Abstract

invasão celular Câncer é o primeiro passo crítico de metástase, contudo, pouco se sabe sobre como as células cancerosas invadir e iniciar metástase em uma matriz extracelular complexo. Usando uma linha de células de metástases ósseas do cancro da próstata (PC3), analisou-se como células de cancro da próstata migram em Matrigel 3D fisiologicamente relevante. Descobrimos que as células PC3 migrou mais eficientemente como clusters multi-celulares do que as células individuais isoladas, sugerindo que a presença de adesão célula-célula melhora a migração celular 3D. Perturbação da função N-caderina através de transfecção, quer do domínio citoplasmático N-caderina ou shRNA específico para N-caderina aboliu a migração celular colectiva. Interessantemente, as células PC3 não expressam α-catenina, uma proteína de ligação no complexo caderina actina. Quando a full-length α-catenina foi re-introduzido, o fenótipo das células PC3 revertido para um fenótipo mais epitelial com uma taxa de migração de células diminuiu em 3D de Matrigel. Curiosamente, verificou-se que a metade do terminal N de α-catenina foi suficiente para suprimir o fenótipo invasivo. Tomados em conjunto, estes dados sugerem que a formação de junções de N-caderina promove a migração de células 3D de células de cancro da próstata, e este é, em parte, devido a uma regulação aberrante do complexo de N-caderina na ausência de α-catenina.

Citation: Cui Y, Yamada S (2013) N-caderina Dependente celular Collective invasão das células do cancro da próstata é regulado pela N-terminal da α-catenina. PLoS ONE 8 (1): e55069. doi: 10.1371 /journal.pone.0055069

editor: Chih-Hsin Tang, China Medical University, Taiwan

Recebido: 12 de outubro de 2012; Aceito: 24 de dezembro de 2012; Publicação: 24 de janeiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Cui, Yamada. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por uma concessão Beckman Young Investigator, o Prêmio New Faculdade Hellman Família, um NIH EUREKA GM094798, e os fundos da Universidade do Comité de Coordenação de Pesquisa do Câncer da Califórnia. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

invasão celular câncer é o primeiro passo crítico de metástase ea transição fenotípica do tumor benigno para câncer invasivo exige mudanças no perfil de expressão gênica. Para cancros derivados de epiteliais, esta transição epitelial-mesenquimal-a é iniciada por factores de transcrição que regulam para baixo-supressores tumorais e regulam-se-oncogenes, e é pensado para regular a metástase do cancro [1]. Os principais marcadores epiteliais e mesenquimais que definem os respectivos fenótipos são epiteliais (E) e neuronal (N) cadherins, e este interruptor caderina muitas vezes coincide com a transição do benigno para cânceres agressivos [2].

Em vários câncer as células, a expressão anormal de N-caderina se correlaciona com a indução de motilidade celular. Por exemplo, a expressão de N-caderina induz a migração celular em células de cancro da mama [3] – [7], o melanoma [8], o cancro da próstata [9], o cancro gástrico [10] e carcinoma escamoso [11]. Curiosamente, a sobre-expressão de N-caderina aumenta a motilidade celular e invasão sem diminuir os níveis de E-caderina [4], sugerindo que o aumento da motilidade celular é devida à expressão de N-caderina, em vez de uma ausência de E-caderina. Portanto, a regulação apertada da expressão de N-caderina é essencial para a função das células epiteliais normais. Consistente com esta noção, a regulação de N-caderina por microARN-145 foi mostrada para suprimir a invasão e metástase em cancro gástrico [10].

Enquanto a função canónica de N-caderina é estabelecer célula-célula adesão, na presença de N-caderina também induz a sinalização pró-migratório. O domínio extracelular de N-caderina interage com o receptor de FGF-1 [12], e esta interacção minimiza a internalização do receptor, prolongando assim a activação de MAPK-ERK [5], [6]. Além disso, a migração celular, induzida por N-caderina é dependente do nível de Akt3 reduzida e a activação em células de cancro da mama [7]. Em contraste, o papel da adesão célula-célula de N-caderina-mediada na migração das células do cancro não é clara. Se junções N-caderina funcionar de forma semelhante para junções de E-caderina através da estabilização de interacções célula-célula e impedir a migração de células (inibição de contacto), então junções N-caderina iria dificultar a migração de células de cancro. Portanto, tais junções celulares seria contra-produtivo para N-caderina induzida sinais pró-migratórias.

