Abstract

Objetivos

Para comparar os efeitos biológicos de

sementes de 125I contínua taxa de dose baixa (CLDR) de radiação e

60Co γ-ray de alta taxa de dose (HDR) de radiação no cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC ) células.

Materiais e Métodos

A549, células H1299 e BEAS-2B foram expostas a

radiação 125I sementes CLDR ou radiação

60Co γ-ray HDR. A fracção de sobrevivência foi determinada utilizando um ensaio de formação de colónia. A progressão do ciclo celular e apoptose foram detectados por citometria de fluxo (FCM). A expressão das proteínas relacionadas com a apoptose, caspase-3 clivada, caspase-3-, PARP clivada, PARP-, BAX e Bcl-2 foram detectados por ensaio Western Blot.

Resultados

Após irradiação com

radiação 125I sementes CLDR, houve uma fração menor sobrevida, parada do ciclo celular mais pronunciada (G

1 prisão e G

2 /M detenção em A549 e H1299 células, respectivamente) e uma apoptótica maior rácio para células A549 e H1299 do que após

60Co radiação γ-ray HDR. Além disso, os ensaios de Western blot revelou que

radiação 125I sementes CLDR notavelmente sobre-regulada a expressão da Bax, clivado-caspase-3 e proteínas de PARP clivada e regulados negativamente a expressão de proteínas Bcl-2 em A549 e células H1299 comparado com a radiação HDR

60Co γ-ray. No entanto, houve pouca alteração na proporção de apoptose e expressão de proteínas relacionadas à apoptose em células normais BEAS-2B receber o mesmo tratamento.

Conclusões

radiação 125I sementes CLDR levou a inibição do crescimento notável de A549 e as células H1299 em comparação com a radiação

60Co HDR γ-ray; As células A549 foram os mais sensíveis à radiação, seguido por células H1299. Em contraste, as células normais BEAS-2B foram relativamente radio-resistente. O desequilíbrio do rácio de Bcl-2 /Bax e a activação de proteínas de caspase-3 e PARP pode desempenhar um papel fundamental nos efeitos antiproliferativos induzidos por

radiação 125I sementes CLDR, embora outras possibilidades não foram excluídos e vai ser investigado em estudos futuros

Citation:. Wang Z, Zhao Z, Lu J, Chen Z, Mao a, Teng G, et al. (2015) A comparação dos efeitos biológicos de

125I Sementes contínua e

60Co alta taxa de dose da radiação de gama on Non-Small Cell Lung Cancer células de baixa taxa de dose de radiação. PLoS ONE 10 (8): e0133728. doi: 10.1371 /journal.pone.0133728

editor: Qinghui Zhang, da Universidade de Nebraska Medical Center, United States |

Recebido: 23 Janeiro, 2015; Aceito: 01 de julho de 2015; Publicação: 12 de agosto de 2015

Direitos de autor: © 2015 Wang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo nº 12140901402, https://www.nsfc.gov.cn, Natural Science Foundation da China, ZMW; e nº 20114014, https://www.wsjsw.gov.cn/wsj/n429/n432/n1487/n1508/userobject1ai79649.html, o fundo de saúde da cidade de Xangai e Planejamento Familiar da Comissão, ZMW. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução cancer

pulmão é o câncer mais comum ea principal causa de mortes relacionadas ao câncer em populações independentes do género, respondendo por 14% de todos os cancros e 28% de todas as mortes relacionadas com cancro em todo o mundo [1, 2] . No entanto, o câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) é responsável por aproximadamente 80-85% de todos os casos de câncer de pulmão, e aproximadamente 40% desses pacientes são diagnosticados com CPNPC avançado ou doença medicamente inoperável com uma taxa de sobrevida global em 5 anos de menos . a 15% [1, 3]

Em pacientes que são diagnosticados com CPNPC avançado ou medicamente doença inoperável, a terapia de radiação é geralmente uma importante opção de tratamento; esta terapia inclui

