Abstract

B induzida por linfócitos proteína maturação 1 (Blimp1) é um regulador mestre de diferenciação de células B, e controla a migração de células germinativas primordiais. Recentemente observamos expressão Blimp1 aberrante em células de câncer de mama resultantes de uma via de sinalização de NF-kB RelB para Ras. A fim de abordar a questão de saber se a expressão inesperada de Blimp1 é visto em outros tumores derivados de epiteliais, foram selecionados os cancros do pulmão como eles são frequentemente impulsionada pela sinalização Ras. Blimp1 foi detectado em todas as linhas celulares de cancro do pulmão examinados cinco e mostrado para promover a migração de células de cancro do pulmão e invasão. Interrogatório de conjuntos de dados de microarranjos demonstrado elevada

BLIMP1

expressão do RNA em adenocarcinoma de pulmão, carcinoma ductal do pâncreas, tumores de cabeça e pescoço, bem como em glioblastomas. Envolvimento de

Ras

e sua quinase a jusante c-Raf foi confirmada utilizando estratégias mutantes e siRNA. A seguir, abordou a questão do mecanismo de activação Blimp1 no câncer de pulmão. Usando knockdown e expressão ectópica, o papel da proteína activadora (AP) -1 família de factores de transcrição foi demonstrada. Além disso, ensaios de imunoprecipitação de cromatina confirmaram ligação aos identificados elementos AP-1 no

BLIMP1

promotor do ectopicamente expressa c-Jun e de endógenos subunidades AP-1 após a estimulação do soro. O domínio de propéptido de lisil-oxidase (LOX-PP) foi identificada como um supressor de tumor, com capacidade para reduzir a sinalização de Ras em células de cancro de pulmão. LOX-PP reduzida expressão de Blimp1 por ligação a c-Raf e inibição da activação de AP-1, atenuando assim o fenótipo migratório das células de cancro do pulmão. Assim, Blimp1 é um mediador de Ras /Raf /AP-1 de sinalização que promove a migração celular, e é reprimido pela LOX-PP no cancro do pulmão

Citation:. Yu Z, Sato S, Trackman PC, Kirsch KH , Sonenshein GE (2012) Activation Blimp1 pela AP-1 em células de câncer de pulmão humano Promove uma migratórias Fenótipo e é inibida pela lisil oxidase Propeptide. PLoS ONE 7 (3): e33287. doi: 10.1371 /journal.pone.0033287

editor: Vladimir V. Kalinichenko, Hospital Infantil de Cincinnati Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 26 Outubro, 2011; Aceito: 10 de fevereiro de 2012; Publicado: March 15, 2012 |

Direitos de autor: © 2012 Yu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Estes estudos foram apoiados pelo National Institutes of Health (NIH) concede R01 CA143108 e PO1 ES011624. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

proteína de maturação induzida por linfócitos B 1 (Blimp1) ou positivo-Regulamentação domínio I Fator de Ligação 1 (PRDI-BF1) é uma proteína dedo de zinco codificada pelo domínio

PRDI-BF1 e RIZ 1

(

PRDM1

) ou

BLIMP1

gene de [1], [2], que foi inicialmente isolado como um repressor de transcrição da

IFNp

promotor de [3]. Vários mecanismos de repressão mediada por Blimp1 da transcrição de genes têm sido elucidados: recrutamento de metiltransferases de histonas (HMTs) [4], histona desacetilases (HDACs) [5], ou co-repressores [2] ou por competição com activadores de transcrição [6]. Blimp1 foi identificado como o principal regulador da diferenciação terminal de células B [7], que promove a diferenciação das células B em células plasmáticas [8]. Vários factores têm sido implicados na activação da transcrição da

gene Blimp1

durante a diferenciação de células B, incluindo a NF-kB, AP-1, IRF4, STAT3 e STAT5, embora, os seus mecanismos de acção são precisos não é totalmente compreendido [9]. Blimp1 foi subsequentemente demonstrado que regulam a proliferação das células T e a homeostase [10]. Durante o desenvolvimento, Blimp1 controla especificação primordial células germinativas (PGC) e migração de embriões de camundongos Blimp1 deficiente gerar PGC-como células que não conseguem mostrar a migração PGC característico [11], [12]. Um tanto inesperadamente, Blimp1 foi detectada em células de cancro não-hematopoiéticas. Nosso laboratório observada expressão Blimp1 em células de câncer de mama, e mostrou-reprimido transcrição da

