Abstract
Fundo
Honokiol, um produto natural pequeno peso molecular, tem anteriormente foi relatado para activar a apoptose e inibir a tumorigénese gástrico. Se honokiol inibe a angiogênese e metástase das células cancerosas gástricas permanece desconhecida.
Metodologia /Principais Achados
Foram testados os efeitos de honokiol sobre a atividade angiogênico e disseminação peritoneal usando
in vivo, ex
in vitro
sistemas de ensaio in vivo
e. As respostas de sinalização em células de cancro gástrico humano, células endoteliais vasculares umbilicais humanas (HUVEC), e tumores isolados foram detectados e analisados. Em um modelo de rato tumor gástrico xenotransplante, honokiol inibiu significativamente a disseminação peritoneal detectados pela técnica de PET /CT. Honokiol também efetivamente atenuou a angiogênese detectado pelo ensaio pintainho membrana corioalant�ca, ensaio plugue rato matrigel, ensaio de germinação de aorta célula endotelial anel de rato, e ensaio de formação de tubos de células endoteliais. transdutor de sinal Além disso, honokiol efectivamente melhorada e activador de transcrição desfosforilação (STAT-3) e inibiu a actividade de ligação ao ADN de STAT-3 em células de cancro gástrico humano e células HUVEC, que estava correlacionado com o aumento da regulação da expressão de homologia Src actividade e proteína 2 (SH2) molecular contendo tirosina fosfatase-1 (SHP-1). inibidor de calpaína II e siRNA transfecção inverteu significativamente a actividade de SHP-1 induzida por honokiol. A diminuição da fosforilação de STAT-3 e aumentou SHP-1 expressão também foram demonstrados em tumores metastáticos peritoneais isolados. Honokiol também foi capaz de inibir a geração de VEGF, o que poderia ser revertida por SHP-1 siRNA transfecção.
Conclusões /Significado
Honokiol aumenta a expressão ea atividade da SPH-1 que desativa outra via de STAT3. Estas descobertas também sugerem que honokiol é um novo e potente inibidor da angiogênese e disseminação peritoneal de células cancerosas gástricas, fornecendo suporte para o potencial aplicação de honokiol na terapia do cancro gástrico
Citation:. Liu SH, Wang KB, Lan KH, Lee WJ, Pan HC, Wu SM, et al. (2012) Calpain /SHP-1 Interação por Honokiol Dampening Peritoneal Divulgação de câncer gástrico em
nu /nu
Mice. PLoS ONE 7 (8): e43711. doi: 10.1371 /journal.pone.0043711
editor: Henrik Einwaechter, Klinikum rechts der Isar der TU München, Alemanha |
Recebido: 17 Janeiro, 2012; Aceito: 24 de julho de 2012; Publicação: 24 de agosto de 2012
Direitos de autor: © Liu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por bolsas de investigação a partir de Taichung Veterans general Hospital, Taiwan (TCVGH-997314C, TCVGH-1007313C) e do Conselho Nacional de Ciência de Taiwan (NSC99-2320-B-005-003-MY3). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
A maioria dos pacientes (-60%) com câncer gástrico são diagnosticadas com doença em estágio final. O câncer gástrico é a segunda causa mais comum de mortalidade por câncer global em nações desenvolvidas e exibe doença metastática no momento do diagnóstico [1]. Cirurgia e combinação quimioterapia para o câncer gástrico têm sido mostrados para conferir apenas benefícios modestos de sobrevivência em casos avançados, e quase 50% dos pacientes ainda morrem após o retorno [2], [3]. A principal forma de recorrência é a disseminação peritoneal. o crescimento do cancro e metástases peritoneais são dependentes da angiogénese, um processo que envolve vários factores angiogénicos incluindo o factor de crescimento endotelial vascular (VEGF), factor de crescimento epidérmico (EGF), factor de crescimento de fibroblastos básico, prostaglandina E2, interleucina-8, quimiocina (CXC motivo) ligando 1, e a família de metaloproteinases da matriz [4] – [6]. Vários sinais moleculares, tais como o transdutor de sinal e activador de transcrição-3 (STAT-3), factor nuclear-EB, Akt, proteínas quinases activadas por mitogénio, ciclo-oxigenase-2, lipoxigenase, sintase de óxido nítrico indutível, factor de necrose tumoral e outros , também foram exibidas para serem envolvidos em progressão tumoral e angiogénese [7] – [9]. No entanto, os mecanismos celulares e moleculares do desenvolvimento, progressão e metástase de câncer gástrico ainda devem ser esclarecidas.