60Co γ-ray de alta taxa de dose de radiação (HDR) e radiação

125I sementes contínua taxa de dose baixa (CLDR). Embora radioterapia externa é ainda uma das principais formas de terapia de cancro para uma ampla variedade de cancros humanos malignos, que tem efeitos secundários graves no tecido saudável circundante.

radiação 125I sementes CLDR oferece várias vantagens potenciais em relação a radioterapia externa, tal como uma distribuição de dose localizada, poupadores de tecido normal, invasão mínima, poucas complicações, excelente tratamento paliativo da dor e de controlo local [4]. Consequentemente,

125I radiação sementes CLDR tem sido gradualmente utilizado no tratamento local de doentes com cancro avançado e inoperável da próstata, câncer de pulmão, câncer pancreático, câncer colorretal e câncer de esôfago [5-9].

Embora muitos ensaios clínicos têm relatado que

radiação 125I sementes CLDR é um procedimento adjuvante viável para controlar os sintomas locais e prolongar a sobrevivência em NSCLC avançado, alguns estudos têm demonstrado a diferença nos efeitos biológicos entre

radiação 125I sementes CLDR e

60Co HDR radiação de raios-γ em células NSCLC ou a diferença na radiosensitivitie de células NSCLC.

sabe-se que as células de tumor são caracterizadas por uma proliferação descontrolada e apoptose reduzida. Para manter a integridade genómica, várias vias de sinalização de reparação de ADN e dos controlos de pontos de verificação do ciclo celular são activados em resposta a danos induzidos pela radiação. As células que sofrem apoptose ou morte eram danos ao DNA não foram reparados ou a sua acumulação suficientemente [10]. A apoptose é um importante mecanismo de morte celular induzida por IR e mais geralmente ocorre através da via intrínseca dependente de mitocôndrias, que envolve um número de genes relacionados com apoptose tais como Bax, Bcl-2, caspase-3 e PARP [11]. Bcl-2 e Bax são um dos pares de genes mais importantes que regulam a apoptose, e a sua expressão é relativamente estável em circunstâncias normais. Quando o nível de proteína Bcl-2 é aumentada, a activação da proteína caspase-3 é inibida. Em contraste, o aumento da expressão da proteína Bax promover a activação da proteína caspase-3 e induzir a apoptose de células [11, 12]. Caspase-3 é a proteína verdugo mais importante, e os seus resultados de activação da clivagem de PARP, que está relacionada com a reparação de danos do ADN, e, eventualmente, a apoptose [13, 14].

Para comparar os efeitos de radiobiológicos

sementes de 125I CLDR radiação e

radiação de raios γ de 60Co HDR, estudamos estes efeitos nos tipos patológicos mais comuns de células de adenocarcinoma de pulmão (A549 e H1299) e em células humanas normais brônquicas epiteliais (BEAS-2B). fracção de sobrevivência celular foi analisada utilizando o ensaio clonogénico, a paragem do ciclo celular induzida por IR foi investigado utilizando citometria de fluxo (FCM), e os níveis de proteína Bcl-2, BAX expressão de proteínas, clivada pela caspase-3 e cindiu-PARP foram detectadas utilizando Western blots .

Materiais e Métodos

condições

cultura de células e de radiação

no presente estudo, o adenocarcinoma do pulmão linhas celulares A549 humana e H1299 e a linha brônquica humano normal das células epiteliais BEAS 2B foram um presente do Laboratório de Biologia de radiação da Universidade Soochow (Suzhou, China). As células foram mantidas em meio de Dulbecco modificado de Eagle (DMEM) suplementado com FBS (10%), penicilina (100 U /ml) e estreptomicina (100 g /ml) numa incubadora humidificada a 37 ° C com 5% de CO

2.