ESR1

gene que codifica estrogênio receptor alfa (ERa), promovendo assim um fenótipo mais migratório [13]. a indução da transcrição dos níveis de Bcl-2 por a subunidade de NF-kB RelB recrutados Ras para a mitocôndria [14]. A sinalização de Ras resultante conduziu a uma indução aberrante de Blimp1 nas células de cancro da mama [13]. O factor de transcrição exacta (s) a jusante de Ras que a activação mediada de Blimp1 nestas células cancerosas permaneceu a ser identificado. No entanto, o envolvimento de Ras sinalização na ativação Blimp1 nos leva a supor que a expressão de Blimp1 pode ser mais difundido no câncer do que se pensava anteriormente. células de tumor colorectal também foram encontrados para expressar Blimp1, que reprimiu o

TP53

gene e crescimento das células, assim, mantida [15].

O cancro do pulmão é a principal causa de morte relacionada ao câncer nos países ocidentais . Aproximadamente dois terços dos pacientes são diagnosticados em estágio avançado, e dos demais pacientes que se submetem à cirurgia, 30-50% desenvolvem recorrência com doença metastática [16], [17]. O

RAS

oncogene é mutado em até ~ 30% dos cancros do pulmão, com a maioria das mutações encontradas no

KRAS

gene [16], [17]. Oncogénico K-ras predispõe ratos transgénicos para a tumorigénese pulmonar [18]. sinais de Ras através de várias vias, incluindo a cinase de proteína activada mitogénio (MAPK). Como aceitadores nucleares de cascatas de sinalização MAPK, o activador de proteína (AP) -1 família de factores de transcrição tem sido implicado no fenótipo altamente migratório das células de cancro do pulmão [19], [20], [21].

o gene

lisil oxidase

(

LOX

) foi isolado como

ras gene recision

(

rrg

) devido à sua capacidade de reverter Ras-mediada transformação de fibroblastos NIH 3T3 [22]. O nosso grupo mostraram expressão ectópica Pro-LOX reduzida quinase regulada por sinal extracelular (ERK) e fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) /sinalização de Akt e a activação de NF-kB em células NIH 3T3 transformadas com Ras [23]. Perda de

LOX

expressão do gene foi observada em muitos tecidos cancerosos e linhas celulares derivadas incluindo os de pulmão [24], [25], [26], do cólon [27], da próstata [28], gástrica [29 ] e de cabeça e pescoço cancros escamosas [30]. Ectópica

LOX

expressão do gene reduzido a formação de colónias de células gástricas cancerosas em cultura e a formação do tumor num modelo de xenoenxerto [29]. Lisil-oxidase é sintetizada e segregada como uma pró-enzima (Pro-LOX), e processados ​​para uma enzima funcional (LOX) e de propéptido de terminal amino (LOX-PP) [31]. O

rrg

actividade de LOX-Pro foi inesperadamente mapeados para o domínio de LOX-PP, tal como avaliado por inibição do fenótipo transformado de células NIH 3T3-Ras [32]. Subsequentemente, LOX-PP foi mostrado para reduzir o fenótipo migratório das células cancerosas de mama de ratinho dirigidos por Her-2 /neu, o que sinaliza via Ras e a sua capacidade para formar tumores em um modelo de murganho de xenoenxerto nu [33], [34]. Em células de cancro do pulmão H1299, que contêm um mutante

ARN do gene, LOX-PP reduziu a activação de ERK e Akt, e capacidade de crescimento independente de ancoragem e a formação de colónias invasiva em Matrigel [25]. LOX-PP também atenuou a activação mediada pela fibronectina de quinase de adesão focal em células de cancro da mama [34], [35], e o factor de crescimento de fibroblastos de proliferação de células de cancro da próstata [36] (FGF) -2-induzida. Aqui nós perguntado se Blimp1 é expressa em células de câncer de pulmão devido ao importante papel da sinalização de Ras nestas células cancerosas. Blimp1 foi detectado em todas as linhas de cancro do pulmão examinados e promoveu a sua migração e invasão. Além disso,

BLIMP1

RNA foi detectado em outros tumores primários impulsionados pela sinalização Ras. Em células de cancro do pulmão, um dirigível expressão foi induzida por uma via de Ras /Raf-c /AP-1, que pode ser inibida pela LOX-PP através da interacção com c-Raf. Assim, estes estudos identificam Blimp1 como um mediador crítico do fenótipo migratório das células do cancro do pulmão pela transformação Ras /c-Raf /AP-1 em cascata.