Usando linhas celulares de cancro da próstata como um sistema modelo, procurou-se analisar como N-caderina regula invasão da célula cancerosa. No cancro da próstata, a expressão de N-caderina é regulado para cima e expressão de E-caderina é regulado negativamente [13], [14]. Um interruptor de caderina semelhante também está associada com recorrência clínica [15], e foi identificado nas lesões metastáticas [16]. Além disso, os níveis de N-caderina aumentada em tumores resistente à castração, em pacientes com metástases estabelecidas [17]. Além disso, foram observados níveis elevados de N-caderina em tumores da próstata de alto grau em comparação com tumores de grau baixo [18]. O tratamento com um composto N-caderina específico do anticorpo monoclonal reduziu a proliferação, a adesão e a invasão de células cancerígenas da próstata in

in vitro

, e retardou o crescimento de vários xenoenxertos estabelecidos, bloqueou a invasão local e metástases e, em doses mais elevadas, levou para completar regressão [9]. Tomados em conjunto, estes estudos sublinham a relação entre a expressão de N-caderina e progressão do cancro da próstata, no entanto, o papel específico de junções de N-caderina durante a invasão de células do cancro é desconhecida.

Estudos anteriores voltadas para a migração de células de cancro numa bidimensional (2D) de substrato, enquanto que pouco é conhecido sobre como células de cancro da próstata migram em uma matriz mais fisiologicamente relevante tridimensional (3D). Utilizando microscopia de lapso de tempo, verificou-se que em 3D Matrigel, cancro da próstata (PC3) células migram em aglomerados multicelulares, e esta migração celular colectiva de células PC3 é melhorada na presença de adesão célula-célula. células de cancro da próstata que sobre-expressam o N-caderina células domínio citoplasmático ou N-caderina knockdown não migram numa matriz 3D. Além disso, como as células PC3 falta endógena α-catenina, re-expressão de α-catenina promoveu um fenótipo epitelial numa matriz 3D. Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que junções N-caderina promover a migração celular coletiva 3D de células de câncer de próstata em parte devido à ausência de α-catenin.

Resultados

migração celular Collective é um exclusivo propriedade de células PC3 em 3D matriz

ao contrário das lamelas 2D rígidas frequentemente usados ​​para estudar a migração de células cancerosas, 3D Matrigel fornece uma matriz macia que melhor imita o microambiente do tumor. Nós comparamos o fenótipo migratório de linhas celulares de cancro da próstata (PC3, 22Rv1, LNCaP, RWPE-1 e RWPE-2) na matriz 3D. Apenas as células PC3 invadiu a matriz em torno de forma eficiente, enquanto as células 22Rv1, LNCaP, RWPE-1 e RWPE-2 permaneceu rodada e formaram grupos de células esféricas sem extensões de membrana óbvias (Figura 1A). Curiosamente, na matriz 3D, as células PC3 migrado apenas quando em contacto com as células vizinhas (Figura 1A, pontas de seta brancas apontam para células não migratórias individuais). Além disso, as células PC3 foram altamente migratório na superfície de lamelas revestidas com Matrigel (Figura 1B, Filme S1), no entanto, as células não manter os contactos célula-célula na superfície da 2D e células que migram passados ​​uns aos outros sem formação de cell- estável adesões celulares (Figura 1B).