A quinase Janus-ativado (Jak) /via de sinalização STAT desempenha um papel importante na regulação da o crescimento celular, angiogénese, diferenciação, migração, e metástase [10]. A activação constitutiva de vias de STAT, particularmente STAT-3, está associada com uma grande variedade de malignidades humanas. Persistente fosforilação de STAT-3 tem sido observado em vários cancros humanos, tais como tumores sólidos, do estômago, do cólon, do fígado, da próstata, da mama, pulmão, cabeça e pescoço e, bem como doenças malignas do sangue [8], [10]. estudo anterior demonstrou que a fosforilação de STAT-3 e expressão da proteína VEGF são aumentados em tecido de cancro gástrico humano, que por sua vez elevar o fenótipo angiogénico e contribuir para o desenvolvimento e progressão do cancro gástrico [11]. Por outro lado, certos fosfatases são conhecidos como sendo supressores tumorais e pode desempenhar um papel importante na inibição ou no controlo do crescimento do cancro [12] – [15]. proteína tirosina fosfatases (PTPs), incluindo SH2 contendo o domínio de tirosina-fosfatase (PCH) -1 e SHP-2, são capazes de regular negativamente a sinalização STAT pela desfosforilação da tirosina de vários componentes nas vias de sinalização relacionados [13] – [15] . A activação contínua de STAT-3 nos tumores pode ser facilitada, pelo menos em parte, pela perda de função destas fosfatases. A calpaína II foi demonstrado desempenhar um papel no retículo endoplasmático (ER) reguladas tumorigénese-stress, que está envolvido no mecanismo de tumorigénese gástrica honokiol inibida [16]. Além disso, também estudo anterior indicou que a SHP-1 é um substrato de calpaína endógena para seguir a activação de plaquetas induzida por A23187 [17]. Portanto, um calpaína /SHP-1-regulada STAT-3 e via de VEGF pode estar envolvido na angiogénese, o crescimento e disseminação de células de cancro peritoneal gástricas.
Honokiol, um produto natural pequeno peso molecular, é um importante composto biphenolic activa de
Magnolia officinalis
, que é conhecido para melhorar infecção microbiana, inflamação e distúrbios gastrointestinais em sistemas medicinais tradicionais asiáticos [18]. O nosso estudo anterior demonstrou que inibe a tumorigénese honokiol gástrico pela activação de 15-lipoxigenase-1 e a consequente inibição de sinais de peroxissoma activados pelo proliferador do receptor-A e da COX-2 dependentes [19]. Honokiol tem sido mostrado induzir ER stress e desencadear a calpaina II mediada por proteína de 94 clivagem regulada por glucose e apoptose em células de cancro gástrico humano [16]. Tem sido demonstrado que a expressão do VEGF poderia ser sensível às condições de privação de nutrientes, que provocam o stress ER [20], [21]. Além disso, o ER tunicamicina estresse activador foi encontrado para prevenir significativamente o desenvolvimento da microvasculatura, sugerindo que este ER o stress indutor pode ter um papel potencial no tratamento de tumores da mama [21]. Os efeitos da honokiol sobre ER angiogênese correlacionado-stress e metástase do tumor gástrico ainda não estão claros. Aqui, a hipótese de que honokiol inibe a angiogênese e disseminação peritoneal de células cancerosas gástricas através de uma PCH-1-regulamentado STAT-3 e VEGF via /calpaína. Os resultados mostraram que honokiol angiogênese marcadamente inibido e disseminação peritoneal de células cancerosas gástricas através de um calpaína /SHP-1 activado-interação STAT-3 desfosforilação e VEGF via infra-regulação.
