Abstract

Recentemente miR-182 tem sido relatada a ser sobre-expresso no cancro da próstata (PC) tecidos, no entanto detalhada análise funcional do miR-182-5p não foi realizado. O objectivo deste estudo foi o de: 1. analisar a função de miR-182-5p no cancro da próstata, 2. avaliar a sua utilidade como um marcador de tumor, 3. identificar genes alvo miR-182-5p em PC, 4. investigar a inibidor potencial para miR-182-5p para ser utilizado no tratamento de PC. Inicialmente verificou-se que a expressão de miR-182-5p foi significativamente mais elevada em tecidos de cancro da próstata e linhas de células em comparação com os tecidos da próstata e células normais. Além disso elevada expressão de miR-182-5p foi associado à sobrevida global mais curto em pacientes de PC. Para estudar o significado funcional de miR-182-5p, nós derrubado miR-182-5p com inibidor de miR-182-5p. Depois de miR-182-5p knock-down, a proliferação de células de câncer de próstata, migração e invasão foram diminuídos. Identificamos

FOXF2

,

RECK

e

MTSS1

como potenciais genes alvo de miR-182-5p usando vários algoritmos que foi confirmado por ensaio luciferase 3’UTR e análise de Western . Knock-down de miR-182-5p também diminuiu significativamente

in vivo

o crescimento do tumor de próstata. Em conclusão, este é o primeiro relatório documentando que a sobre-expressão de miR-182-5p está associada com a progressão do cancro da próstata e, potencialmente, útil como um biomarcador de prognóstico. Também derrubar de miR-182-5p, a fim de aumentar a expressão de genes supressores tumorais

FOXF2

,

RECK

e

MTSS1

pode ser de benefício terapêutico no tratamento do câncer de próstata .

Citation: Hirata H, Ueno K, Shahryari V, Deng G, Tanaka Y, Tabatabai ZL, et al. (2013) MicroRNA-182-5p Promove celular invasão e proliferação por baixo Regulação

FOXF2

,

RECK e MTSS1

Genes no câncer de próstata humano. PLoS ONE 8 (1): e55502. doi: 10.1371 /journal.pone.0055502

editor: Soumitro Pal, do Hospital Infantil de Boston Harvard Medical School, Estados Unidos da América

Recebido: 09 de outubro de 2012; Aceito: 23 de dezembro de 2012; Publicação: 30 de janeiro de 2013

Este é um artigo de acesso livre e gratuito de todos os direitos autorais e pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita. O trabalho é feito disponível sob a dedicação de domínio público da Creative Commons CC0

Financiamento:. Este estudo foi apoiado pelo Centro Nacional de Pesquisa de Recursos dos Institutos Nacionais de Saúde, através Grant Número RO1CA138642, RO1CA130860, RO1CA160079, VA Mérito comentário subvenções, VA programa projeto e Yamada Science Foundation. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

introdução

o câncer de próstata (PC) é uma das neoplasias mais comuns em homens norte-americanos [1]. A etiologia da PC é em grande parte desconhecida, embora vários fatores de risco, tais como etnia, história familiar e idade estão associados com a doença [2]. Além disso, vários componentes alimentares têm sido associados ao risco de PC e prevenção [3], [4]. Como antigénio (PSA) rastreio específico da próstata se espalhou, o número de pacientes curáveis ​​tendeu a aumentar. No entanto, um número significativo de pacientes com metástases linfonodais são identificados durante a prostatectomia radical, tornando o tratamento mais difícil [5].

