Abstract
bocavirus humana é o segundo parvovírus humano autónomo, com potencial patogênico assumido. Outros parvovírus são conhecidos a persistir e ainda integrar-se no genoma do hospedeiro, eventualmente, contribuir para o desenvolvimento de múltiplos passos de cancro. bocavírus humano também persiste numa percentagem desconhecido de pacientes clinicamente assintomáticos, além daqueles com infecção primária. O objetivo do presente estudo foi analisar o papel da bocavirus humana em cancros do pulmão e colorretal. Portanto,,, amostras tumorais arquivados embebidos em parafina fixadas em formalina foram rastreados para a DNA humano bocavirus por PCR, transferência de Southern, e sequenciamento. tecidos positivos foram ainda submetidos a análise de fluorescência de hibridação in situ para detectar especificamente ADN bocavírus humana nas células infectadas. No total, 11 dos (18,3%) de pulmão 60 e 9 dos 44 (20,5%) testaram positivo tumores colo-rectais para ADN bocavírus humano por PCR e foram confirmados por sequenciação e a fluorescência a hibridização in situ. Assim, o ADN bocavírus humana está presente no núcleo das células infectadas, tanto em cópias únicas ou múltiplas, e parece formar concatemeros. A ocorrência de tais estruturas de ADN bocavírus humanos suporta a existência de um mecanismo de replicação σ- ou rolando-hairpin postulado. Além disso, a fluorescência nos padrões de hibridização in situ inspirou a hipótese de que o ADN humano quer bocavírus persiste como cccDNA ou está integrado no genoma do hospedeiro. Esta descoberta sugere que este vírus pode indirectamente contribuir para o desenvolvimento de alguns colorectal e do pulmão, assim como outros vírus de DNA, tais como o vírus da hepatite B humana, ou podem desempenhar um papel activo no cancro através da interacção com o genoma do hospedeiro.
Citation: Schildgen V, Malecki M, Tillmann RL, Brockmann M, Schildgen O (2013) O Bocavírus Humano está associado a alguns cancros do pulmão e colorretal e persiste em tumores sólidos. PLoS ONE 8 (6): e68020. doi: 10.1371 /journal.pone.0068020
editor: Amit Kapoor, da Universidade de Columbia, Estados Unidos da América
Recebido: 08 de fevereiro de 2013; Aceito: 24 de maio de 2013; Publicação: 27 de junho de 2013
Direitos de autor: © 2013 Schildgen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa de investigação irrestrita do Else Kröner-Fresenius Stiftung, Alemanha. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
Desde a sua descoberta em 2005 por Tobias Allander [1], há cada vez mais evidências de que os bocavirus humanos difundidos (HBoV) desempenha um papel importante em infecções do trato respiratório (subtipo 1) e em infecções gastrointestinais (subtipos 2- 4) [2-6]. Além disso, o quarto HBoV é mais comum vírus detectados nas infecções respiratórias [7] e é assumido como sendo o segundo parvovírus que é capaz de infectar seres humanos com o potencial de causar doença clínica. No entanto, o seu papel nas infecções gastrointestinais está em dúvida com base em um estudo novo do Reino Unido [8].
Anteriormente, nossas sequências de DNA do grupo identificado contendo fragmentos do genoma “head-to-tail” ligados por uma recém- trecho de ligação identificados. Após a publicação, a observação de que as sequências “head-to-tail” ocorrer por HBoV subtipo 1 foi confirmada por Kapoor e colegas, que identificaram essas estruturas como DNA epissomal covalentemente fechado circular (CCC) em doentes infectados com HBoV subtipo 3 [9]. Kapoor e colegas, bem como grupos da China [10,11] e os EUA [12], concluiu que estas estruturas podem ser cccDNA genomas virais persistentes nestas células. Esta conclusão apoia a hipótese de que HBoV pode persistir no hospedeiro infectado e pode existir em um estado assintomático, mas produtiva, que por sua vez poderia explicar a percentagem relativamente elevada de pacientes assintomáticos que derramaram o vírus.
Outro exemplo de um vírus de ADN que persiste numa estrutura circular covalentemente fechada e induz danos nos tecidos é o vírus da hepatite B humana (VHB). Em todas as infecções por HBV crónicos, cccDNA está presente nas células do fígado, e esta persistência cccDNA induz inflamação crónica que não afectam a condição do paciente durante um longo tempo, mas lentamente conduz ao fígado-fibrose, cirrose, e, finalmente, o cancro numa percentagem notável de crónica infecções por HBV [13-17].
Tendo em conta que outros parvovírus são capazes de integrar no genoma do hospedeiro [18], eo primeiro conhecido parvovírus humano patogénico, parvovírus B19, está associada a vários tipos de cancro, incluindo linfomas [ ,,,0],19], tumores testiculares [20], papilar e da tiróide anaplásico carcinomas [21,22], e doenças inflamatórias crónicas, como a tireoidite de Hashimoto [23], cardiomiopatia e miocardite [24], parece possível um mecanismo semelhante para patogênese HBoV-associado.
o curso da doença de parentes mais próximos do HBOV, ou seja, parvovírus bovino (BPV) e vírus minutos de canino (MVC, CNMV, também conhecido como CPV-1), os resultados de uma infecção inicial da via aérea, seguido de a infecção do intestino e derramamento subsequente por via intestinal /respiratória [25]. As hipóteses que HBoV podem persistir em qualquer órgão-alvo e que os tecidos afetados experimentar danos a longo prazo deve, portanto, ser testado.