Resultados
Honokiol bloqueado peritoneal metástase do câncer gástrico
in vivo
Cancro é frequentemente caracterizada pelo aumento da captação de [
18F] fluoro-2-desoxi-D-glicose (FDG), e [
18F] /PET pode servir como uma medida substituta da eficácia terapêutica. foi avaliada a possibilidade funcional de imagens de pequenos animais usando um scanner /CT clínica PET com FDG. Quatro grupos de ratinhos para experiências metástases peritoneais foram investigados. Uma declaração /quadro da situação metástase foi mostrado na Figura 1. Nós utilizamos [
18F]-PET /CT para detectar metástases peritoneais em camundongos inoculados com células humanas de câncer gástrico (MKN45 ou SCM-1) com ou sem tratamento honokiol. Como mostrado na Figura 2, a projecção de intensidade máxima foi gerado a partir de ratinhos representativos típicos. A metástase peritoneal foi marcado nos ratinhos de controlo (painel esquerdo), e foi eficaz na reversão pelo tratamento honokiol (painel da direita). Estas imagens mostraram claramente que não invasiva [
18F] absorções -FDG em tumores metastáticos peritoneal de camundongos de controle eram muito mais elevados do que nos ratos tratados com honokiol. A quantificação da intensidade é mostrado na Figura 3A. A injecção intraperitoneal de honokiol (5 mg /kg, duas vezes /semana) reduziu significativamente as contagens de radioactividade estimados e valores de absorção específicos (SUV) determinados por FDG-PET /CT em ratos inoculados com células cancerígenas gástricos (Fig. 3). Além disso, muitos nódulos metastáticos foram encontradas na cavidade peritoneal (mesentério) dos ratinhos de controlo inoculados com MKN45 e SCM-1 (Fig. 2) células. Em contraste, os nódulos tumorais peritoneais foram observados esporadicamente em murganhos tratados com honokiol. Quantificação de nódulos por campo é mostrado na Figura 3B.
(a) Quatro grupos de ratinhos foram investigados e listados. (B) As condições metastáticas a inoculação de células de câncer pela vigilância PET /CT e mais, em seguida, para o tratamento honokiol. As células cancerosas gástricas humanas (4~5 × 10
6 células) MKN45 (a) e SCM-1 (b) foram inoculados com ratinhos no dia 7.
[
18F ] -PET serviu como uma medida substituta da eficácia terapêutica. Os tumores em ratinhos nus foram estabelecidas durante 7 dias após a inoculação intraperitoneal de células de cancro gástrico (MKN45, A; SCM-1, B). Os ratinhos foram em seguida injectados intraperitonealmente com honokiol (5 mg /kg /duas vezes por semana). Vinte e oito dias após o tratamento honokiol, imagens de FDG-PET /CT de ratinhos foram tomadas, e, em seguida, os ratinhos foram sacrificados para exame macroscópico da distribuição de metástases disseminada. Imagens representativas de FDG-PET /CT de animais inoculados com MKN45 (A-A) ou MCP-1 (B-A) células de cancro gástrico, com ou sem tratamento honokiol (HK) são mostrados. HK (5 mg /kg) foi administrada por injecção intraperitoneal. A projeção de intensidade máxima de ratos típico representante nu (esquerda, controle do tumor, à direita, o tratamento HK) é mostrado. Além disso, muitos nódulos metastáticos foram encontrados no mesentério de ratos de controlo inoculados com MKN45 (a-b) ou células MCP-1 (B-b). Em contraste, a metástase peritoneal foi observado esporadicamente em murganhos tratados com honokiol.
Os ratinhos foram inoculados com células humanas de cancro gástrico (MKN45 e SCM-1). [
18F] -PET imaging /CT foi realizada e analisada. (A) quantificações de radioatividade estimada (Bq /ml, a) e valores de absorção específica (SUV, b) foram calculados. SUV é usado como um índice para determinar se um ponto de acesso é significativa. (B) fotomacrografias de nódulos peritoniais metastáticos são mostrados. Todos os dados são apresentados como média ± EPM (n = 6-8). * P 0,05 em comparação com o controle
Honokiol inibido Angiogenesis
in vivo
,
ex vivo
, e
in vitro
as células endoteliais são críticos para o processo angiogénico, a qual é necessária para o crescimento tumoral e metástases. A seguir, investigou o efeito angiogênico do honokiol usando o ensaio de membrana corioalant�ca pinto (
CAM
ensaio), o ensaio de plugue matrigel, ensaio brotando anel aórtico, e formação de tubos de células endoteliais. Como mostrado na Figura 4A, honokiol inibiu eficazmente a formação de neo-vascular no
CAM
ensaio, sem qualquer efeito visível nos vasos sanguíneos pré-existentes. A análise quantitativa revelou que honokiol causou um decréscimo de 2,5 vezes no número de vasos sanguíneos recentemente formados, em comparação com a de controlo do meio.