(A) Morfologia de linhas celulares de cancro da próstata em 3D Matrigel. células PC3 formar aglomerado invasiva multi-celular, mas 22Rv1, as células LNCaP, RWPE-1 e RWPE-2 formar esferóides multicelulares e não são invasivos. As setas indicam células PC3 individuais, não-migratórios. O painel direito mostra imunoblots para N-caderina (NCAD), a E-caderina (Ecad), α-catenina (α-gato) e tubulina (cuba) de linhas de células de cancro da próstata. (B) A migração celular na superfície 2D. estrela vermelha e seta preta marcar separadamente e controlar duas células vizinhas passando uns aos outros sem formar e manter contato célula-célula. Tempo em minutos. (C) imagens Time-lapse de migração celular coletivo de células PC3 em 3D Matrigel. Tempo em horas. (D) trajetórias Representante (esquerda), velocidade média (meio) e deslocamento end-to-end (direita) de células individuais (n = 33) e clusters multicelulares (N = 43) em 3D Matrigel (** p 0,01 ). (E) A adição de EDTA perturba interacções célula-célula. Adicionou-se EDTA a uma concentração final de 1,4 mM. Tempo em minutos. (F) A imunocoloração para N-caderina nas células PC3 semeadas no Matrigel em 3D. N-caderina (clone 6G11) co-localiza com a actina (faloidina) em contactos célula-célula. A seta indica contato célula-célula. Todas as barras de escala são de 10 mm.

Em 3D Matrigel, aglomerados de células PC3 alongados migraram em uma direção persistente (Figura 1C, D, Filme S2), enquanto as células individuais migraram aleatoriamente com uma velocidade média inferior e deslocamento líquido do que as células individuais dentro de grupos de células (Figura 1D). Estes dados sugerem que a migração de células colectiva de células PC3 são únicos para as células a migração em 3D Matrigel, e a presença de interacções célula-célula podem promover migração celular eficiente (velocidade e persistência de células) em 3D de Matrigel.

As caderinas são potenciais reguladores de colectiva migração celular

Uma vez que muitas proteínas de adesão célula-célula é dependente de cálcio, analisou-se a migração celular colectivo em 3D Matrigel sob baixas condições de cálcio. Após quelantes de cálcio com EDTA, as células PC3 em agregados alongados dissociadas a partir de células vizinhas, ao longo de 30 minutos (Figura 1E, Filme S3). Isto sugere que as proteínas de adesão dependentes de cálcio (por exemplo caderinas) são provavelmente responsável pelas interacções célula-célula PC3. Interessantemente, as células PC3 expressa maior quantidade de N-caderina e E-caderina níveis mais baixos em comparação com as linhas celulares de cancro 22Rv1, LNCaP, RWPE-1 e RWPE-2 próstata (Figura 1A). Além disso, apenas as células PC3 invadido a matriz 3D passo que as outras linhas celulares de cancro da próstata não o fez (Figura 1A). Em 3D Matrigel, N-caderina localizada a contactos célula-célula de células PC3 (Figura 1F), o que sugere que a N-caderina medeia interacções célula-célula em matriz 3D.

A imunomarcação de N-caderina e E revelou que a maioria das células PC3 foram N-caderina positivo (Figura 2A), mas muito poucas células PC3 foram E-caderina positivo (Figura 2A). Curiosamente, observou-se que, enquanto a maioria das células PC3 colectivamente migrado em 3D Matrigel, algumas células permaneciam em agrupamentos de células esféricas. Nós suspeitamos que as células PC3 não migratórias podem estar expressando E-caderina. Para avaliar com precisão a papel de ambos os caderinas na migração de células 3D, as células PC3 foram subclonados para isolar E-caderina expressa células PC3. De vinte e um subclones PC3 gerados, a maioria dos subclones tinha nível superior ou comparável de N-caderina às células parentais (ver Figura S1). Duas sub-clones foram escolhidos (PC3e e PC3n) para a sua expressão caderina característica. PC3e tinha um nível de expressão de E-caderina mais elevada do que tanto o PC3 parentais e PC3n, enquanto PC3n tinha um nível de expressão mais elevada de N-caderina (Figura 2B, C, S1). proteínas E e caderina N localizadas para os contactos célula-célula de clones PC3e e PC3n, respectivamente (Figura 2C). Além disso, a análise da expressão de caderina revelou que o clone parental e PC3n também expressa um elevado nível de caderina 11, ao passo que PC3e expresso principalmente de P e E-caderina (Figura 2E). Em 3D Matrigel, as células PC3e não migrar e permaneceu como aglomerados esféricos (Figura 2D, filme S4). Em contraste, PC3n tinha uma morfologia alongada e migrou numa direcção persistente de modo semelhante às células PC3 parentais (Figura 2D, Filme S5). Estes dados sugerem que os níveis de E /P e N /11-caderinas expressão corresponder com o fenótipo esférico e alongada na matriz 3D, respectivamente.

