importantes para a percentagem estável de CSCs numa cultura esfera de longo prazo.

Discussão

Embora os pesquisadores geralmente ganham CSCs de alta pureza por meio de citometria de fluxo triagem e expandi-los no curto prazo pela cultura esfera em um ambiente não-aderentes sem soro [21], o crescimento de padrões de células cancerosas CSCs e diferenciadas em cultura esfera de longo prazo nesta condição não é clara. Se podemos obter abundantes CSCs de alta pureza através deste método também é incerto. Neste projecto, proposto pela primeira vez um modelo matemático para derivar a variação contínua do rácio da CSC na cultura esfera de longo prazo. Para estimar os parâmetros do modelo, nós então projetamos uma cultura esfera de longo prazo de células MCF-7-tronco de câncer de mama, desde linha de células MCF-7 seguiu o modelo CSC e seu marcador CSC, CD44

+ CD24

– /baixo, foi geralmente confirmada e facilmente detectada por citometria de fluxo [7] – [8], [22]. A partir dos resultados experimentais e simulações numéricas, verificou-se que a proporção de CSCs em cultura esfera longo prazo apresentados como diminuiu gradualmente deriva e pode ser estável a um nível inferior. Além disso, no contexto dos dados do modelo e da experiência, descobrimos que os parâmetros do modelo embutidos poderia explicar o principal processo de crescimento dos CSCs e células cancerosas diferenciadas em cultura esfera.

A partir dos parâmetros ajustados no nosso modelo, primeiro notado que a taxa de crescimento intrínseca das células cancerosas diferenciadas é maior do que a taxa de crescimento intrínseco de CSCs, o que significa que, embora cultivadas num ambiente não aderente sem soro as células cancerosas diferenciadas também irão proliferar e a sua velocidade de crescimento é ligeiramente mais rápida do que a de CCC. No entanto, a diferença entre as taxas de proliferação quando cultivadas nestas condições é muito menor do que em cultura aderente. Esta é a principal causa do índice constantemente decrescente de CCC. Enquanto isso, este resultado e o aumento progressivo na proporção de células cancerosas diferenciadas também pode explicar porque a actividade proliferativa de esferas aumenta em fases muito repicagem atraso em relação às passagens anteriores [23]. Enquanto isso, a taxa de crescimento intrínseco de CSCs,, é aproximadamente 20 vezes maior do que a taxa de conversão a partir de CSCs para células cancerosas diferenciados, o que indica que nesta condição de cultura padrão proliferação principal de CSCs é divisão simétrica em vez de divisão assimétrica ou diferenciação num meio de cultura com soro aderente [8] – [10], [23]. Este resultado leva a uma maior proporção de CSCs por um longo tempo comparativa nesta cultura. Além disso, porque a taxa de conversão das CSCs às células cancerosas diferenciadas,, é quase 10 vezes maior do que a taxa de conversão das células cancerosas diferenciadas para os CSCs,, isto significa que a divisão assimétrica de CSCs é maior do que a transformação de células cancerosas diferenciadas para CSCs nesta condição cultura, que também suporta o baixo percentual de CSCs na cultura esfera de longo prazo. Além disso, embora a taxa de conversão das células cancerosas diferenciadas para os CSCs,, é pequena, a sua existência indica que nesta cultura células cancerosas condição diferenciada ainda pode espontaneamente converter em CSCs, o que é consistente com os resultados experimentais anteriores [24], e pode ser uma razão importante por que a cultura esfera pode enriquecer CSCs [8].

a nossa investigação, incluindo os dados experimentais e a análise teórica do modelo matemático, descobrimos que, embora CSCs foram apenas cultivadas em um ambiente não-aderentes sem soro , houve um desvio do estado CSC em direção a um estado de equilíbrio aparente em que houve menos CSCs do que na semeadura. Este resultado pode ser uma evidência de heterogeneidade não-genéticas nos tumores, porque não houve alteração artificialmente genética em todo o processo de cultura [25]. Para ganhar abundantes CSCs de alta pureza por cultura esfera com base na expressão de uma relação de limitação das células cancerosas diferenciadas e CSCs em (5), sugerimos as seguintes medidas reguladoras: a obtenção de uma maior proporção inicial de CSCs, inibindo a diferenciação ou divisão assimétrica de CSCs e promover a conversão de células cancerosas para os CSCs diferenciadas, tais como por cultura com TGF-β para impulsionar EMT [15], [26].

Note-se que a estimativa dos parâmetros neste modelo matemático baseou-se apenas em nossa linha experimental de células de câncer de mama de teste de dados MCF-7 CSCs, que foram cultivadas como mammospheres. Assim, embora o modelo pode ser aplicável para prever a variação contínua do rácio de CSC em quase todo o tipo de tumor sólido a CSC cultura esfera, os parâmetros podem não ser aplicado extensivamente por causa das várias características diferentes de tumores. Enquanto isso, esta pesquisa que acabamos de discutir o processo de cultura de CSCs de alta pureza como esferas. No entanto, o procedimento para o enriquecimento de CSCs pela cultura esferas pode ser diferente. Num outro processo, uma grande quantidade de células cancerosas diferenciadas iria sofrer apoptose nas fases iniciais devido à desadaptação condição de cultura em suspensão. No entanto, no nosso condição, adaptação ao meio de cultura em suspensão pode ser a razão pela qual as células cancerosas diferenciadas aumentar gradualmente [22]. Portanto, os parâmetros que descrevem o processo de enriquecimento CSCs também seria distinta em comparação a este papel. Além disso, embora o nosso modelo simplificado foi válida para capturar o padrão de crescimento e de transição da cultura CSCs (ie, revelando o mecanismo da heterogeneidade estrutural das células cancerosas), sistema dinâmico mais complicado (por exemplo, taxas número de células /crescimento dependente da densidade e de conversão) pode ser viável para adaptar estas últimas descobertas da CSCs [24], [27] – [28]. Nós gostaríamos de estudar esses parâmetros e modelos alternativos futher em trabalhos futuros.

Informações de Apoio

Apêndice S1.

Demonstrações do método de álgebra para calcular o steady-stete da relação.

doi: 10.1371 /journal.pone.0025518.s001

(DOC)

Reconhecimentos

Estamos muito gratos a dois pareceristas anônimos e o editor acadêmico para leitura cuidadosa e valiosa comentários que levaram à melhoria do nosso manuscrito original. Os autores gostariam de agradecer Zhao Bin (professor associado, Inglês editor do Jornal Chinês de doença de mama), Yu Shicang e Bin Wang (MD, do Instituto de Patologia, Hospital Southwest, Terceira Universidade Médica Militar, PR China) para a leitura crítica da manuscrito e gentilmente dando conselhos valiosos.