Recentemente, um número de miRNAs foram identificados e relatados para ser importante em vários tipos de câncer [6] . MicroRNAs (miRNAs) são pequenos RNAs não-codificantes cerca de 22 nucleótidos de comprimento, que são capazes de regular a expressão do gene em ambos os níveis de transcrição e de tradução [7]. MiRNAs ligar-se a região 3 ‘não traduzida (UTR) do ARNm alvo e reprime a tradução de ARNm de proteínas ou induzir a clivagem de mRNA, regulando desse modo a expressão de genes alvo, tais como supressor de tumores ou oncogenes [8], [9]. Recentemente miR-182 tem sido relatada a ser sobre-expresso no cancro da próstata [10]. Contudo, a análise funcional de miR-182-5p não tiver sido efectuada no cancro da próstata. Portanto, a hipótese de que o miR-182-5p pode funcionar como um oncogene e ser um novo biomarcador molecular no cancro da próstata. Para testar esta hipótese, foi inicialmente encontrado que a expressão de miR-182-5p foi significativamente mais elevada em tecidos de cancro da próstata em comparação com os tecidos normais da próstata. Além disso, a expressão de miR-182-5p foi significativamente mais elevada em linhas celulares de cancro da próstata (LNCaP, PC-3, DU145), em comparação com células epiteliais de próstata normais (RWPE-1). Para os estudos de análise funcional, miR-182-5p foi derrubado usando um inibidor de miR-182-5p. Nós também utilizamos vários algoritmos de pesquisa para potenciais genes supressores de tumor como alvo de miR-182-5p. 3’UTR de ensaio de luciferase e análises de Western foram realizadas para confirmar a interacção directa entre o miR-182-5p e estes genes alvo. Finalmente, estabeleceu miR-182-5p estável baixo expressar linhas de células e realizou

in vivo

estudos, a fim de observar os efeitos potenciais de supressão do tumor em um modelo de rato nu xenotransplante.

Resultados

182 miARN-expressão é significativamente aumentada em tecidos de cancro da próstata e correlacionado com a sobrevivência global

níveis de expressão de

miR-182-5p em amostras clínicas (52 amostras) foram confirmadas por PCR em tempo real. expressão miR-182-5p é mostrada como a razão de tumor (T) /e expressão normal (N) (razão T /N) em cada amostra emparelhados (Figura 1). Assim, se a razão T /N é superior a 1,0, a expressão de miR-182-5p foi julgada para ser maior em tecidos de cancro da próstata em comparação com que no tecido normal adjacente correspondente. Como mostrado na figura 1-A, em 5 pacientes (9,7%), a relação N /T foi inferior a 1,0, enquanto nas outras 47 pacientes (90,3%), a relação N /T foi mais do que 1,0. Portanto expressão de miR-182-5p foi significativamente mais elevada em tecidos de cancro da próstata em comparação com os tecidos da próstata normais correspondentes. Foram divididos os pacientes com cancro da próstata 52 em duas categorias com base na média T /N (2,27) como se segue: 1) Grupo de expressar alta miR-182-5p (/rácio de miR-182-5p T N mais elevada do que 2,27), dois ) baixo miR-182-5p grupo expressando (razão T miR-182-5p /N inferior a 2,27). Em seguida, investigou a associação de miR-182-5p vários parâmetros clínicos e como mostrado na figura 1-B. Curvas de Kaplan Meier mostrou que a sobrevida global foi significativamente menor no alto miR-182-5p expressar grupo (valor p = 0,0117, teste log-rank) (Figura 1-C).

A. expressão de miR-182-5p relativo [cada tecido do tumor (T) /tecido da próstata normal (N)] com base em resultados de PCR em tempo real, B. Associação entre miR-182-5p parâmetros de expressão e clínico-patológico (idade no momento do diagnóstico, a PT , escore de Gleason, insuficiência PSA ea sobrevida global) em tecidos de câncer de próstata com base em resultados q-PCR. C. Kaplan-Meier parcelas de sobre-tudo sobrevivência após prostatectomia radical.

miRNA-182-5p expressão é aumentada de forma significativa em linhas celulares de cancro da próstata

expressão

MIR-182-5p foi significativamente mais elevada em linhas celulares de cancro da próstata (LNCaP, PC-3 e DU145) em comparação com a linha de células de próstata normal (RWPE-1) (Figura 2A).

. A expressão de miR-182-5p foi significativamente mais elevada em linhas celulares de cancro da próstata em comparação com três uma linha de células de próstata normais, B. Relativa expressão de miR-182-5p (miR-NC ou o miR-182-5p precursor (RWPE-1) células transfectadas 1-RWPE), ensaio de viabilidade de células B. (miR-NC ou o miR-182-5p precursor de células transfectadas RWPE-1), a cicatrização de feridas C. ensaio (miR-NC ou o miR-182-5p precursor transfectadas RWPE-1 células). As barras de erro representam ± D.P.. (Desvio padrão).