Nesta investigação, foi utilizado um

125I modelo de radiação sementes para CLDR [15, 16, 4], o modelo é construído a partir de materiais de poliestireno, e é composto por uma placa de sementes inferior em casa camada e uma camada de placas de cultura de células superior. Na camada de placa de sementes, as sementes foram 14 igualmente espaçados dentro de recessos (4.5 mm x 0,8 mm) em torno de uma circunferência de 35 mm de diâmetro (D). Assim, um 6 × 35 mm de circunferência D pode conter 84 sementes, e um prato de cultura de células de 6 × 35 mm poderia ser colocado sobre a camada de placas de cultura de células. A altura (H) entre a placa de sementes e a parte inferior da placa de cultura celular foi de 12 mM, obtendo-se uma razão D /H de 2,9. Durante o CLDR, o

modelo de radiação 125I foi sempre colocado em uma caixa de chumbo na incubadora; ventholes foram incluídos em torno da caixa de ligação para permitir que o CO

2 necessário para o crescimento da célula para entrar e sair da caixa de chumbo, que foi utilizada para prevenir fugas radioactivas. Modelo BT-125-1

sementes de 125I foram adquiridos a partir de Xangai GMS Pharmaceutical Co., LTD. (Xangai, China). A actividade de

125I sementes individuais foi de 2,5 mCi, e a taxa de dose inicial foi de 18,32 cGy /h. Os tempos de exposição necessários para fornecer várias doses foram calculadas utilizando a seguinte fórmula:. Os tempos de exposição para a entrega de doses de 200, 400, 600 e 800 cGy de

125I radiação sementes CLDR a uma taxa de dose inicial de 18,32 cGy /h foram 10,97, 22,00, 33,08 e 44,23 horas, respectivamente.

radiação de raios γ de 60Co HDR foi gerado usando um MeV GWXJ80 cobalto-60 unidade de 1,25 teleterapia (Nuclear Power Institute of China) no Centro de radiação, Universidade Soochow (Suzhou, Jiangsu, China) [17]. A taxa de dose utilizada foi de 0,5 Gy /min. A distância entre a fonte de radiação e o plano de células foi de 0,8 m. Os tempos de exposição necessários para fornecer doses de 200, 400, 600 e 800 cGy usando

60Co HDR radiação de raios γ com a dose inicial de 0,5 Gy /min foram de 4, 8, 12 e 16 minutos, respectivamente. Células em crescimento exponencial foram expostas a

radiação 125I sementes CLDR ou

60Co radiação de raios γ HDR a 2, 4, 6 e 8 Gy. As células de controlo foram sujeitos ao mesmo procedimento sem radiação (0 Gy).

clonogénicas ensaio de sobrevivência

A549, células H1299 e BEAS-2B em crescimento exponencial foram tratadas com tripsina para formar uma suspensão de células única e semeadas em placas de cultura de 35 mm a várias diluições [18] (número de células foram decididas de acordo com a dose de irradiação, como se segue: 200 células por prato para o controlo e 2 tratamentos Gy, de 500 células para o tratamento de 4 Gy, 1000 células para o 6 Gy tratamento e 4.000 células para o tratamento de 8 Gy). Após A24-h de incubação, a A549, células H1299 e BEAS-2B foram expostas a

radiação 125I sementes CLDR ou

60Co HDR radiação de raios γ de 0, 2, 4, 6 ou 8 Gy, após o que as células foram colocadas numa incubadora a 37 ° C e cultivou-se durante 10-14 d para formar clones. Em seguida, as colónias foram fixadas com metanol e coradas com violeta de cristal. As colónias com mais de 50 células foram contadas como unidades formadoras de colónias.

análise do ciclo celular por citometria de fluxo (FCM)

A549, células H1299 e BEAS-2B em crescimento exponencial foram expostas a

sementes de 125I CLDR radiação ou

60Co HDR radiação de raios γ de 0, 2, 4, 6 ou 8 Gy. Após a irradiação, as células foram cultivadas continuamente durante 24 h. Em seguida, as células foram tratadas com tripsina e centrifugou-se a 1000 rpm durante 5 min. O sobrenadante foi descartado, e as células foram lavadas com solução salina fria tamponada com fosfato (PBS) uma a duas vezes e fixadas em álcool a 70% a 4 ° C durante a noite. As células foram, então, centrifugadas outra vez, e a solução de fixação foi descartado. Subsequentemente, as células foram lavadas com PBS frio uma ou duas vezes e, em seguida, incubadas com 10 mg /ml de RNase A e 500 ug /mL de PI no escuro durante 15-30 minutos à temperatura ambiente para determinar a progressão do ciclo celular por FCM.