(A) ensaio de membrana Corioalantóide (
CAM
ensaio) foi realizada. formação neovascular aprisionado em colágeno tipo I géis com ou sem honokiol (HK, 20 mM) foi examinado o tratamento. Após 24 h de incubação, a área em torno do disco carregado foi fotografado. (B) de Matrigel (0,6 ml) foi implantado subcutaneamente em ratinhos nus com ou sem honokiol (10 ug /ml) ou VEGF (100 ng /ml). O Matrigel injectados rapidamente formado um único tampão de gel sólido. Após 21 dias, os ratinhos foram sacrificados e os tampões de Matrigel foram excisadas. tampões de Matrigel representativos (a) e IHC para coloração CD31 de secções de tampões de Matrigel (B) são mostrados. Quantificações de número de navios (c) e células endoteliais (D), em seções de plug matrigel (contagens /campo) foram calculados. Os números em cada caso são a média de cinco lâminas diferentes e cinco regiões por slide. Todos os dados são apresentados como média ± EPM (n = 8-10). * P 0,05 como comparado com o controlo
No ensaio de tampão de Matrigel, Matrigel contendo VEGF (100 ng /ml de gel) com ou sem honokiol (10 ug /mL) foi implantada subcutaneamente em ratinhos nus. . Após 21 dias de implantação, os tampões de Matrigel formados foram excisados e fotografado. Plugues somente com VEGF foram marcadamente entremeadas, vascular e de cor vermelha. Tomadas contendo VEGF e honokiol foram pálido, indicando nenhuma ou menos formação de vasos sanguíneos (Fig. 4B-a). Também examinou a densidade de vasos e morfologia navio nas seções de plug por H E coloração e coloração imuno-histoquímica com um anticorpo contra CD31, um marcador de células endoteliais. A vascularização no grupo honokiol + VEGF foi significativamente reduzida quando comparada com o grupo de VEGF sozinho (Fig. 4B-b). Quantificação da vascularização por contagem dos vasos e células endoteliais apresentados revelou que a densidade vascular no grupo tratado com honokiol foi significativamente diminuída (4B-C Figs. 4B e-d)
A seguir foram induzidas.
, Células endoteliais a brotar a partir dos anéis de aorta de rato isolada na presença de Matrigel e ECGM (meio de crescimento de células endoteliais) contendo citocinas angiogénicos, tais como VEGF e factor de crescimento de fibroblastos básico. crescimento de células endoteliais extensiva a partir de explantes de anel de aorta de rato foi observado no grupo de controlo (Fig. 5A). Honokiol tratamento resultou numa redução significativa (~five vezes) de crescimento endotelial e brotação de anéis aórticos (Figs. 5a e 5c). Além disso, a diferenciação morfológica de formação do tubo endotelial celular foi investigada usando um método de matrigel bidimensional. Como mostrado na Figura 5B, a sementeira de células HUVEC em Matrigel levou à formação de estruturas do tipo tubo vascular. Honokiol inibiu eficazmente a formação de tubos de células endoteliais através da redução da estrutura de tubo, em comprimento e largura (Fig. 5B e 5D).