Efeito do microRNA-182-5p sobre-expressão na viabilidade celular e migração em uma linha de células de próstata normal,

Para confirmar a função de miR-182- 5p, nós transfectadas precursor de miR-182-5p em uma linha de células de próstata normal (RWPE-1). Às 48 horas após a transfecção de miR-NC ou o precursor de miR-182-5p em células RWPE-1, o nível de expressão de miR-182-5p foi verificada por meio de PCR em tempo real (dobre mudança; 526, Figura 2-B.). Então viabilidade celular (ensaio MTS) e cicatrização de feridas ensaios foram realizados utilizando células RWPE-1 transfectadas transitoriamente com precursor miRNA-182-5p. Observamos um aumento significativo da proliferação celular (Fig. 2-C) e migração (Fig. 2-D) em miARN-182-5p células transfectadas em comparação com células transfectadas miR-NC.

Efeito de microARN-182- 5p derrubar sobre a viabilidade celular, invasão e migração em linhas celulares PC

Nós utilizadas linhas celulares de cancro dois próstata (PC-3 e DU145) com alta expressão de miR-182-5p para outras experiências desde o miR-182 -5p expressão foi significativamente mais elevada nestas linhas celulares. Às 48 horas após a transfecção de inibidor-NC ou o miR-182-5p inibidor em células PC-3 e DU145, o miR-182-5p knock-down foi verificada por meio de tempo real de RT-PCR (0,003, 0,034, respectivamente) (Fig . 3-A). A viabilidade celular (ensaio MTS), ensaios de migração e invasão foram realizadas (Fig. 3-B, 3-C e 3-D) e observou-se uma diminuição significativa na proliferação celular (Fig. 3-B), invasão (Fig. 3 -C) e migração (Fig. 3-D) em PC-3 e DU-145 células de knockdown miARN-182-5p comparação com inibidor-NC células transfectadas.

Duas linhas celulares de cancro da próstata (PC-3 e DU145) foram transientemente transfectadas com apenas um dos inibidores de miR-182-5p ou controlo de miR-negativos (NC-miR-inibidor). A. Relativa expressão de miR-182-5p (inibidor de miR-NC ou células PC transfectadas inibidor de miR-182-5p), ensaio B. A viabilidade celular (inibidor de miR-NC ou miR 182-5p inibidor de células PC transfectadas), C. ensaio de invasão, D. cicatrização de feridas ensaio (24 horas). As barras de erro representam ± D.P.. (Desvio padrão).

miR-182-5p diretamente regula FOXF2, RECK e MTSS1

Foram identificados três genes supressores de tumor (

FOXF2

,

RECK, MTSS1

) como potenciais genes-alvo para miR-182-5p com base em três algoritmos (miRDB, TargetScan, microRNA.org).

FOXF2 mRNA tem dois locais de ligação potenciais para miR-182-5p no seu UTR 3 ‘(Fig. 4-A). A actividade de luciferase relativa é mostrada como a razão entre a actividade de luciferase de pirilampo e Renilla para cada amostra. Entre os dois locais, a actividade de luciferase relativa foi significativamente diminuída na posição 670 em células precursoras transfectadas miR-182-5p (Fig. 4-B). RECK ARNm tem um potencial local de ligação (posição 812) para miR-182-5p no seu ‘UTR (Fig. 4-A) 3. A actividade de luciferase relativa foi significativamente reduzida quando a construção posição 812 foi usado em células precursoras de miR-182-5p transfectadas (Fig. 4-B). MTSS1 ARNm tem quatro locais de ligação potenciais para miR-182-5p dentro do seu 3 ‘UTR e a actividade de luciferase relativa foi significativamente diminuída na posição 1909 em células transfectadas precursoras miR-182-5p (Fig. 4-B). Com os plasmídeos mutados (mostrados como “M”), não houve diferença significativa na actividade de luciferase entre os controlos e miR-182-5p precursor transfectantes (Fig. 4-B). Desde a expressão da proteína do gene alvo é baixa em PC-3 e DU145, foi realizada a análise ocidental para observar qualquer alteração na expressão de proteínas com inibidor de miR-182-5p. Como mostrado na Figura 4-C, a expressão de proteínas de genes alvo foi significativamente aumentada após a transfecção inibidor de miR-182-5p (Fig. 4-C). Este resultado sugere que os mRNAs FOXF2, RECK e MTSS1 são alvos diretos de miR-182-5p.