análise de apoptose por FCM

Os três tipos de células foram irradiadas com

sementes de 125I ou

60Co de 0, 2, 4, 6 ou 8 Gy 24 h após o plaqueamento. A 48 h após a irradiação, as células foram recolhidas, ressuspensas em 500 ul de tampão e mistura-se com 5 jil de anexina V-FITC e 5 ul de PI durante 15-30 minutos no escuro à temperatura ambiente de acordo com as instruções do fabricante de ligação (Biuniquer tecnologia) para examinar a relação apoptótica por FCM.

Western blot

A549, células H1299 e BEAS-2B submetidos crescimento exponencial foram expostas a

radiação 125I sementes CLDR ou

60Co HDR radiação de raios γ de 0, 4 ou 8 Gy. As células foram recolhidas, centrifugadas e lavadas duas vezes com gelo frio 1 × PBS 24 h após a irradiação. Subsequentemente, a proteína total foi extraída com tampão de lise (Beyotime, China) contendo PMSF 1 mM (Beyotime, China) e um cocktail de inibidores de protease de comprimido (Roche Applied Science, Mannheim, Alemanha) por 10 ml de solução foi adicionada. Em seguida, a proteína total foi isolado. Após centrifugação, o sobrenadante foi transferido para novos tubos. As concentrações de proteína foram determinadas pelo ensaio BCA (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, EUA). Um volume total de 20 ul de amostra contendo 50 ug de proteína foi separada por SDS-PAGE e electrotransferidas para fluoreto de polivinilideno (PVDF) membranas (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EUA). As membranas foram então bloqueadas com leite magro a 5% em TBS-T (20 mmol /L de Tris-HCl, 150 mmole /L de NaCl, e 0,1% de Tween-20) durante 1 h à temperatura ambiente e subsequentemente incubadas com a apropriada anticorpos primários durante a noite a 4 ° C. Depois de ser completamente lavados com TBST, as membranas foram incubadas com anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano durante 1 h à temperatura ambiente, após o que, as membranas foram lavadas novamente com TBST. Em seguida, as proteínas foram detectadas utilizando o sistema de quimioluminescência aumentada (ECL) com marcadores prestained como padrões de tamanho molecular

os anticorpos primários utilizados no nosso estudo foram anti-β-actina (diluição 1: 1000, 60008-1. -Ig, Proteintech, EUA), anti-caspase-3 (1: 1000 de diluição, 19677-1-AP, Proteintech, EUA), anti-PARP (1: 1000 de diluição, 13371-1- AP, Proteintech, EUA), anti-Bax (1: 1000 de diluição, 50599-2-Ig, Proteintech, EUA) e anti-Bcl-2 (diluição de 1: 1000, 12789-1-AP, Proteintech, EUA). Os anticorpos secundários utilizados no nosso estudo foram rábano IgG marcado com peroxidase de cabra anti-rato (H + L) (1: 2000, A0192, Beyotime Instituto de Biotecnologia, China) e IgG de cabra anti-coelho marcada com peroxidase de rábano silvestre (H + L ) (1:., 2000, A0208, Beyotime Instituto de Biotecnologia, China)

análise estatística

Todos os resultados são apresentados como a média ± erro padrão (sE) de três experimentos independentes, e cada experimento utilizou três amostras paralelas. diferenças significativas nos dados de diferentes grupos foram avaliados por estudante do

t

de teste e ANOVA one-way. Significância foi estabelecido em valores P inferior a 0,05.