Materiais e Métodos

Células e condições de cultura

As linhas de células H1299 A549 cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC) e foram gentilmente cedidas por Zhi-Xiong Jim Xiao (Escola de Medicina da Universidade de Boston, Boston MA). O H441 linhas de células Calu-1, H23 e foram generosamente fornecidos pela Hasmeena Kathuria e Maria Ramirez (University School of Medicine Boston). A549, Calu-1, e células H441 H23 expressam mutante K-Ras [37], [38] e H1299 expressa mutante N-ras [39]. células Bosc23 foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (ATCC). Todas as linhas celulares foram mantidas em meio essencial mínimo de Dulbecco H441 excepto que foi mantida em meio RPMI-1640. Os meios de cultura foram suplementados com 10% de soro fetal de bovino (FBS), como recomendado pela ATCC. Os clones que expressam H1299 rato LOX-PP num vector indutível doxiciclina (DOX) foram estabelecidos e o ARN total isolado como descrito anteriormente [25]. As células A549 que expressam estáveis ​​indutíveis V5-tag humano ou de ratinho LOX-PP foram estabelecidas como previamente descrito [33], [34]. Resumidamente, PCL-Ampho empacotamento de retrovírus vector (Imgenex, San Diego, CA) foi co-transfectado em células BOSC 23 utilizando FuGENE 6 (Roche Diagnostics Co., Indianapolis, IN) com vector vazio quer efectora pC4

BSRR (TO) (EV) ou vector tendo os fragmentos de ADN de humano ou rato LOX-PP com tag V5 do terminal C e o vector regulador PCX

neoTR2 (ambos gentilmente fornecida por Tsuyoshi Akagi, KAN, Kobe, Japão). Após 48 h, os sobrenadantes contendo partículas virais foram colhidos e passados ​​através de um filtro de 0,45 um (Corning Inc., Corning, NY). células de cancro do pulmão A549 foram duplamente infectadas durante 48 horas com sobrenadante de BOSC 23 células contendo vírus que transportam os vectores de regulador e efectoras suplementado com 6 ug /ml de polibreno (Sigma, St. Louis, MO). As células infectadas foram seleccionadas com 10 ug /ml de blasticidina (Invitrogen, Carlsbad, CA) e 1,4 mg /ml de geneticina (Sigma) para gerar grupos separados de, células estáveis ​​A549-EV A549-humano LOX-PP e A549-ratinho LOX-PP .

os plasmídeos e análise de transfecção

o pcDNA3 /Blimp [2] e do 7-kB

Blimp1

repórter -pGL3 luciferase (

Blimp1

-Luc ) [40] vectores foram gentilmente cedidas por Tom Maniatis (Universidade de Columbia, NY) e Kathryn Calame (Universidade de Columbia), respectivamente. A c-Jun, c-Fos, Fra-1 e Fra-2 AP-1 construções em vetor de expressão pCI foram conforme relatado anteriormente [41]. Para a transfecção transiente de vectores de expressão, as culturas em placas de 12 poços foram incubadas durante 48 h na presença de 1 ug de ADN e 3 ul de Fugene 6 ou 2,5 ul de Lipofectamina 2.000 (Invitrogen). A co-transfecção do vector MSV-β-gal, expressando β-galactosidase (β-Gal) foi usado para normalizar para a eficiência de transfecção. Todos os ensaios de repórter de transfecção transiente foram efectuadas, em triplicado, duas vezes, como descrito anteriormente [42], e o erro padrão da média (SEM) calculado.

BLIMP1

siRNA, e

junho

,

FRA-1 | e

FRA-2

sequências duplex de siRNA foram como descrito anteriormente [15], [43 ]. O siRNA alvejando humano

KRAS

gene (SC-35731) foi de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Os duplexes de ARN utilizadas para o direccionamento

c-RAF

foram como descrito por Chadee Kyriakis e [44] e adquirido de Qiagen (Valencia, CA). Para a transfecção transiente de siRNAs individuais, as culturas em placas de 6 cavidades foram incubadas durante 24 h na presença de siRNA duplex (10 nM final) e Lipofectamine RNAiMax (Invitrogen), de acordo com o protocolo do fabricante. No caso da co-transfecção de dois AP-1 siRNAs, a concentração final de cada siARN foi de 10 nM, tornando a concentração total de siRNA de 20 nM. Quando são referidos, a cultura foi suplementada com um siRNA controlo negativo (Qiagen) a uma concentração final de 10 ou 20 nM, conforme apropriado. O vector de expressão de Ras S186 foi gentilmente cedido por Mark Philips (NYU School of Medicine, New York, NY). Para construção de glutationa no terminal-N