A. FOXF2, RECK e MTSS1 3’UTR posição e sequência de miR-182-5p complementar. B. 3’UTR luciferase ensaio (miR-NC e precursor miR-182-5p), barras de erro representam ± D.P.. (desvio padrão). A expressão de proteína C. de FOXF2, RECK, MTSS1, MMP-2 e beta-tubulina na inibidor de miR-NC ou inibidores transfectadas células cancerosas da próstata miR-182-5p (PC-3, DU145).

também confirmamos a expressão da proteína MMP-2 activa uma vez que é um efector a jusante da RECK. Como mostrado na Figura 4-C, a expressão da proteína clivada de MMP-2 (tipo activo) foi significativamente diminuído em miR-182-5p inibidores de células transfectadas.

efeito inibidor de miR-182-5p no crescimento do tumor em um em vivo modelo de ratinho nu

a fim de observar miR-182-5p inibidor efeitos sobre o crescimento do tumor em ratinhos nude, foi utilizado um sistema baseado lentiviral e estabeleceu estável baixo miR-182-5p expressando células PC-3 e controles (Fig. 5-A). Usamos 8 murganhos (4 ratos; estável baixo miR-182-5p, 4 ratos, controle) e observaram que miR-182-5p estável baixo expressar linhas celulares tinham reduzido significativamente o volume do tumor em ratinhos nus em relação aos controles (Fig 5. B). Uma vez que não foi possível detectar tumores em um dos grupos de baixa expressão de miR-182-5p, foi excluído do experimento. Medimos níveis de microRNA em tumores de xenoenxerto (MIR-182-5p-inibidor e o inibidor-NC), e descobriu que a expressão de miR-182-5p foi significativamente menor no miR-182 xenoenxertos de inibidor em comparação com a do inibidor de NF-xenoenxertos (Fig. 5-B). brutas aparência imagens típicas de tumores são mostrados na Fig. 5-C. Como mostrado na Figura 5-D, a expressão de proteínas de genes alvo as três (FOXF2, RECK, MTSS1) foi significativamente superior no miR-182-5p estável expressando baixo tecidos de tumor de xenoenxerto.

. tempo recorde do tamanho do tumor em miR-NC e xenotransplantes inibidores de miR-182-5p. B. expressão de miR-182-5p Relativa no local de injecção das células e colheita dos xenoenxertos. As barras de erro representam ± D.P.. (desvio padrão). Mir-182-5p expressão foi significativamente menor no grupo inibidor de miR-182-5p. C. aspecto macroscópico típico de tumores de ratos nus em grupos inibidor de controlo e miR-182-5p. D. Expressão de FOXF2, proteína RECK e MTSS1 em xenoenxertos tumorais.

Efeito da sobre-expressão de RECK e MTSS1 em células de câncer de próstata (PC-3 e DU 145) função

Para examinar a função de RECK e MTSS1, que sobre-expresso RECK e MTSS1 em células de cancro da próstata que foram confirmados através da medição do mRNA (Fig. 6-a) e os níveis de expressão de proteína (Fig. 6-b). Em seguida, realizamos várias análises funcionais. Como mostrado na Figura 6, a viabilidade celular (Fig. 6-C), invasão (Fig. 6-D) e migração (Fig. 6-E) foram significativamente inibidos em RECK e MTSS1 transfectadas células de cancro da próstata.

ao fim de 24 horas após a transfecção de ambos os pCMV6-vazia, pCMV6-RECK ou pCMV6-MTSS1 em células de cancro da próstata (PC-3 e DU 145), os níveis de expressão de RECK e MTSS1 foram verificados pelo tempo real de RT-PCR (A) e Western análise (B) ensaio C. A viabilidade celular, ensaio D. Invasion, E. ferida ensaio de cura, barras de erro representam ± SD (Desvio padrão).

Efeito da FOXF2 siRNA knockdown na proliferação celular, invasão e migração em células de câncer de próstata

Depois de FOXF2 siRNA knock down (Fig. 7-A), não houve diferença na proliferação celular entre Si-Si e NC-FOXF2 células PC transfectadas (Fig. 7-B). No entanto invasão celular e cicatrização de feridas estavam significativamente aumentados em Si-FOXF2 transfectadas células PC (Fig. 7-C, Fig. 7-D).