Resultados

sobrevivência clonogênica

Para examinar se os efeitos anti-proliferativa induzida por

125I radiação sementes CLDR eram mais eficiente do que os dos

γ radiação de raios-60Co HDR no A549, células H1299, e BEAS-2B e para detectar se o radiosensitivities de as três linhas de células eram as mesmas, realizou-se um ensaio de sobrevivência clonogénica. Como se mostra na Fig 1 (S1 conjunto de dados), as fracções de sobrevivência de A549, células H1299 e BEAS-2B após

radiação 125I sementes CLDR e

60Co HDR radiação de raios γ foram significativamente diminuídos em comparação com a das células de controle ( P 0,05). Para as células A549, a fracção de sobrevivência induzida por

125I sementes radiação CLDR foi significativamente menor do que a de

60Co HDR radiação de raios-γ a 4, 6 e 8 Gy (Fig 1A, P 0,05); no entanto, a diferença não foi significativa a 2 Gy. Para H1299 células, a fração de sobrevivência no

125I grupo radiação sementes CLDR foi também diminuiu significativamente em comparação com o da

60Co grupo radiação de raios γ HDR a 4, 6 e 8 Gy (Fig 1B, P 0,05 ). No entanto, não se observou uma diferença na fracção de sobrevivência entre células normais BEAS-2B tratados com as duas fontes de radiação nas mesmas doses (Fig 1C, P 0,05). Fig 1D e 1E mostram que a fração de sobrevivência menor para o maior foi A549 H1299 BEAS-2B, tanto no

125I sementes grupo CLDR-radiação eo

60Co grupo γ-ray radiação HDR (P 0,05 .)

AC: a diferença na fração de sobrevivência de A549, as células H1299 e BEAS-2B entre

radiação 125I sementes CLDR e

60Co radiação γ-ray HDR. * Indica uma diferença significativa (P 0,05) na comparação entre os dois tratamentos de radiação e controle de tratamento e # indica uma diferença significativa (P 0,05) quando se compara

125I radiação sementes CLDR e radiação

60Co γ-ray HDR das mesmas doses. D, E: A diferença na fracção de sobrevivência das três linhas de células que receberam o mesmo tratamento. * Indica uma diferença significativa (P 0,05). Bares, erro padrão (SE).

G

1 prisão em células A549 e G

2 /M prisão em células H1299 e BEAS-2B

Para explorar se

radiação 125I sementes CLDR e

radiação de raios γ de 60Co HDR causar diferentes tipos de parada do ciclo celular, analisamos a distribuição do ciclo celular após a irradiação com as duas fontes de radiação a 0, 2, 4, 6 e 8 Gy . Como mostrado na Figura 2 (S2 Dataset), observamos G

1 prisão em células A549 e G

2 /M detenção em H1299 e células BEAS-2B após a irradiação com

sementes de 125I e

60Co radiação de 4, 6 e 8 Gy em comparação com células de controlo (P 0,05); no entanto, a diferença não foi significativa a 2 Gy. Além disso, mais células A549 estavam em G

1 fase e mais células H1299 estavam em G

2 /M fase após

radiação 125I sementes CLDR que após

60Co radiação de raios γ HDR em 4, 6 e 8 Gy; esta tendência era dependente da dose (Fig 2A e 2B, P 0,05). No entanto, não houve diferença significativa no G

2 /M prisão entre

125I radiação sementes CLDR e

radiação de raios γ de 60Co HDR em células normais BEAS-2B (Fig 2C, a P 0,05). Após

125I radiação sementes CLDR de 4 Gy, o G

1 percentual fase de células A549 foi 70,67 ± 0,86%, eo G

2 /M percentagens de fase para células H1299 e BEAS-2B foram 21,77 ± 0,31% e 16,86 ± 0,29%, respectivamente. No entanto, apenas 59,59 ± 0,41% de células A549 foram em L

1 fase e 18,85 ± 0,99% de células H1299 e 15,58 ± 0,48% de células BEAS-2B estavam em G

2 /M fase após

60Co HDR radiação de raios γ de 4 Gy; outros são dados como se mostra na Fig 2.