S

-transferase (GST) etiquetadas como seus mutantes de deleção LOX-PP e, o cDNA que codifica comprimento total LOX-PP (WT, aminoácidos 1-162) e supressão de aa resíduos 26-100 (ΔM3) foram amplificados a partir de PRO de comprimento completo de ADNc de LOX-[33] e inserido no local BamHI /Clal do vector de expressão de mamífero pEBG-GST, uma oferta generosa do Dr. Bruce Mayer (Universidade de Connecticut Health Center, Farmington, CT). Para a construção de C-terminal de GST-tagged LOX-PP, os ADNc que codificam para a LOX-GST e PP foram amplificados e inserido no pcDNA3.1 (+). constitutivamente ativo (CA-MEK) mutante pBabe-puro-MEK1 S217E /S221E foi gentilmente cedida pelo Dr. Geoffrey M. Cooper (Boston University, Boston, MA). O ADNc que codifica MEK1 S217E /S221E foi inserido no pcDNA3.1 (+).

A análise de imunotransferência

Os extractos nucleares (NE) e os extractos de células inteiras (WCE) foram preparados e sujeitos a imunotransf erência, tal como descrito anteriormente [33]. Para a detecção de segregado recombinante LOX-PP-V5, meio de cultura (40 ul a partir de 2 ml de meio de cultura) foi imunologicamente utilizando um anticorpo anti-V5 (R960-25, Invitrogen). Os anticorpos contra Blimp1 (sem 9115s.), C-Jun (sem 9165.), Fosfo-c-Jun (sem 9261s.), MEK1 /2 (L38C12;. Não 4694) fosfo-ERK1 /2 (fosfo-Thr202 /Tyr204; não 9101s) e ERK1 /2 (9102) foram obtidos a partir de Cell Signaling (Danvers, MA).. Os anticorpos contra GST (B-14), K-Ras (F234), B-Raf (F-7), Fra-1 (N-17), Fra-2 (Q-20) e c-fos (H-125 ) eram de Santa Cruz Biotechnology. Os anticorpos contra β-actina (CA-15) e α-tubulina (DM1A) eram da Sigma. Hsp70 /Hsc70 (SPA-820) e Hsp90 (SPA-830) anticorpos foram adquiridos de Stressgen (Victoria, BC, Canadá). Anticorpo contra o c-Raf (clone 53) e Ras (clone 18 /RAS) eram de Transdução BD (Franklin Lakes, NJ). Os anticorpos policlonais de coelho contra a LOX-PP foram preparados como descrito previamente [45]. Os resultados de um mínimo de dois experimentos independentes foram submetidos a densitometria e normalizada a um controle de carregamento de β-actina e os valores médios relativos às células de controlo (definido como 1.0) vector vazio (EV) dado.

Migração e ensaios de invasão

Suspensões de 1 × 10

5 células foram mergulhadas, em triplicado, nos compartimentos superiores de Costar Transwells (Corning, Lowell, MA) em um filtro de diâmetro policarbonato de 8 mm (8 de poro tamanho), e incubou-se a 37 ° C durante 16 h. A migração das células para o lado inferior do filtro foi avaliada com o ensaio de fosfatase enzimática utilizando fosfato de p-nitrof enilo e a determinação OD

410 nm, tal como descrito anteriormente [13] ou por coloração com violeta de cristal e OD

570 determinação nm (63). A migração média de três experiências independentes ± SD é apresentado em relação ao controlo EV, o qual foi fixado em 1,0.

valores P

foram calculados usando um Student

t

-teste. Para ensaios de invasão, os filtros foram pré-revestidas com 10 ug de Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA). A migração das células para o lado inferior do filtro foi avaliado por coloração com violeta de cristal e OD

570 nm determinação. A média ± DP são apresentados. ensaios de invasão foram realizadas três vezes, em triplicado.

transcriptase reversa (RT)-PCR análise

RNA foi isolado usando RNeasy Mini Kit (Invitrogen), e as amostras com A

260 /a

280 proporções entre 1,8 e 2,0 foram tratados com RQ1 DNase isenta de RNase (Promega). Superscript III RT foi utilizado para a transcrição reversa de ARN com 1 ug na presença de 100 ng de iniciadores aleatórios (Invitrogen). Para Realtime PCR quantitativa (Q-PCR), a

BLIMP1

iniciadores foram como descrito anteriormente [46].