(A) Imunocoloração de N-caderina com faloidina (painel superior) e e-caderina com phalloidin (painel inferior) das células PC3 parentais semeadas em lamelas. (B) Dois subclones representativos de células PC3 parentais, PC3e e PC3n, foram imunotransferidas para E-caderina e N-caderina. A tubulina é mostrado como um controlo de carga. As manchas originais são mostradas na Figura Suplementar S1. (C) imuno-coloração de subclones PC3 para E-caderina e N-caderina (clone 32). (D) morfologias celulares, células de velocidade direccional e persistência de PC3e (N = 19) e PC3n (n = 20) clones em 3D Matrigel (**, P 0,01; n = 11-42). Todas as barras de escala são 20 uM. (E) mapa de calor da análise de microarray para todos os níveis de expressão da caderina em PC3 parental, as células PC3e e PC3n.

A expressão do domínio citoplasmático N-caderina abole a migração de células coletiva

Para analisar o papel de N-caderina na migração de células colectivo, que transfectadas N-caderina domínio citoplasmático (N-cito), e subclonado nos transfectantes estáveis ​​com níveis crescentes de N-cito (Figura 3A). Na presença de N-cito, endógena a expressão de N-caderina foi regulada para baixo, enquanto endógena E-caderina foi regulado para cima (Figura 3B). Microarray Analysis confirmada a diminuição da N-caderina e aumentou o perfil de expressão de E-caderina nas células cito-N (Figura 3C), e revelou ainda a sobre-regulação de P-caderina (Figura 3C). Ambos E e P-caderina foram também sobre-regulada no clone PC3e não migratório (Figura 2E). Tomados em conjunto, estes dados demonstram que a sub-regulação dos resultados N-caderina na sobre-regulação de ambos E e P-caderinas em células PC3. Curiosamente, a caderina 11 era regulada para baixo em uma das células cito-N expressando (# 1), mas não noutros (# 4, Figura 3C).

(A) Representação esquemática de todo o comprimento N -cadherin e o citoplasmático N-caderina (N-cito) constrói. N-caderina domínio citoplasmático é fundido com a membrana domínio de direccionamento da quinase Lyn (preto) na extremidade N-terminal e em tandem dímero-tomate (vermelho) na extremidade C-terminal. (B) Imunotransferência para N-caderina de domínio extracelular (clone 8C11), N-caderina domínio citoplasmático (clone 32), e E-caderina (clone 36) em N-cito subclones que expressam células PC3. # 1, # 2, # 3, # 4 são quatro populações de células cito-N com o aumento dos níveis gradualmente N-cito. (C) análise de mapa de calor microarrays para todos os níveis de caderina em PC3, N-cito # 1 e N-cito # 4 células. (D) imuno-coloração de domínio extracelular de N-caderina (8C11 clone), com faloidina em células PC3 parentais (painel superior) e N-cito 4 # células (painel inferior). localisation N-cito foi detectada pelo sinal Tandem-tomate (painel inferior). Barra de escala 10? m. (E) A análise estatística dos N-cito expressar PC3 migração 3D celular. Velocidade média e uma extremidade à outra distância são mostradas (**, P 0,01; n = 42 para as células parentais e N = 11 para as células cito-N). As barras de erro são o erro padrão da média. Barra de escala, 40 ^ m.