(A) Honokiol células endoteliais inibida sprouting num ensaio do anel aórtico. As aortas foram recolhidas de 6 semanas de idade de ratos Sprague-Dawley e cortado em fatias de 1 mm, que foram então colocadas em placas de 12 poços contendo matrigel. Os anéis foram fotografados e analisados. A célula endotelial germinação era abundante nos anéis de aorta de controlo (painéis da esquerda), mas não nos tratados com anéis honokiol (HK; painéis do meio, 40 | iM; painéis direitos, 60 uM). (B) Honokiol suprimiu a formação de tubo endotelial celular. As HUVECs foram semeadas em placas de 96 poços revestidas com matrigel. As células foram tratadas com honokiol (40 e 60? M) durante 12-18 h. As imagens foram capturadas a formação do tubo numa fotomicroscópio invertida, e formações de tubo foram marcados. (C) O grau de microvasos brotando anéis de aorta foi pontuado de 0 (menos positivo) a 4 (mais positivo). (D) Quantificação de formação de tubo HUVEC é mostrado. Todos os dados são apresentados como média ± EPM (n = 8-10). * P 0,05 em comparação com o controle
Honokiol Abolished STAT-3 sinalização em células de câncer gástrico humano, HUVECs e tumores
Estudos anteriores demonstraram uma forte correlação entre STAT activada. -3 e angiogênico fenótipo [11]. Nós elucidado ainda mais o efeito de honokiol na fosforilação de STAT-3 em células de cancro gástrico humano (AGS e MKN45) e HUVECs. Como mostrado na Figura 6, o honokiol reduzida (Tyr705) fosforilação de STAT-3 de um modo dependente do tempo, com uma diminuição de cerca de duas vezes em 1-2 h tirosina em células AGS (Fig. 6A) e um 3 a 10- dobrar a diminuição 0,5-24 h em células MKN45 (Fig. 6B). Surpreendentemente, honokiol induzida STAT-3 desfosforilação de Tyr705, Ser727 mas não, resíduos nestas células gástricas cancerosas humanas. No entanto, honokiol simultaneamente inibida tanto Tyr705 e Ser727 fosforilação de STAT-3 em células HUVEC (Fig. 6C). A análise quantitativa das bandas de proteína na Western blot usando o programa Image-Pro Plus Software é mostrado na Figura 7. Os resultados da análise com o microscópio confocal mostraram também que honokiol aboliu a tirosina (Tyr705) fosforilação de STAT-3 em células AGS e HUVECs (Fig . 8A).
AGS (a) e MKN45 (B) células de cancro gástrico humano quiescentes e células HUVEC (C) foram tratadas com e sem honokiol (HK, 5-40 uM) para os tempos indicados. Os lisados celulares totais foram preparados e analisados por transferência de Western para detecção de STAT-3 fosforilado (PSTAT-3, Tyr705). Os blottings foram sondado com anti-Stat-3 anticorpos para a normalização. Os resultados são representativos de pelo menos cinco experimentos independentes
AGS (a) e MKN45 (B) células cancerosas gástricas humanas quiescentes e HUVECs (C) foram tratados com e sem honokiol (HK, 5-. 40 uM) durante os tempos indicados. Os lisados celulares totais foram preparados e analisados por transferência de Western para detecção de STAT-3 fosforilado (PSTAT-3, Tyr705). Os blottings foram sondado com anti-Stat-3 anticorpos para a normalização. Todos os dados são apresentados como média ± SEM de cinco experiências independentes. * P 0,05 em comparação com o controle
(A) O p-STAT-3 (Tyr705) expressões em células cancerosas gástricas (AGS) e HUVECs tratadas com honokiol (HK, 10 e 20 mM. ) durante 1 h, foram detectados por um microscópio confocal. (B) tumores em ratinhos nus foram estabelecidas durante 7 dias após a inoculação intraperitoneal de células MKN45. Os ratinhos foram em seguida injectados intraperitonealmente com honokiol (5 mg /kg /duas vezes por semana) durante 28 dias. O p-STAT-3 (Tyr705) expressões em tumores metastáticos isoladas a partir de ratinhos com ou sem tratamento HK são mostrados. As expressões da proteína p-STAT-3 (Tyr705), manchado marrom escuro, foram detectados por imuno-histoquímica. Todos os dados são apresentados como média ± SEM de cinco experiências independentes. * P 0,05 como comparado com o controlo
Examinámos ainda mais a fosforilação de STAT-3 em tumores metastáticos peritoneais isolados de ratinhos nus inoculados com células MKN45 com ou sem tratamento honokiol (5 mg /kg).. A análise imuno-histoquímica mostrou que a p-STAT-3 sobre-expressão e acumulação na região do tumor, incluindo núcleos e citoplasma, foi significativamente invertida por tratamento honokiol (Fig. 8B). Na análise de transferência de Western, honokiol diminuiu marcadamente a acumulação de p-STAT3 em tumores, em comparação com o controlo de veículo (Fig. 9A). A expressão constitutiva de STAT3 não foi afectada. Além disso, a actividade de ligação a ADN de STAT-3 foi ainda confirmada usando a EMSA. Tal como mostrado na Figura 9B, o honokiol inibiu marcadamente a um aumento da actividade de ligação ao ADN de STAT-3 em células de cancro gástrico humano. Honokiol também inibiu o aumento de VEGF-STAT-3 actividade de ligação de ADN em células HUVEC (Fig. 9B).