GAPDH

iniciadores foram: Atacante 5′-TTGCCATCAATGACCCCTTCA-3 ‘; Reverso 5’- CGCCCCACTTGATTTTGGA-3 ‘. Q-PCR foi realizada em triplicado em um sistema Roche LightCycler 480.

cromatina imunoprecipitação (CHIP) Ensaio

ensaios ChIP foram realizadas utilizando um kit EZ-chip (Millipore Corporation, Billerica, MA) , de acordo com as instruções do fabricante. Para a análise de ectopicamente expressa AP-1, 24 h após H441 células foram transfectadas com um vector de expressão de c-Jun, formaldeído (1% final), foi adicionado ao meio de cultura de células. Os lisados ​​celulares totais foram feitas e sujeito a sonicação num sonicador Misonix 3000 (Misnonix, Farmingdale, NY) durante 15 ciclos de 10 seg cada um para se obter fragmentos de ADN genómico de aproximadamente 200 a 1000 pb. Após preclearing com grau ChIP Proteína G agarose, 100? L de complexos DNA-proteína de cisalhamento foram imunoprecipitados com anticorpos contra a proteína c-Jun (sc-1694) ou IgG normal de coelho (sc-2027) (Santa Cruz Biotechnology). A reticulação foi invertida e fragmentos de ADN genómico purificado foram submetidos a PCR. A reticulação foi invertida por incubação durante a noite a 65 ° C e fragmentos de ADN genómico purificado com um kit de purificação de PCR QIAquick (Qiagen, n. 28104). Dois elementos de ligação para AP-1, que também são conhecidos como elementos responsivos TPA ou tres, foram previamente identificados em -1.813 e -1.647 pb em relação ao

BLIMP1

local de início da transcrição [47] e verificáveis ​​com base TRANSFAC ( genomatix.de) análise. A região entre os dois TREs foi amplificado por PCR. Os iniciadores para a -1813 pb TRE: Atacante 5′-GCCTTCTTCCCACCTCAAATATCA-3 ‘, Reverse 5′-TGGCCTGCTGTTCAAACAGTCT-CA-3′; e para a -1647 pb TRE: directo 5’-GTTGCATGATGGTGTATGTGGCCT-3 ‘, reverso 5′-ATCCAGCCTGCTCAAGAGGGTTTA -3’. Como um controlo positivo para a ligação de AP-1, um fragmento do humano

junho

promotor contendo dois sítios localizados perto TRE (-120 e -1 pb) foi igualmente submetido a análise de chip, utilizando os iniciadores anteriormente descritos [ ,,,0],48]. Como controlo negativo, foram concebidos iniciadores de uma região a montante do

BLIMP1

promotor (-5.508–5.366 pb) que não contém locais TRE: Atacante 5’TCCTTCCCTGTGTTTGGTCCCATT-3 ‘, Reverse 5’-ATTGTTTCCTTCAAGCAGGCACCC- 3 ‘. Para a ligação de AP-1 endógenos subunidades, as células A549 foram incubadas em meio isento de soro durante 48 h e de FBS (10% de concentração final) adicionado de volta. Após 30 min, WCE foram preparadas e submetidas a ensaio de chip, como descrito acima, utilizando anticorpos contra a IgG de coelho normal, c-Jun, Fra-1 (SC-183), ou Fra-2 (SC-604) (a partir de Santa Cruz Biotechnology ).

A imunoprecipitação e GST puxar para baixo ensaio

H1299 ou células A549 foram lisadas com tampão A [25 mM de HEPES-KOH (pH 7,2), 150 mM de KCl, 2 mM de EDTA, 1 mM fluoreto de fenilmetilsulfonilo, 1 mM de ditiotreitol, 0,5 ug /ml de leupeptina, 2 uM de pepstatina A, 1 ug /mL de aprotinina e 1% de Triton X-100]. Os lisados ​​foram centrifugados numa microcentrífuga durante 10 min a 13000 rpm a 4 ° C para remover o material insolúvel. Para imunoprecipitação, 2 ug de qualquer anticorpo de coelho anti-LOX-PP [45] ou de IgG de coelho de controlo foi adicionado ao lisado de células 500 ug, seguido por incubação durante a noite a 4 ° C. Esferas de proteína G-Sepharose (Invitrogen) foram então adicionados à mistura, seguido de incubação a 4 ° C durante 2 h com agitação suave. As contas foram lavadas quatro vezes com tampão A. Para o ensaio de GST-puxar para baixo, os lisados ​​foram incubados com 20 ul de Glutationa-Sefarose 4B (GE Healthcare) durante 2 h a 4 ° C. A resina foi lavada quatro vezes com tampão A. Os complexos imunes ou GST pull down-complexos foram eluídas a partir das pérolas de Sepharose com tampão de amostra de SDS-PAGE, e as proteínas precipitadas analisados ​​por análise de imunotransferência.