A: L

1 prisão de células A549 irradiados com as duas fontes de radiação; B, C: G

2 /M detenção de células H1299 e BEAS-2B após a irradiação com as duas fontes de radiação. * Indica uma diferença significativa (P 0,05) na comparação entre 2, 4, 6 e 8 Gy irradiação com as duas fontes e controle (0 Gy) de tratamento de radiação, e # indica uma diferença significativa (P 0,05) na comparação entre os dois radiação tratamentos da mesma dose. Bares, erro padrão (SE).

rácio apoptótica de A549, as células H1299 e BEAS-2B

celular apoptose induzida por IR é um dos efeitos mais importantes da radioterapia tumor. Portanto, os índices apoptóticos de A549, as células H1299 e BEAS-2B após a irradiação com

sementes de 125I e

60Co y-raios a 0, 2, 4, 6 e 8 Gy foram examinados (S3 Dataset). Como mostrado na Fig 3A e 3B, ambos

radiação 125I sementes CLDR e

radiação de raios γ 60Co HDR levou a um aumento acentuado na proporção de apoptose de A549 e células H1299 em comparação com o tratamento de controlo, a 4, 6 e 8 Gy (P 0,05), enquanto que a razão de apoptose foi semelhante com 2 Gy entre os dois tipos de tratamento por radiações e ao controlo. Como esperado,

125I radiação sementes CLDR levou a uma percentagem mais elevada de A549 apoptótica e H1299 células do que fez

60Co radiação de raios γ HDR a 4, 6 e 8 Gy (Fig 3A e 3B, P 0,05). No entanto, não houve diferença na proporção de apoptose de células BEAS-2B receber

radiação 125I sementes CLDR,

60Co HDR radiação de raios-γ ou tratamento de controlo (Fig 3C, P 0,05). Como mostrado na Fig 3D e 3E, a razão de apoptose foi A549 H1299 BEAS-2B, tanto para a

125I grupo sementes CLDR radiação e o

60Co HDR grupo radiação de raios γ (P 0,05). Os índices apoptóticos foram 18,09 ± 0,42% e 13,79 ± 0,50% para as células A549 e as células H1299, respectivamente, após

125I radiação sementes CLDR de 4 Gy. Em contraste, os índices apoptóticos foram apenas 9,46 ± 0,42% e 8,79 ± 0,22%, respectivamente, após

60Co HDR radiação de raios γ de 4 Gy; outros dados são como mostrado na Figura 3.

AC: a diferença na proporção apoptótica de A549, as células H1299 e BEAS-2B receber

radiação 125I sementes CLDR e

60Co γ-ray radiação HDR . * Indica uma diferença significativa (P 0,05) na comparação entre 2, 4, 6 e 8 Gy irradiação com as duas fontes e controle (0 Gy) de tratamento de radiação, e # indica uma diferença significativa (P 0,05) na comparação entre os dois radiação tratamentos das mesmas doses. D, E: a diferença entre os índices apoptóticos de as três linhas de células irradiadas com

sementes 125I raios y-e

60Co. * Indica uma diferença significativa (P 0,05). Bares, erro padrão (SE).

O desequilíbrio de Bcl-2 e Bax proteínas

O ensaio de sobrevivência, análise do ciclo celular e apoptose celular resultados da análise clonog�icas obtidos utilizando FCM sugerem que as diferenças entre estas duas MÉTODOS radiação e o grupo de controlo em branco não foram significativas na Gy de irradiação 2; Portanto, escolheu 4 e 8 Gy para utilização neste estudo. Tem sido sugerido que a proteína Bcl-2 e Bax representam um dos pares de genes mais importantes para a regulação da apoptose [19, 20]. Assim, a Bcl-2 e Bax expressão de proteína foi detectada por ensaio Western Blot. Como mostrado na Fig 4A e 4B, tanto

radiação 125I sementes CLDR e

60Co HDR radiação de raios-γ de 4 e 8 Gy poderia significantl sobre-regular a expressão da proteína Bax e infra-regular a expressão de Bcl- 2 proteína em A549 e H1299 células em comparação com o tratamento controle. Os efeitos induzidos por

125I radiação sementes CLDR foram mais evidentes do que as de

radiação de raios γ de 60Co HDR. Como esperado, não houve aumento na expressão de Bcl-2 e BAX em células BEAS-2B após a irradiação por qualquer

radiação 125I sementes CLDR ou

radiação de raios γ de 60Co HDR (Fig 4C).