. expressão FOXF2 proteína (si-NC ou células PC si-FOXF2 transfectadas). B. ensaio de viabilidade celular (si-NC ou células PC si-FOXF2 transfectadas). C. ensaio de invasão, D. cicatrização de feridas ensaio (8 horas), barras de erro representam ± D.P.. (Desvio padrão).

Discussão

Vários microARNs foram identificados como oncogénica em cancro da próstata com base na sua expressão aumentada em tecidos de cancro da próstata ou linhas celulares de cancro da próstata [10], [ ,,,0],11] – [14]. Análises funcionais foram realizados com alguns destes microARNs oncogénicos. Por exemplo, o miR-21 foi avaliado para promover a invasão e resistência à apoptose em células de cancro da próstata [15], [16] e miR-125b promoveu o crescimento de tumores de xenoenxerto de cancro da próstata, visando os genes pró-apoptóticos [14]. MiR-373 e miR-520c também têm sido relatados para promover a invasão pelo tumor e metástases no cancro da próstata [12].

Um relatório mostrou que o miR-182 é um supressor tumoral em uma linha de células de cancro do pulmão [17 ], enquanto que o miR-182-5p tem sido relatada como sendo um oncogene em vários cancros [18] – [23]. Segura et al relataram que expressão aberrante do miR-promovido 182-5p melanoma metástase [18]. Liu et al descobriram que a sobre-expressão de miR-182-5p aumentou transformação e invasão tumoral

in vitro Comprar e reforçada metástase

in vivo

em células de cancro do ovário [21]. Portanto apenas dois relatórios mostraram que miR-182-5p é um oncogene com base na análise funcional em pacientes com melanoma e câncer de ovário [18], [21].

Semelhante aos nossos resultados, outros dois estudos encontraram miR-182 expressão -5p a ser significativamente maior em tecidos de câncer de próstata em comparação com tecidos da próstata normais [10], [22], no entanto eles não realizar a análise funcional. Em nosso estudo, observamos que a expressão de miR-182-5p foi significativamente maior nos tecidos de cancro da próstata e linhas de células de câncer de próstata em comparação com tecidos da próstata normais e linhas celulares. Curiosamente, descobrimos que a alta expressão de miR-182-5p foi correlacionada com a sobrevivência global mais curto após a prostatectomia radical em pacientes com câncer de próstata. Assim, o nosso próximo objectivo era o de elucidar se funções miR-182-5p como um oncogene no cancro da próstata. Para resolver esta questão, inicialmente transfectadas miR-182-5p em uma linha de células de próstata normal (RWPE-1) e observou que miR-182 aumentou a proliferação celular e acabou capacidade de cura. Também realizamos

in vitro

análises funcionais usando um inibidor de miR-182-5p em células de câncer de próstata. Uma vez que a expressão de miR-182-5p foi mais elevada em todas as três linhas de células de cancro da próstata (LNCaP, PC-3, DU145) em comparação com as células epiteliais normais da próstata, utilizou-se as duas linhas de células que expressam o miR-182-5p mais elevados (PC-3 e DU145) para knockdown funcional analisa. Como esperado, knockdown miR-182-5p decréscimo da proliferação celular, migração e invasão nestas linhas celulares. Como foi previamente relatado que a sobre-expressão de miR-promovido 182-5p metástases de melanoma e foi oncogénica na natureza, os nossos resultados também indicam que o miR-182-5p pode ser um oncogene em linhas celulares de cancro da próstata.

O próximo objectivo foi identificar genes alvo de miR-182-5p desde microARNs exercem os seus efeitos pela regulação da expressão de outros genes alvo. Usamos vários algoritmos (miRDB, microRNA.org, TargetScan) e identificaram três genes alvos potenciais (FOXF2, RECK, MTSS1). Como mostrado com ensaio de luciferase 3’UTR e analisa ocidental, os três genes alvos potenciais (FOXF2, RECK, MTSS1) expressão foi regulamentada pelo miR-182-5p.