resultados

cancro do pulmão células expressam Blimp1

linhas celulares de cancro do pulmão Cinco, impulsionado pelo mutante K-Ras ou N-Ras, foram selecionados para testar a expressão Blimp1: A549, H1299, Calu-1, H23 e H441. Os extractos nucleares foram submetidas a análise de immunoblot (Fig. 1A). Como referência, foram incluídos extractos nucleares a partir de células de cancro da mama positivos ERa MCF-7 e negativas ERa MDA-MB-231, que apresentavam níveis Blimp1 relativamente inferiores e superiores, respectivamente [13]. Todas as cinco linhas celulares de cancro de pulmão expressa proteína de 100 kDa Blimp1 reconhecido por um anticorpo contra o terminal-N da proteína humana Blimp1. Como se viu anteriormente, as células MDA-MB-231 de cancro da mama negativas células ERa expressaram níveis mais elevados do que os de Blimp1 ERa células MCF-7 positivas [13]. Todas as células de cancro do pulmão expressaram quantidades substancialmente mais elevadas de Blimp1 do que a linha MDA-MB-231. Assim, Blimp1 é expresso em células de cancro de pulmão.

(a) Amostras de extractos nucleares (20 pg) de A549, H1299, Calu-1, H23 e células cancerosas de pulmão humano H441 e MCF-7 e MDA MB-231 (MB-231), as células de cancro da mama foram submetidos a imunomancha para Blimp1 e β-actina, como um controlo para o carregamento igual. As posições dos marcadores de peso molecular são apresentados na pista da esquerda. Um representante de dois experimentos independentes com resultados semelhantes é mostrado. (B) A549 (C) e as células H1299 foram transitoriamente transfectadas com 10 nM de cada um de

siBLIMP1-1

,

siBLIMP1-2

ou um siRNA controlo negativo mexidos. painéis superiores: Quarenta e oito horas após a transfecção, WCE (30 ug) foram sujeitas a imunotransf erência para Blimp1 e β-actina. As bandas foram quantificados utilizando software NIH Image J. e expressão Blimp1 normalizadas para expressão de p-actina. expressão Blimp1 normalizada foi determinada em duas experiências independentes e os valores médios são dados abaixo os blots. painéis inferiores: Alternativamente, após 24 h, as culturas foram tripsinizadas e 1 × 10

5 células submetidas a um ensaio de migração durante 16 h, em triplicado. A migração média de três experiências independentes ± SD é apresentado em relação ao controlo negativo siRNA (fixado em 1,0).

valores P

foram calculados utilizando Estudante de

t

-teste. *,

P Art 0,005; **,

P Art 0,0005. (D) As células A549 foram incubadas na presença de 0,5 nM

siBlimp1-2

ou mexidos siRNA controlo negativo durante 16 h. As células foram então transfectadas com o vector de expressão Blimp1 (2 ng por poço em placas de 6 poços) e incubou-se durante 32 h. (Inserção) lisados ​​de células inteiras (20 ug) foram submetidas a análise de mancha de Western utilizando anticorpos contra Blimp1 ou β-actina. As culturas foram tratadas com tripsina e 1 × 10

5 células submetidas a um ensaio de migração durante 16 h, em triplicado. A migração média de duas experiências independentes, é apresentada ± SE em relação ao controlo negativo siRNA e VE (fixado em 1,0). Os dados mostrados são de uma representativos de duas experiências independentes, com resultados semelhantes. As células A549 (E) foram transitoriamente transfectadas com 10 nM cada um

siBLIMP1-1

,

siBLIMP1-2

ou um controlo negativo mexidos siRNA. Após 48 h, as culturas foram tripsinizadas e 1 × 10

5 células submetidas a um ensaio de invasão de 16 h, em triplicado. Os dados médios de três experiências independentes ± SD é apresentado em relação ao controlo negativo siRNA (fixado em 1,0).

valores P

foram calculados utilizando Estudante de

t

-teste. *, P . 0,01

Blimp1 promove a migração de células de câncer de pulmão

A ausência de Blimp1 em embriões de ratos levou ao desenvolvimento de células germinativas-como primordiais que não foram capazes de migrar [ ,,,0],11], [12]. Para testar se a expressão Blimp1 está envolvida no controle da migração de células do cancro do pulmão, foi usada uma estratégia knockdown. As células A549 e H1299, que apresentavam níveis relativamente elevados de Blimp1 (Fig. 1A), foram incubadas ou com

siBLIMP1-1

ou

siBLIMP1-2

, duas espécies de ARNip independentes, ou com um mexidos controle negativo siRNA. Após 48 h, as amostras de WCE foram submetidos a análise de immunoblot. Ambos