(A) transferência de Western para a detecção de p-STAT-3 (Tyr705) proteínas em tumores metastáticos isolados a partir de murganhos com ou sem honokiol tratamento (HK) é mostrado. (B) EMSA foi realizado para a detecção de STAT-3 ADN actividade em AGS, SCM-1 (painel da esquerda) e células HUVEC (painel da direita) de ligação com ou sem tratamento honokiol. As células foram tratadas com honokiol para vários intervalos de tempo, tal como indicado. VEGF (20 ng /ml) aumentou a actividade de ligação ao ADN de STAT-3 em células HUVEC, e esta melhoria foi revertida por honokiol (10 uM). Todos os dados são apresentados como média ± SEM de cinco experiências independentes. * P . 0,05 em comparação com o controle
Honokiol Induced SHP-1-regulados STAT-3 Desfosforilação em gástrica células cancerosas, células endoteliais, e tumores
SHP-1 é um não transmembranar PTP [12]. A seguir, analisou se honokiol pode regular a expressão e atividade da SHP-1. Como mostrado na Figura 10A, honokiol aumentou a expressão de proteínas de SHP-1, mas não SHP-2, em células HUVEC e AGS de uma forma dependente do tempo. inibidor de PTP farmacológicos e SHP-1 siRNA transfecção aboliu eficazmente o STAT-3 induzida por desfosforilação honokiol em células HUVEC e AGS (Fig. 10B-a). Resultados semelhantes em células SCM-1 e células endoteliais imortalizadas SV-40 de rato (microvasculares SVECs) tratados com honokiol estão apresentados na Figura 10B-b. A seguir, analisou se endógena SHP-1 é modulada por honokiol. Honokiol foi capaz de evocar a actividade SHP-1 em células de cancro gástrico, HUVEC e SVECs de uma forma dependente do tempo (Fig. 11A). Honokiol também aumentou a expressão da proteína SHP-1 em tumores metastáticos peritoneais isolados de ratinhos MKN45-inoculados, conforme revelado por análise imunoistoquímica (Fig. 11B). Foi investigada mais a interacção entre SHP-1 e STAT-3, utilizando os métodos de co-imunoprecipitação e Western blotting. Como mostrado na Figura 11C, SHP-1 estava especificamente associada com o STAT-3 em células AGS e células HUVEC na presença de honokiol em comparação com o controlo de IgG.
As células foram tratadas com honokiol (10 e 20? M) durante vários cursos de tempo, como indicado. níveis de SHP-1 e SHP-proteína 2 (A) foram detectadas por análise Western Blot em células com ou sem tratamento honokiol. (B) A fosforilação de STAT-3 em células de cancro gástrico (AGS e SCM-1) e células endoteliais (HUVECs e SVECs) com ou sem honokiol (10 uM em células HUVEC, SVECs, e SCM-1; 20 uM em AGS) foi detectada tratamento durante 24 h na presença ou ausência de um inibidor de fosfatase (PTP inibidor II, 20 uM) ou SHP-1 siRNA transfecção. Em A, os dados são apresentados como média ± SEM de cinco experiências independentes. * P 0,05 como comparado com o controlo. Em B, os resultados apresentados são representativos de, pelo menos, quatro experiências independentes.
As células foram tratadas com honokiol (HK) para vários intervalos de tempo, tal como indicado. As células (A) foram tratados com honokiol (HUVECs, 20 uM; SVECs, 20 uM; AGS, 20 uM; SCM-1, 40 mM) nos tempos indicados, e, em seguida, as actividades de SHP-1 foram medidos. Os dados são apresentados como média ± EPM (n = 7). * P 0,05 como comparado com o controlo. (B) Imuno-histoquímica para SHP-1 expressão em tumores metastáticos isoladas a partir de ratinhos com ou sem tratamento HK é mostrado. Os cortes foram corados com anticorpo anti-SHP-1. (C) Interacção de STAT-3 e SHP-1 foi detectada em células HUVEC ou AGS. As proteínas imunoprecipitadas foram recolhidas e submetidas a SDS-PAGE e imunotransferência com anticorpos anti-STAT-3 ou SHP-1-anti-anticorpos. Em A e B, os dados são apresentados como média ± EPM (n = 5). * P 0,05 como comparado com o controlo. Em C, os resultados apresentados são representativos de pelo menos quatro experiências independentes.