Em vez de uma morfologia frouxamente organizados e elongatged em uma superfície 2D, as células que expressam N-cito tinha apertado contato célula-célula que as células parentais. Imunocoloração para o domínio extracelular de N-caderina detectados baixos níveis de N-caderina endógena que não foram localizados em contactos célula-célula (Figura 3D). Em Matrigel 3D, ambos N-cito # 1 e # 4 células formaram aglomerados esféricos e não eram invasivas (Figura 3E, Filme S6). Embora estes dois clones que expressam N-cito partilhavam o mesmo fenótipo não-invasiva em 3D Matrigel, eles têm diferentes níveis de caderina 11, sugerindo que a expressão de caderina 11 é independente do fenótipo migração celular PC3 e comportamento em 3D de Matrigel.

silenciamento N-caderina abole a migração de células em 3D Matrigel

Para determinar ainda se N-caderina é a principal reguladora da migração celular 3D, nós silenciada de forma estável N-caderina nas células PC3. De três sequências N-caderina específicos shRNA testadas e 44 clones transfectados analisados, dois clones com 50% (KD1) e redução de 99% (KD2) do endógena N-caderina são mostrados. O grupo de controlo com correspondentes sequências mexidos (sCR1, SCR2) apresentaram níveis de N-caderina semelhantes a células PC3 parentais (Figura 4A, B). Residual endógena N-caderina foi observada em células KD1, mas não em células KD2 (Figura 4B). Além disso, o silenciamento de N-caderina não alterou a caderina-E e caderina 11 níveis em células KD1 e KD2 (Figura 4A).

(A) Imunotransferência para N-caderina, E-caderina e N 11 em caderina -cadherin células knockdown e células transfectadas com sequências mexidos. A tubulina é mostrado como um controlo de carga. KD1, KD2 são dois clones knockdown. SCR1, SCR2 são dois clones transfectados com sequências mexidos correspondente. (B) A imunocoloração de N-caderina nas células de controlo (painel superior) e células de knockdown (painel inferior). a formação de agregados (C) de células de knockdown celular e as células de controlo ao longo de 3 horas em suspensão. Na hora 0, 1, 2, 3 em suspensão, o número de agregados de células analisadas foram 144, 101, 133, 62 para células PC3 parentais, 147, 117, 107, 81 para células KD1, 142, 121, 107, 73 para células KD2, 146, 115, 87, 88 para as células de sCR1, 131, 147, 107, 68 para células SCR2, respectivamente. migração (D) de células de 3D analisa parental (n = 17), precipitação shRNA (N = 17 para o sCR1, N = 20 para SCR2) e células de knockdown (N = 37 para KD1, n = 33 para KD2). A análise estatística da velocidade média é mostrado (**, P 0,01). Todas as barras de erro são o erro padrão da média. Todas as barras de escala são 20 uM.

Apesar da diminuição do nível de N-caderina, a célula células knockdown ainda formados agregados semelhantes em tamanho como células PC3 parentais em suspensão (Figura 4C), sugerindo que a presença de outras caderinas, por exemplo, caderina 11, pode ser suficiente para a formação de contacto célula-célula. No entanto, em 3D Matrigel, o parcialmente knockdown células (KD1) alongadas semelhante às células parentais, mas formados grupos de células muito mais solto (Figura 4D). As células (KD2) completa knockdown permaneceu redonda com extensões de membrana mínimos em 3D Matrigel (Figura 4D). Ao contrário das células shRNA transfectadas parentais ou mexidos, estas células não desenvolveram grandes aglomerados de células alongadas (Figura 4D).

Em 3D Matrigel, as duas linhas de células knockdown não migraram tão rápido quanto o dos pais ou mexidos shRNA transfectadas células. Enquanto as células KD1 migrou com uma redução de 50% na velocidade, as células KD2 eram quase imóvel (Figura 4D, Filme S7). Estes dados sugerem que, em 3D Matrigel, N-caderina regula tanto a morfologia e desenvolvimento de agregados celulares alongado, além de migração celular.

A expressão de α-catenina reverte células PC3 ao normal epitelial fenótipo

as caderinas desempenham um papel crítico na formação e manutenção de adesões célula-célula e fortes requerem suporte do citoesqueleto de actina subjacente para manter os contactos célula-célula. Um elemento-chave do complexo caderina, α-catenina, contém um domínio de ligação na extremidade C-terminal da actina. Curiosamente, ao contrário 22Rv1 ou células LNCaP, as células PC3 não expressam α-catenina (Figura 1A, 5A). Para compreender como a expressão α-catenina afecta a migração celular dependente colectiva N-caderina, que transfectadas estavelmente marcadas com GFP α-catenina em células PC3 (Figura 5A, B). As células GFP α-catenina que expressam teve um ligeiro aumento no nível de N-caderina e uma ligeira redução no nível de E-caderina em comparação com as células parentais (Figura 5A). Curiosamente, o α-catenina de células expressando formados contactos célula-célula mais apertadas em grupos de células mais compacta em relação às células parentais, alongadas fracamente organizadas na superfície 2D (Figura 5B). Além disso, a GFP com etiquetas α-catenina localizada a contactos célula-célula (Figura 5B), e co-localizada com N-caderina (Figura 5C).