Dos três genes-alvo (RECK, MTSS1, FOXF2), RECK sobreexpressão foi relatado para diminuir a invasão de células por MMPs, incluindo inibidores de MMP-2 [24]. a expressão de RECK tem sido relatada a ser regulada negativamente em vários tipos de câncer, incluindo câncer de próstata [24]. Em nosso estudo, observamos que inibidor de miR-182 diminuiu expressão ativa-MMP-2 em linhas celulares de cancro da próstata, bem como up-regulação da proteína RECK. Além disso, investigamos a função RECK em mais de expressá-la em linhas celulares de cancro da próstata (PC-3 e DU 145). Como mostrado, RECK inibiu a migração celular e invasão de células cancerosas da próstata. Rabien et al mostrou que RECK superexpressão diminuiu o potencial invasivo de células DU 145 [25] e os seus resultados são semelhantes aos nossos. Contudo observou-se que RECK inibiu a proliferação celular em duas linhas celulares de cancro da próstata (PC-3 e DU 145), enquanto Rabien et ai encontrado nenhum efeito de RECK sobre a proliferação celular em células DU 145. No entanto RECK tem sido relatado para reduzir a proliferação de células em outros tipos de cancro [26], [27]. Assim, experimentos adicionais são necessários para esclarecer essas diferenças. Até agora miR-21 e miR-222 foram encontrados para direcionar RECK no câncer de próstata e câncer gástrico [28], [29], mas não houve relatos de miR-182-5p e RECK. Contudo, os nossos resultados mostram que o miR-182-5p regula directamente a expressão de RECK em linhas celulares de cancro da próstata.

MTSS1 (metástase de tumor supressor-1), foi inicialmente identificado como um gene supressor de tumor no cancro da bexiga [30]. Recentemente, a função de MTSS1 foi examinada em linhas celulares de cancro da próstata e verificou-se suprimir significativamente a migração celular e proliferação [31]. Além disso o miR-182 tem sido relatado para regular negativamente MTSS1 e promover a metástase de carcinoma hepatocelular [32], um resultado muito semelhante ao nosso.

FOXF2 foi reportado para regular para baixo a MMP-1 e sobre-regular TIMP3, um conhecido inibidor de MMPs [33]. Além disso FOXF2 diminui Wnt5a [34], que actua através da não-canônicos vias de sinalização Wnt para promover a angiogênese e sobrevivência celular. expressão Wnt5a em tecidos de câncer de próstata tem sido correlacionada com altas pontuações Gleason e recidiva do câncer de próstata bioquímica [35]. atividade invasão knockdown e superexpressão de Wnt5a em linhas celulares de cancro da próstata humana reduzida e estimulado, respectivamente, [35]. Além disso Wnt5a induzida a expressão da metaloproteinase-1 (MMP-1) no cancro da próstata [34], [35]. Em nosso estudo, FOXF2 derrubar o aumento da invasão e migração celular em linhas celulares de cancro da próstata. Assim, nossos resultados sugerem que onco-miR-182-5p podem estar envolvidos na regulação destes genes supressores de invasão e metastático. Recentemente miR-301 foi definida como um oncogene e relatou-se para mediar a proliferação através de regulação FOXF2 no cancro da mama [36]. Exceto para miR-301, não há estudos têm mostrado regulação direta de FOXF2 por um miRNA.

Também investigamos o possível uso de inibidor de miR-182-5p como um potencial tratamento PC. Para isso, foi utilizado um

in vivo

ratinho nu modelo de xenoenxerto com estábulo baixo miR-182-5p expressando células cancerosas da próstata para este estudo. O volume de tumor em ratinhos nus foi significativamente diminuído em baixo miR-182-5p expressando células em comparação com células de controlo. Além disso, os níveis de FOXF2, RECK e MTSS1 foram significativamente mais elevados em tecidos de xenoenxerto de baixo miR-182-5p expressando células de cancro da próstata. Estes resultados indicam que knockdown de miR-182-5p aumento da expressão destes genes alvo supressor tumoral

in vitro

e

in vivo

. Desde que se concentraram em três genes-alvo (

RECK

,

MTSS1

e

FOXF2

) e investigou apenas 52 amostras clínicas, serão necessários estudos adicionais para elucidar o papel do miR -182-5p no cancro da próstata e a sua utilização em aplicações clínicas.

em conclusão, este é o primeiro relatório documentando que a sobre-expressão de miR-182-5p está associada com a progressão do cancro da próstata e, potencialmente, útil como um prognóstico biomarcador. Além disso derrubando de miR-182-5p com inibidor pode ser um benefício terapêutico para aumentar a expressão de genes supressores de tumor FOXF2, RECK e MTSS1 em células de câncer de próstata.