Honokiol Altered ER Morfologia, induziu Calpain-II-regulada induzida SHP-1 STAT-3 Desfosforilação, e diminuiu VEGF Geração
estudos anteriores sugeriram que o stress ER desempenha um papel importante na angiogénese [20], [21]. A seguir, examinou o efeito de honokiol na microestrutura ER por microscopia eletrônica de transmissão. Como mostrado na Figura 12A, ER dilatação e fragmentação foram expostas em SCM 1-células cancerosas tratadas com honokiol gástricas e HUVEC
(A) células foram tratadas com honokiol (HUVECs, 10? M;. SCM-1, 40 ^ M) durante 18 h. As células foram recolhidas e visualizadas por microscopia electrónica como descrito em “Materiais e Métodos”. As setas indicam dilatada ER. Ampliação original: 9800x. (B) As células foram tratadas com ou sem honokiol (HUVECs, 20 uM; AGS, 20 uM) na presença ou ausência de proteína recombinante de calpaina II (re-calpaína) ou calpaína II transfecção siRNA, e, em seguida, as células foram analisadas para SHP actividade -1. (C) As células foram transfectadas com o tipo selvagem de STAT-3 (em peso) e os plasmídeos (mut) mutantes STAT-3 ou SHP-1 siRNA, e, em seguida, determinou-se a produção de VEGF. (D) Interacção de calpaína e SHP-1 foi detectada em células AGS. As proteínas imunoprecipitadas foram recolhidas e submetidas a SDS-PAGE e imunotransferência com anti-calpaina II ou SHP-1-anti-anticorpos. Em A e D, os resultados apresentados são representativos de pelo menos 4 expericias independentes. Em B e C, os dados são apresentados como média ± EPM (n≥4). * P 0,05 como comparado com o controlo. # P . 0,05, em comparação com somente honokiol
Também queríamos determinar se a activação de calpaína-II é necessário para SHP-1 atividade em células tratadas com honokiol. inibidor de calpaína farmacológica e calpaína-II siRNA transfecção efetivamente reduziu a atividade SHP-1-honokiol reforçada em células AGS e HUVECs (Fig. 12B). As células tratadas com calpaina recombinante-II, como um controlo positivo, revelou um aumento de 4 a 5 vezes em SHP-1 actividade (Fig. 12B). O VEGF é conhecido por conter o local de ligação ao promotor de STAT-3. A seguir, analisou se honokiol pode regular a expressão de VEGF. Honokiol reduziu significativamente a produção de VEGF em células HUVEC e AGS, e este efeito foi revertido pela SHP-1 siRNA transfecção (fig. 12C). Além disso, a transfecção de mutantes STAT-3-plasmídeo em células, também inibiu a produção de VEGF. A combinação de honokiol com mutantes STAT-3-transfecção de plasmídeo em células sinergicamente reduziu a produção de VEGF em comparação com qualquer dos tratamentos sozinhos (Fig. 12C). Para confirmar ainda mais a interacção entre a calpaína II e SHP-1, co-imunoprecipitação e Western blot foram realizados em células de cancro gástrico. Tal como mostrado na Figura 12D, a calpaína-II foi especificamente associada com SHP-1 em células AGS na presença de honokiol (20 uM) em comparação com o controlo de IgG. Da mesma forma, a calpaina induzida por honokiol /SHP-1 interacção também foi encontrado em células HUVEC (dados não mostrados).