(A) Imunotransferência para α-catenina, N-caderina e e-caderina em α-catenina expressando células. A tubulina é mostrado como um controlo de carga. LNCaP foi usada como um controlo positivo para α-catenina e E-caderina. (B) Localização dos α-catenina em células PC3 parentais e marcadas com GFP α-catenina expressando células em painéis de fundo. (C) Co-localização de GFP α-catenina com N-caderina. Análise (D) Agregação celular de células parentais e expressando α-catenina em suspensão. Detalhe: pontos de vista de grupos de células ampliada. sinal de GFP é sobreposto imagem brilhante-campo para a α GFP -catenina células que expressam. tamanhos médios de agregação em cada pontos de tempo são mostrados no gráfico de barras. (E) A migração celular análises em 3D Matrigel. canal de GFP de α-catenin GFP células na caixa branca (painel inferior esquerdo) expressando é mostrado no painel inferior direito. A análise estatística da velocidade de migração da célula é mostrada (**, P 0,01; n = 35 para as células parentais, n = 31 para as células que expressam GFP-α-catenina). Todas as barras de escala são 20 mm.

Na suspensão, α-catenina agregados celulares expressando eram comparáveis ​​em tamanho às células PC3 parentais (Figura 5D). No entanto, os contactos célula-célula de α-catenina de células que expressam eram muito mais apertada sem limites célula-célula óbvio do que os agregados de células PC3 parentais mais frouxos (Figura 5D). A compactação de agregados celulares em α-catenina de células expressando sugere que a N-caderina de adesão célula-célula mediada é provavelmente reforçada pela presença de α-catenina.

Apesar da capacidade para formar a adesão célula-célula em suspensão ( Figura 5D), α-catenina células que expressam PC3 não alongar para formar grandes grupos de células em 3D Matrigel como células PC3 parentais fez. Estas células se manteve como células individuais ou pequenos grupos com uma morfologia mais redonda (Figura 5E). Em 3D Matrigel, α-catenin localizada contatos célula-célula de grupos de células pequenas (Figura 5E). Consistente com esta morfologia, células α-catenina não eram móveis em 3D Matrigel (Figura 5E, Filme S8). Estes resultados sugerem que a expressão α-catenina reforçada N-caderina mediada adesão célula-célula e impediu a migração celular em 3D Matrigel, e que a sub-regulação de α-catenina pode ser um passo importante na metástase do cancro da próstata.

construir a parte N-terminal da α-catenina é suficiente para suprimir o fenótipo invasivo

para testar as funções de α-catenina na regulação da adesão célula-célula, que progressivamente truncados α-catenina (Figura 6A) e estavelmente transfectadas células PC3. O terminal C de α-catenina consiste de domínio de ligação inibitória vinculina (AA 509-633) e o domínio de ligação da actina (AA 697-906), o que requer a extremidade curta do terminal C (AA 848-906) para a ligação à actina [ ,,,0],19]. O full-length α-catenina e os mutantes truncados eram comparáveis ​​nos seus níveis de expressão (Figura 6B, S2), e a expressão dos mutantes truncados não alterou o perfil de expressão de caderina (Figura 6B). Enquanto todos os mutantes truncados localizada para os locais de adesão célula-célula (Figura 6C), o mutante truncado células expressando formado aglomerados celulares mais brandas do que a de comprimento completo α-catenina de células sobre uma superfície 2D (Figura 6C) expressar. Curiosamente, os mutantes de truncagem α-catenin 1-509 e α-catenina 1-848 células que expressam formado aglomerados relativamente compactas do que a-catenina 1-670 expressando células em uma superfície 2D (Figura 6C).