Materiais e Métodos

Declaração de Ética

formalina-fixo, amostras de câncer embebidos em parafina (FFPE) da próstata foram obtidas dos Assuntos de Veteranos de São Francisco (VA) Medical Center. consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes eo estudo foi aprovado pelo Comitê de UCSF em Pesquisa com Seres Humanos (Número de aprovação: H9058-35751-01).

Animais

Todos os cuidados com os animais foi de acordo com as diretrizes do San Francisco Veterans Affairs Medical Center e o estudo foi aprovado pelo San Francisco VA IACUC (número de protocolo: 08-003-01). usuários animais tenham concluído programas de treinamento para lidar e trabalhar com camundongos através AALAS (Associação Americana de Ciência Animal Laboratory) antes de experiências com animais. Um total de 8 ratinhos nus (estirpe BALB /c nu /nu; Charles River Laboratories, Inc., Wilmington, MA) foram utilizados e, inicialmente, células de cancro da próstata foram injectados subcutaneamente e o tamanho do tumor foi monitorizado tal como mencionado na página 7. Após o crescimento tumoral , os ratinhos foram sacrificados com uma overdose de isoflurano por inalação. Em seguida, o tecido xenoenxerto foi removido.

Amostras clínicas

Um total de 52 pacientes com câncer de próstata patologicamente confirmada foram incluídos neste estudo (Veterans Affairs Medical Center em San Francisco). As amostras foram obtidas dos pacientes após consentimento informado por escrito. Informações detalhadas paciente é mostrada na Tabela 1.

cultura celular

células epiteliais de próstata normal (RWPE-1; ATCC número CRL-11609), e linhas celulares de cancro da próstata (LNCaP; ATCC número CRL-1740, PC-3; ATCC número CRL-1435-, DU145; número ATCC-HTB-81) foram adquiridos da American Type Culture Collection (Manassas, VA). As linhas celulares de cancro da próstata foram cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com soro fetal de bovino inactivado pelo calor 10%. células RWPE-1 foram cultivadas em queratinócitos-SFM (Gibco /Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). Quando comprado, foram preparados stocks de células permanentes e todas as células foram armazenadas a -80 graus, até utilização. As células foram usadas para experiências no prazo de 6 meses.

O ARN total e a proteína de extracção

ARN (microARN e o ARN total) foi extraído a partir de, (FFPE) do cancro da próstata humano fixado com formalina embebido em parafina ( n = 52) e combinados tecidos adjacentes não-cancerosas normais da próstata (n = 43) ou hiperplasia benigna da próstata (HBP) (n = 9) utilizando um kit de miRNeasy FFPE (Qiagen) após a captura de laser de micro-dissecção com base em um patologista comentários. ARN (microARN e o ARN total), também foi extraído a partir de linhas de células humanas, utilizando um miRNeasy Mini Kit (Qiagen) e extraiu-se a partir de tecidos de xenoenxerto de homogeneizados em 1 ml de reagente TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA), em seguida, purificados com colunas RNeasy (Qiagen). Para digerir o DNA, foi utilizado um kit Qiagen de DNase isenta de RNase. As células foram lisadas com tampão RIPA (Pierce, Brebieres, França) contendo inibidores de protease (Sigma, St. Louis, MO). A proteína foi extraída a partir de tecidos de xenoenxerto utilizando Tissue Proteína Reagente de Extracção (T-PER) (Thermo Scientific, Rockford, IL). quantificação de proteína foi feito usando um kit de ensaio de proteína BCA (Pierce, Brebieres, França).