Um resultado representativo de três experiências independentes com resultados idênticos é mostrado. Con:. Controle

A ativação de caspase-3 e PARP

A ativação da caspase-3 e PARP proteínas é comumente considerado as características bioquímicas de um evento de apoptose. Portanto, as proteínas clivadas-caspase-3 clivada e PARP-foram examinados por ensaio Western Blot. Como ilustrado na figura 5A e 5B, as expressões de proteínas clivada do PARP clivada pela caspase-3 e foram-regulada por ambos

125I radiação sementes CLDR e

radiação de raios γ de 60Co HDR. Além disso, os níveis de clivada pela caspase-3 e PARP clivada pela expressão foram muito superiores, em A549 e células H1299 que tinham sido submetidas a

125I radiação sementes CLDR do que naqueles que foram submetidos a

60Co HDR γ- radiação de raios. No entanto, nenhuma diferença foi evidente nos níveis de clivada pela caspase-3 e proteínas de PARP clivada entre as células BEAS-2B expostas a

radiação 125I sementes CLDR,

60Co HDR radiação de raios γ e radiação simulada (Fig 5C ).

Um dos resultados representativos de três experiências independentes com resultados idênticos é mostrado.

Discussão

neste estudo,

125I radiação sementes CLDR levou a mais A549 notável e inibição do crescimento celular H1299 do que

60Co HDR radiação de raios γ, o que é consistente com os resultados de outras investigações [21]; No entanto, a diferença não era significativa com 2 Gy para os dois tratamentos de radiação. Nós também vimos claramente que a radiossensibilidade era A549 H1299 BEAS-2B, que está de acordo com os resultados relatados por Masahiko Nishizaki et al. [22]. Os nossos resultados também sugerem que as células BEAS-2B são resistentes a irradiação relativamente a células A549 e H1299.

é bem sabido que cada fase do ciclo celular contém pontos de controlo que permitem a paragem da progressão do ciclo celular, quer activar mecanismos de reparação ou ativar a cascata apoptótica celular e morte celular após dano ao DNA induzido por fatores IR ou outras [23, 24]. Em nosso estudo, significativa G

1 prisão de células A549 foi induzida mais por

radiação 125I sementes CLDR que por

60Co radiação de raios γ HDR a 4, 6 e 8 Gy, o que é consistente com outros estudos que pancreáticas avaliadas e próstata células cancerosas [25, 26]. No entanto, devemos notar que houve também algumas diferenças. Por exemplo, Junjie Wang informou que

125I sementes de radiação CLDR levaram a longo prazo G

2 /M detenção de células A549 a 4 Gy com uma taxa de dose inicial de 2,77 cGy /h [21], que está em contrastam com a significativa G

1 prisão com uma taxa de dose inicial de 18,32 cGy /h observado em nosso estudo. A diferença na taxa de dose inicial e uma variedade de outros factores tais como o estado de células podem, pelo menos em parte, responsáveis ​​por esta diferença. Os mecanismos específicos subjacentes a este fenómeno são desconhecidas. No entanto, houve L

2 /H prisão em células H1299 e BEAS-2B que receberam o mesmo tratamento. Geyer e colegas de trabalho relataram G

1 prisão em células A549 e G

2 /M detenção em H1299 células sob as mesmas condições de irradiação, e nenhum G

1 prisão foi observada em células tratadas com IR que falta p53 [27]. Estes resultados são semelhantes aos resultados do presente estudo. Embora não foi significativa L

2 /H prisão de células normais de BEAS-2B, a extensão de G

2 /H prisão provocada pelas duas fontes de radiação foi semelhante, o que é consistente com a capacidade de formação de colónias observadas em o presente estudo.

a apoptose, também conhecida como morte celular programada, é o principal mecanismo de morte celular induzida por IR. Para manter a integridade genómica, múltiplas vias de reparação do ADN de sinalização e são activadas em resposta a danos induzidos pela radiação controlos do ciclo celular checkpoint, mas se estes processos de reparação falhar ou danos irreparáveis ​​se acumula a um certo grau, é induzida a apoptose ou morte celular de células [10] . De acordo com nossas observações,