BLIMP1

siRNAs resultou em knockdown eficaz da expressão da proteína Blimp1 em comparação com o ARNsi de controlo. Um knockdown mais robusto foi visto com

siBLIMP1-2

em ambas as linhas celulares, ou seja, 93% de redução no A549 e 88% em H1299 em comparação com 30% no A549 e 48% em H1299 com

siBLIMP1- (painéis superiores, Figs. 1B e 1C) 1 |. Os efeitos de um 24 h de incubação com estes siRNAs sobre a migração de células A549 e H1299 foram testados em câmaras de Boyden (1 × 10

5 por poço) utilizando como FBS a quimio-atractor. A migração celular foi medida 16 h mais tarde. Knockdown de

BLIMP1

expressão levou à diminuição da migração de A549 (Fig. 1B) e H1299 células do cancro do pulmão (1C Fig.). Em três experimentos independentes, realizados em triplicado,

siBLIMP1-2

levou a uma mais profunda redução na migração de A549 (reduções médias de 42% com

siBLIMP1-1

vs 71% com

siBLIMP1-2

) e H1299 células (diminuição média de 35% com

siBLIMP1-1

vs 54% com

siBLIMP1-2

). Não foram observados efeitos significativos dos tratamentos sobre a proliferação celular (dados não mostrados). Estes resultados são consistentes com a redução de níveis Blimp-1. Para confirmar que a redução da migração celular foi especificamente devido ao knockdown de expressão Blimp1, foi realizado um experimento de resgate usando

siBLIMP1-2

e expressão ectópica Blimp1 em células de câncer de pulmão A549. Resumidamente, as células A549 foram incubadas ou com

siBLIMP1-2

ou siRNA controlo negativo, durante 16 h, seguida de transfecção transiente de um vector que expressa Blimp1 ou ADN EV. Após 32 h, as células foram submetidas a um ensaio de migração ou amostras de WCE foram submetidos a análise de immunoblot.

BLIMP1

siRNA-2 resultou em knockdown eficaz da expressão da proteína Blimp1 em comparação com o ARNsi de controlo e este efeito foi superada pelo vector de expressão Blimp1 (Fig. 1D, inserção). Como pode ser visto acima, de knockdown

BLIMP1

expressão conduziu a uma diminuição de 42% na migração de células em comparação com células transfectadas com ARNsi de controlo negativo e EV, e este foi substituído pela expressão ectópica Blimp1 (Fig. 1D). Um aumento de 33% na migração de células A549 transf ectadas com ADNc de Blimp1 e

siBlimp1-2

foi observada em comparação com o ARNsi de controlo e células transfectadas EV. Além disso, não há efeitos significativos sobre a proliferação celular foram observadas ao longo do tempo (dados não mostrados). Em seguida, testamos os efeitos da Blimp1 knockdown na invasão. Uma diminuição na invasão de células cancerosas A549 pulmão foi anotado com

BLIMP1

siRNA-1, que foi ainda mais profunda com o

BLIMP1

siRNA-2 em comparação com o controlo negativo siRNA, consistente com a migração de dados (Fig. 1E). Assim, níveis reduzidos de chumbo Blimp1 à diminuição da capacidade das células de câncer de pulmão A549 e H1299 de migrar e invadir.

A seguir, realizou o experimento conversar e ectopicamente expressa Blimp1 em células A549 e H441, que expressam níveis mais altos e moderados de Blimp1, respectivamente. As culturas foram transientemente transfectadas com um ADNc de expressão ou vector vazio Blimp1 parental (EV) durante 24 h e submetida a ensaios de migração, como acima. Em três experiências independentes, realizados em triplicado, a sobre-expressão Blimp1 aumento da migração de células A549 e H441 por uma média de 64% (Fig. 2A) e 58% (Fig. 2B), respectivamente. Western blot de extractos preparados a partir de culturas de modo semelhante transfectadas confirmou a expressão ectópica de Blimp1 (painéis superiores, as Figs. 2A e 2B). Assim, Blimp1 promove um fenótipo mais migratório das células de cancro do pulmão

células A549 (A) ou (B) H441 células foram transfectadas transientemente com 1 ug de cDNA ou DNA Blimp1 EV utilizando Lipofectamine 2000. Os painéis superiores:. WCE foram isolados após 48 h e submetida a análise de imunotransferência para Blimp1 e β-actina. painéis inferiores: Alternativamente, 24 h após a transfecção, as células foram submetidas a um ensaio de migração, como na Fig. 1. A migração média de três experiências independentes ± SD é apresentado em relação à VE (fixado em 1,0).