Discussão
Honokiol é um componente importante de
Magnolia officinalis
, que é um medicamento de transição na Ásia [18]. Honokiol possui efeitos anti-oxidantes e anti-inflamatórias
in vitro
e
in vivo
[22] – [25]. Honokiol tem sido demonstrado que exibem actividade anti-proliferativa contra as células endoteliais potente
in vitro
e anti-tumor contra os efeitos angiossarcoma em ratinhos nus [26]. Neste estudo, foi demonstrado pela primeira vez que honokiol é um inibidor potente da angiogénese e metástases de cancro gástrico peritoneal. Nossa pesquisa centrou-se sobre os efeitos e possíveis mecanismos de honokiol em metástase peritoneal e angiogênese utilizando PET /CT,
CAM
ensaio, ensaio plugue matrigel, ensaio de germinação de aorta célula endotelial anel, o ensaio de formação de tubos de células endoteliais, e
experimentos in vitro de células
. Os resultados mostraram que o honokiol pode suprimir a angiogénese e disseminação peritoneal através de um SHP-1 activação da cascata de sinalização de calpaína II-activado. A activação da fosfatase SHP-1 por honokiol ainda levou ao sub-regulação de STAT-3 e a activação de VEGF produção, resultando na inibição da angiogénese e metástases peritoneais. No entanto, a inibição da angiogénese e a inibição do potencial metastático de células cancerosas por honokiol podem ser os aspectos separados, sendo um deles um efeito de honokiol directamente na angiogénese e um outro efeito de honokiol em células cancerosas.
Durante os últimos anos, uma série de estudos indicam que a activação constitutiva da família STAT, especialmente STAT-3, está associada com a proliferação celular, angiogénese e metástase [10], [11], [27] – [30]. O aumento da expressão de activação de STAT-3 tem sido encontrada em várias células derivadas de tumor e amostras de tecidos de cancro humano. Desregulada activação de STAT-3 tem sido sugerido para desempenhar um papel importante na sobre-expressão de VEGF e aumentou fenótipos angiogénicos em cancro gástrico, o que pode contribuir para o desenvolvimento e progressão do cancro gástrico [11]. No presente estudo, descobrimos que honokiol pode efetivamente inibir a fosforilação das células cancerosas gástricas humanas (do site Tyr705) STAT-3 em HUVECs (ambos os sites Tyr705 e Serine727), e tumores metastáticos peritoneal (local Tyr705). À medida que a activação oncogénica de tirosina-quinases é uma característica comum em cancros, que voltada para o papel de Tyr705 fosforilação de STAT-3.
SHP-1 possui um potencial função supressora de tumor e é um regulador negativo da JAK /via de sinalização STAT [15]. Também tem sido demonstrado que a SHP-1 fosfatase pode ligar-se ao Y1173 domínio fosforilado, o que leva à desfosforilação de EGFR [31]. Y429 no domínio citoplasmático do receptor de eritropoietina tem sido sugerida para ser o local de ligação para a proteína-tirosina-fosfatase-SH PTP1, que podem desempenhar um papel importante na terminação de sinais proliferativos [32]. SHP-1 também tem mostrado ser um antagonista de factor de crescimento de sinalização em células epiteliais e hematopoiéticas [15]. SHP-1 foi especialmente destacada como um potencial antagonista fisiológico de VEGFR sinalização [33]. Em células endoteliais, SHP-1 está fisicamente associada com VEGFR2 e também é necessária para ambos mediada por TNFa e o tecido inibidor de metaloproteinases (TIMP) a inibição mediada por angiogénese de [31]. Assim, SHP-1 ativação pode ter consequências importantes para a regulação da proliferação e angiogênese. Neste estudo, verificou-se que honokiol especificamente aumentou a expressão de SHP-1, mas não SHP-2, em células gástricas cancerosas, células endoteliais e tumores metastáticos peritoneais. Estes achados sugerem que o honokiol podem inibir a angiogénese de células endoteliais e a metástase de células de cancro, o que pode ser através de um STAT-3 sub-regulação induzida por via de SHP-1.
Estudos anteriores propuseram um papel importante para o stress no ER o mecanismo molecular da angiogénese e o crescimento de células de cancro [16], [20], [21]. Koyama e colegas também sugeriram que a perturbação de cálcio induzida por stresse ER podem estar envolvidos na indução da acumulação de amilóide β e expressão do factor angiogénico no epitélio pigmentado da retina [34]. Um estudo recente mostrou que a sinalização de IRE-1α ER-tensão regulada possui uma função essencial no desenvolvimento da placenta e a viabilidade embrionária, destacando a relação de ER stress, e a angiogénese na placenta durante a gravidez [35]. Kim e colegas demonstraram que tanto a SHP-1 e SHP-2 são substratos endógenos para a calpaina, a qual está envolvida no contexto de
Entamoeba histolytica
morte da célula hospedeira induzida por [36]. Notavelmente, calpains tornar-se ativo quando o cálcio intracelular ([Ca
2 +] i) a concentração é elevada;