(A ) Esquema de full-length α-catenina e seus mutantes truncados C-terminais. tag GFP, a ligação Vinculina (Vin), o seu inibidor (Inibir), F-actina vinculativo (actina) domínios são mostrados. (B) Imunotransferência para α-catenina, N-caderina e E-caderina em várias células α-catenina expressar. A tubulina é mostrado como um controlo de carga. 22Rv1 foi usada como um controlo positivo para α-catenina e E-caderina. As manchas originais são mostradas na Figura S2 complementar. (C) a morfologia celular (painel superior) e localização de α-catenina (painel inferior) em várias células PC3 que expressam α-catenina. Análise (D) Agregação celular de várias células, α-catenina que expressam parentais, e 10 uM de citocalasina D (CD) células tratadas. Detalhe: pontos de vista de grupos de células ampliada. sinal de GFP é sobreposto imagem de campo brilhante sobre as células que expressam GFP α-catenina /truncamento mutantes. Agregação tamanho das células em cada pontos de tempo são mostrados na média ± erro padrão da média; A análise ANOVA combinado com o teste post hoc de Tukey HSD foram usadas entre os grupos no ponto temporal horas 3 (**, P 0,01). (E) a migração celular em 3D analisa Matrigel para parental (n = 35), de comprimento completo α-catenina (N = 31), α-catenina 1-509 (N = 73), α-catenina 1-670 (N = 39), e α-catenina 1-848 (N = 52) células que expressam. A velocidade média e a distância de migração terminal são mostrados como média ± erro padrão da média; foram utilizados análise de variância e teste post hoc Tukey HSD (***, P 0,001). Todas as barras de escala são 20 uM.

Os fenótipos morfológicos sobre uma superfície 2D foram consistentes com os resultados da análise de agregação de células em suspensão. Enquanto as células expressando mutantes truncados formou agregados de células comparável em tamanho com o das células parentais de comprimento completo e α-catenina que expressam, os agregados de células apresentaram fenótipos diferentes (Figura 6D). Semelhante à de comprimento completo α-catenina expressando células, α-catenina 1-509 células expressando formado contacto célula-célula apertado, sem limites da célula evidente (Figura 6D), sugerindo que o terminal N da α-catenina é fundamental para este apertado adesão célula-célula. Isto é consistente com o mutante de α-catenina que falta a extremidade C-terminal essencial para a ligação (1-848) foram também capazes de induzir agregados de células apertados, embora aglomerados mais brandas do que as células de comprimento completo α-catenina que expressam actina (Figura 6D ). Note-se que a organização da actina ainda é essencial para a formação de adesão célula-célula como a formação de agregação de células de tratamento citocalasina eliminado (Figura 6D). Surpreendentemente, no entanto células solta, α-catenina 1-670 células que expressam formado agrega semelhante à das células parentais (Figura 6D).

Uma vez que o mutante α-catenina que falta a extremidade C-terminal essencial para a actina de ligação (1-848) formulários grupos de células relativamente apertados (Figura 6D), a ligação por α-catenin actina direta tem apenas um papel menor na regulação da adesão celular. Além disso, os nossos dados sugerem que, na ausência do domínio de ligação da actina (AA 697-906), o domínio de ligação ao inibidor vinculina suprime a capacidade para formar junções apertadas célula-célula, o que é consistente com a noção de que é necessário vinculina para o reforço da adesão célula-célula [20], [21]. Em apoio a este modelo, um mínimo de recrutamento vinculina foi observada ao longo dos contactos célula-célula de α-catenina 1-670 células que expressam (Figura S3).

Apesar diferentes fenótipos em suspensão, todos mutante truncado células expressando obtido semelhante morfologia epitelial à de comprimento completo α-catenina em células 3D Matrigel (Figura 6E) expressar. As células que expressam mutantes α-catenina permaneceram como células individuais ou pequenos aglomerados formados com extensões mínimas de membrana, e não eram móveis em 3D Matrigel (Figura 6E). Embora estas células que expressam o mutante-catenina ct têm diferentes níveis de adesões célula-célula (Figura 6D), a expressão de N-terminal de uma meia de α-catenina foi suficiente para minimizar a invasão de células em 3D Matrigel, sugerindo que a capacidade de invasão de células é determinado pela as interacções proteína na metade N-terminal de α-catenina (por exemplo, beta-catenina).