MicroRNA e inibidor de microRNA transfecção

Anti-miR ™ miRNA inibidor [controle negativo (miR-NC inibidor) ou inibidor de miR-182-5p (inibidor de miR-182-5p), Ambion] foram transientemente transfectados para células cancerosas com siPORT NeoFX Transfecção agente (Ambion) de acordo com as instruções do fabricante. Pré miR-precursores ™ miARN [controlo negativo (miR-NC) ou HSA-miR-182-5p (miR-182-5p), Ambion] foram usados ​​para transfectar células com Lipofectamine 2000 (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante.

a viabilidade celular, invasão celular e cicatrização de feridas ensaio

a viabilidade celular foi medida 3 dias após a transfecção (inibidor de miR-NC /miR-182-5p inibidor transfectante) com MTS (CellTiter 96 Aqueous One Solution celular Ensaio de proliferação, Promega). Os dados são a média ± S.D. de 3 experiências independentes. Os ensaios de invasão celular foram realizadas com o kit de 24 poços de ensaio a invasão de células CytoSelect (BioLab celular, San Diego, CA) de acordo com as instruções do fabricante. As células transfectadas (inibidor de miR-NC /miR-182-5p inibidor transfectante-48 horas) foram re-suspensas em meio de cultura sem FBS e colocado na câmara superior em triplicado. Após 48 horas de incubação a 37 ° C (5% CO2), as células que migram através da membrana foram coradas. Os resultados foram expressos em células invadidas quantificados a OD 560 nm. ensaio de cicatrização de feridas foi realizada com o CytoSelect 24 poços cicatrização de feridas kit de ensaio de acordo com as instruções do fabricante. Para gerar um campo de feridas, as células transfectadas (inibidor de miR-NC ou o miR-182-5p inibidor transfectante-transfecção 48 horas) foram cultivadas até que se formou uma monocamada em torno do inserto. Depois de retirar o inserto, um campo ferida aberta 0,9 milímetros foi gerado e as células foram deixadas migrar a partir de ambos os lados da abertura. o fechamento da ferida foi monitorizado e o encerramento por cento foi medida. [Percentagem taxa de encerramento (%) = Área da superfície de células migradas /total de área de superfície X100)].

quantitativo em tempo real de RT-PCR

quantitativo em tempo real de RT-PCR foi realizada em triplicado com um sistema de detecção de Applied Biosystems Prism 7500 Sequence rápida utilizando TaqMan universal PCR Master mix de acordo com o protocolo do fabricante (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA, EUA). As sondas TaqMan e iniciadores foram adquiridos a Applied Biosystems. RNU48 foi usado como controle endógeno. Os níveis de expressão do RNA foram determinadas usando o 7500 Fast System SDS software versão 1.3.1 (Applied Biosystems).

análise de Western

proteína celular total (15-20 mg) foi utilizado para Western blot . As amostras foram resolvidas em géis de proteína de 4-20% exactos (Pierce, Brebières, França) e transferidas para membranas de PVDF (Amersham Biosciences, Fairfield, CT). As membranas foram imersas em leite desnatado a 0,3% em TBS contendo 0,1% de Tween 20 durante 1 hora e sondadas com anticorpo policlonal primário e anticorpo monoclonal contra FOXF2 (# ab23306, Abcam, Cambridge, MA), RECK (# 3433, Cell Signaling Technology), MTSS1 (# 4385, Cell Signaling Technology), MMP-2 (# 4022, Cell Signaling Technology) e beta-tubulina (# 2128, Cell tecnologia de sinalização) durante a noite a 4 ° C. As manchas foram lavadas em TBS contendo 0,1% de Tween20 e marcado com peroxidase de rábano (HRP) -conjugated (tecnologia de sinalização celular, Beverly, MA) secundário anti-rato ou um anticorpo anti-coelho. As proteínas foram reforçadas por quimioluminescência (Amersham ECL além de sistema de detecção de Western Blotting, Fairfield, CT) para visualização. Os níveis de expressão de proteínas foram expressas em relação aos níveis de beta-tubulina.

construção de plasmídeo e ensaio 3’UTR-luciferase

Foram construídos plasmídeos individuais para cada local de ligação na 3’UTR do mRNA de genes-alvo potenciais com base em informações microRNA.org. Em seguida, confirmou miR-182-5p ligação à 3’UTR do mRNA do gene alvo por ensaio luciferase com precursor miR-182-5p. PmirGLO Dual-Luciferase miARN alvo vector de expressão usado para executar 3’UTR de ensaio de luciferase (Promega, Madison, WI, EUA). As sequências dos iniciadores utilizados para as inserções de plasmídeos são mostrados na Tabela 2. Num volume total de 20 ul, 5 ul de cada um de 100