valores P

foram calculados usando um Student

t

-teste. *,

P Art 0,005. lote C) Box do conjunto de dados microarray câncer Hou pulmão foi acessado usando Oncomine banco de dados. Estudante de

t

-teste para os dois grupos mostra um

valor P

de 0,024. parcelas D) da caixa do câncer de pâncreas Badea, Estilo cancro da cabeça-pescoço e Sun tumor cerebral conjuntos de dados de microarranjos foram acessados ​​usando Oncomine banco de dados. Estudante de

t

-Testes comparação entre os grupos nesses estudos mostram

valores P

de 8.67e

-7, 0,001 e 3.28e

-15, respectivamente.

múltiplos tumores primários exibir superexpressão de

BLIMP1

RNA

a seguir, perguntou se

BLIMP1

RNA é detectada em tumores primários de pulmão. Elevado

BLIMP1

expressão de ARNm foi detectada em amostras de adenocarcinoma do pulmão em comparação com tecidos pulmonares normais [49] (Fig. 2C). Constitutiva de sinalização de Ras induzida por qualquer um mutante

RAS

gene ou activador a montante, tais como receptor do factor de crescimento tem sido implicado em muitos outros tumores.

KRAS

mutações foram encontradas em 95% dos adenocarcinomas do ducto pancreático [50], enquanto que a sobre-expressão do receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR), o que induz a sinalização de Ras, foi encontrada na cabeça humana de 80-90% e pescoço carcinomas de células escamosas [51] e 40% de glioblastomas [52]. Notavelmente, as nossas análises que utilizam conjuntos de dados de microarray em Oncomine revelou elevada

BLIMP1

expressão de ARN em amostras de adenocarcinoma pancreático [53], carcinoma de células escamosas língua [54] e glioblastoma [55] em comparação com os tecidos normais correspondentes (FIG. 2D). Assim,

BLIMP1

RNA é abundante em um grupo diverso de cancros humanos.

Ras a sinalização de c-Raf induz a expressão Blimp1 em células de câncer de pulmão

Para abordar diretamente o papel de Ras sinalização sobre os níveis de Blimp1 em células de câncer de pulmão, um mutante dominante negativo foi usado pela primeira vez. O mutante Ras S186 retém a capacidade de se associar com o efector da proteína quinase c-Raf, mas não se translocar para a membrana e a activação inibiu de Blimp1 por Bcl-2 [13], [56]. As células A549, que expressam um mutante activado K-Ras C12, foram transfectadas com um plasmídeo ou EV expressando Ras S186 e após 48 h, WCE e RNA foram isolados. A expressão ectópica de Ras S186, o que foi confirmado por imunotransferência, diminuiu a expressão de proteína por Blimp1 ~54% (Fig. 3A). Em duas experiências separadas,

BLIMP1

expressão de mRNA diminuiu em média de 48% após a expressão ectópica de Ras S186 (Fig. 3B). Os efeitos do dominante negativo de Ras em

Blimp1

actividade do promotor foram também testados. As células A549 foram co-transfectadas com ADN do vector EV ou Ras S186, juntamente com uma 7-kB

Blimp1

construção repórter promotor

Blimp1

-Luc vector de expressão e um β-gal, para normalização dos ganhos de eficiência de transfecção. Superexpressão de Ras S186 levou a uma redução média de 69% em normalizada

Blimp1

atividade do promotor (Fig. 3C). Por último, uma si-

KRAS

estratégia foi empregada (Fig. 3D). Knockdown de K-Ras levou a um decréscimo de 93% da expressão da proteína K-ras e a uma redução substancial na actividade de ERK tal como avaliado por uma redução nos níveis de fosfo-ERK. Além disso, uma diminuição média de 44% nos níveis de Blimp1 foram observadas em duas experiências independentes (Fig. 3D). Juntos, estes resultados indicam que Ras oncogénico sinalização em unidades de células de câncer de pulmão A549

BLIMP1

expressão do gene.

(A) As células A549 foram transfectadas com 5 ug de um plasmídeo expressando dominante negativo Ras S186 ou DNA EV. Após 48 h, foram preparados WCE e RNA. *, P 0,01.