Discussão

estudos anteriores demonstraram que a N-caderina induz a sinalização pró-migratória, interagindo directamente com FGF receptores do domio extracelular [5], activa a via de sinalização MAPK /ERK [5], [6], e suprime a Akt3 sinalização [7]. No entanto, o papel da adesão célula-célula de N-caderina-mediada na invasão de células de cancro da próstata não tem sido explorado. Os nossos dados sugerem que a presença de adesão célula-célula de N-caderina-mediada promove a migração de células através do aumento da velocidade eficiente de células em um caminho migratório persistente em 3D de Matrigel.

Esta migração celular colectiva de células PC3 é uma migração única fenótipo única mostrado em uma matriz 3D. Embora as N-caderina localizada de contacto célula-célula de células PC3 plaqueadas sobre uma superfície 2D (Figura 2A, 4B e 3D), estas células não manter os contactos célula-célula estáveis ​​e migrar como células individuais (Figura 1B). Uma vez que a expressão de moléculas de sinalização importantes são diferentes em 2D vs 3D ambiente [22], tais factores podem alterar a adesão célula-célula e do fenótipo da migração. Em alternativa, a diferença de 2D contra adesão célula-célula 3D pode ser o resultado da elasticidade da matriz. Por exemplo, ao contrário de matriz 3D, duas contacto de células que se deslocam numa direcção oposta pode, muitas vezes mecanicamente perturbar adesões célula-célula em uma superfície 2D. Isto é porque o substrato 2D rígida proporciona uma tracção melhor do que a matriz 3D macio. O fenótipo distinto migração na matriz 3D sugere que junções N-caderina pode desempenhar um papel importante na invasão de células de cancro da próstata

In vivo

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Ao contrário de adesões célula-célula mediada por E-caderina que impedem migração de células (inibição de contato, veja 22Rv1, LNCaP e RWPE na Figura 1A), adesões célula-célula N-caderina mediadas promover a migração celular coletiva. Uma característica única da adesão de N-caderina é suprimir saliências aleatórias de membrana de células do seguidor de modo a que apenas as células líder pode estender os bordos de ataque. Esta inibição de contato local mantém polaridade celular com um bordo de ataque distinta para a migração celular; portanto, assegurar a persistência da migração celular coletiva. Caderina-mediada adesão célula-célula foi mostrado para gerar morfologia celular polarizada em células de Xenopus mesendoderm [23] e células epiteliais transformadas numa matriz 3D [24]. junções N-caderina nas células cancerosas epiteliais derivadas fornecer um sinal de polarização essenciais para a migração de células direccional numa matriz 3D.

Curiosamente, caderina 11, uma caderina do tipo II, também é sobre-regulada no clone altamente invasivo de células PC3 (PC3n, Figura 2E), e pode ser responsável pela formação de adesões célula-célula em células deficientes em N-caderina (Figura 4C). Este caderina 11-regulação é pensado para promover interações celulares entre células cancerosas e caderina 11 osteoblastos expressam que é típico da metástase óssea [25] – [27]. Estudos anteriores relataram que a expressão de caderina 11 shRNA diminui a migração de células de células PC3 [26]. No entanto, a presença de caderina 11 por si só não é suficiente para a migração de células 3D. Por exemplo, N-caderina, mas deficiente caderina 11 células que expressam não são migratórios numa matriz 3D (ver Figura 4). Portanto, a expressão de ambos N-caderina caderina e 11 ou as interacções potenciais entre estes dois caderinas distintas podem ser essenciais para a migração de células de cancro da próstata.

O interruptor de caderina-E de N-observada em células PC3 é comumente observado em vários cancros [2]. Muitas vezes, as células cancerosas regular negativamente caderinas normalmente expressas (E-caderina no caso do cancro da próstata), e sobre-regular a caderinas mesenquimais (por exemplo, N-caderina, caderina 11, etc).