Assim, abordamos a questão de se HBoV, por analogia com o vírus da hepatite B, possa ser detectada em tumores. Considerando-se que a patogénese de infecções HBoV começa nas vias aéreas e termina no tracto gastrointestinal, analisamos o cancro de não pequenas células do pulmão (NSCLC) tumores e tumores colorectais. Ambos são cancros em que o desenvolvimento do tumor é mal compreendida e no qual uma contribuição viral não foi excluída, até agora, [26-29].
Materiais e Métodos
declaração Ética
Todos os procedimentos foram realizados de acordo com a declaração de Helsinki e de acordo com uma votação do Comitê de Ética da Universidade privada de Witten-Herdecke (votar não 73/2012.). Esta votação foi aprovado especificamente para o estudo atual. Devido à natureza retrospectiva e as amostras duplo-cego de pacientes utilizados no estudo, a Comissão de Ética concluiu que não era necessário consentimento informado por escrito. A coorte do estudo consistiu exclusivamente de pacientes adultos.
As amostras dos pacientes
Sessenta, (FFPE) secções de tumor de pulmão embebidos em parafina fixadas em formalina e 44 tumores colorretais foram selecionados aleatoriamente a partir de amostras arquivadas de nossa rotina laboratório de análises clínicas. A idade média dos pacientes foi de 69,21 anos, com uma média de 71 anos. O estudo foi realizado retrospectivamente. Não existem dados clínicos, incluindo a situação da terapêutica, o comportamento de fumar, ou terapia de câncer, foram utilizados porque essa informação não teria tido qualquer influência sobre o resultado do estudo. Como controlos, tecido livre de tumor a partir da região de cada tumor foi analisado para HBoV sempre que disponíveis. Um amostras adicionais de tecidos de 10 tumor-livre, pulmão saudável e colorretais foram analisadas para DNA bocavirus humano. Como controlos adicionais, amostras de 10 vírus do papiloma humano (HPV) tumores cervicais positivos e 10 de HPV tumores cervicais negativos, bem como 10 tumores de mama foram rastreados para a DNA HBoV. Todas as amostras clínicas foram coletadas em 2011 e 2012.
PCR e análises de PCR em tempo real
DNA a partir de amostras de tecido FFPE foi extraído utilizando o kit de tecido Maxwell 16 FFPE (Promega, Mannheim, Alemanha) de acordo com o protocolo do fabricante. PCR e PCR em tempo real foram realizados como previamente descrito [30,31].
Sequenciação
As amostras que testaram positivo por PCR em tempo real para bocavírus humanos foram sujeitas a PCR convencional utilizando os iniciadores HBoV-LC-Ku-1 e HBoV-LC-Ku-2 [30,31]. ADN amplificado por PCR foi carregado num gel de agarose a 1,5% em TAE de tampão e foi extraída antes da sequenciação em gel. extracção em gel foi realizada usando um kit Qiagen Gel Purification (Qiagen, Hilden, Alemanha) seguindo estritamente a bula. Para a sequenciação, os produtos de PCR purificados foram pré-misturado com quer o HBoV-LC-Ku-1 ou o iniciador iniciador HBoV-LC-Ku-2 e enviada para Eurofins MWG (Munique, Alemanha) para o capilar de Sanger de sequenciação. As sequências FASTA obtidos foram submetidos a análises de sequência e de alinhamento utilizando o software Vector NTI 12,0 (Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha). O sequenciamento foi realizado para todos os tumores que testaram positivo para HBoV por PCR (n = 20).
Análises PEIXES
análises de FISH foram realizados essencialmente como descrito para outros biomarcadores comumente testados, como Her2neu e EML4-ALK, como publicado anteriormente [32], com a modificação de que HBoV- e sondas específicas para o GAPDH foram utilizados, este último como um controlo. As sondas foram desenhadas para hibridar perto das duas regiões terminais do genoma HBoV ou a ambas a extremidade 5 ‘e a extremidade 3’ do gene de controlo (GAPDH).
O método de teste foi semelhante ao quebrar-Além abordagem peixe utilizado para a detecção de EML4-ALK. Quando duas sondas se ligam em estreita proximidade um do outro, os sinais vermelhos e verdes estão perto o suficiente para aparecer como um único sinal amarelo. Esta situação poderá ocorrer se os genomas HBoV ocorrer ADN circular fechado covalentemente como, como descritos por Kapoor e colaboradores [9]. Em contraste, os sinais distintos separados por, pelo menos, dois comprimentos de sinal indicam que as sondas são hibridadas em diferentes locais, tal como numa forma linear do genoma bocavírus.
As sondas estão listadas na tabela 1. FISH foi realizada como se segue : tecidos tumorais FFPE, tecidos circundantes livres de tumor e tecidos de controlo foram cortados em fatias de 3 um de espessura e montadas em lâminas. Como controlos, as células HepG2 humanas foram cultivadas em lâminas de câmaras, como descrito anteriormente [33] e transfectados com os plasmídeos Bocavírus humano p5TRHBoV [34] e o plasmídeo PTA-RSV pCR II-TOPO contendo um RSV N sequência parcial do gene) utilizando Lipofectamina (Invitrogen, . Karlsruhe, Alemanha)