125I radiação sementes CLDR levou a uma percentagem mais elevada de A549 apoptótica e H1299 células do que fez

radiação de raios γ de 60Co HDR, enquanto o rácio de apoptose de células BEAS-2B induzidas pelas duas fontes de radiação a 2, 4, 6 e 8 Gy foi semelhante à das células de controlo, que foi consistente com outros estudos [19]. Em nosso estudo, a diferença entre os resultados obtidos usando

125I radiação sementes CLDR e

60Co radiação gama HDR ray pode parecer surpreendente. Para x ou raios y, taxa de dose está entre os principais fatores que determinam as consequências biológicas de uma determinada dose absorvida; como a taxa de dose é reduzida e o tempo de exposição prolongado, o efeito biológico da dose administrada é geralmente reduzida [28]. No entanto, quando a taxa de dose é reduzida para menos de 1 Gy /h, a diminuição da taxa de dose pode resultar num aumento da morte celular; este efeito tem sido foi denominado um efeito taxa de dose inversa e uma dose baixa de hiper-radiossensibilidade (HRS) [29].

No nosso estudo, os resultados obtidos utilizando um ensaio de sobrevivência clonogénica, análise do ciclo celular e celular análise de apoptose utilizando FCM sugeriu que as diferenças entre o grupo de tratamento com radiação e testado o grupo de controlo em branco não foram significativos a 2 Gy; portanto, nós nos concentramos sobre os mecanismos moleculares subjacentes potenciais o efeito anti-proliferativo mais distinto de

radiação 125I sementes CLDR comparação com

radiação de raios γ de 60Co HDR em 4 e 8Gy.

A apoptose mais comumente ocorre através da via intrínseca dependente de mitocôndrias, que é um processo complexo que envolve uma série de proteínas relacionadas com a apoptose, incluindo caspase-3, PARP, Bax e Bcl-2 et al. [11]. A função da proteína Bcl-2, também conhecida como proteína pro-sobrevivência de Bcl-2, é para inibir a apoptose e prolongar a sobrevivência das células. A sobre-expressão da proteína Bcl-2 está associado com uma resposta fraca ao tratamento do cancro do pulmão [30]. Bax, uma proteína pro-apoptótica da família Bcl-2, desempenha um papel fundamental na mediação da resposta apoptótica [12]. A proporção de Bcl-2 para o Bax é geralmente considerada um factor determinante na iniciação de apoptose [31]. proteína caspase-3 é a proteína mais importante verdugo. A função da PARP é a reparação de danos no DNA de rotina, e PARP é o principal substrato da caspase-3. Portanto, a activação de proteínas de caspase-3 e PARP foram geralmente consideradas as características bioquímicas da apoptose [30, 32]. No nosso estudo, o desequilíbrio entre a proteína Bcl-2 e a proteína BAX e os níveis mais elevados de clivada pela caspase-3 e proteínas de PARP clivada pode, em parte, promoveram o aumento da apoptose observada em células A549 e H1299 após a irradiação com

sementes 125I em comparação com os raios y-

60Co. Para uma célula sobreviver ao dano letal de LAP de ADN que é causado pela exposição a irradiação deve ser rapidamente detectado, e os mecanismos de reparação de ADN deve ser iniciado. Alguns investigadores demonstraram que uma maior morte celular é provocada pela activação ineficiente ou uma activação mais baixa do gene (ATM) danos no ADN sensor de ataxia mutada-telangiectasia em células irradiadas a taxa de dose baixa (LDR) de radiação em comparação com a taxa de dose elevada (HDR) radiação mesmo quando o ADN já tiver sido danificado. Além disso, as vias de reparação do MTA-associados não pode ser activado após a irradiação por radiação LDR [33, 28]. RI é conhecido por causar L

2 /M, ou L

1 prisão e para induzir a apoptose em células irradiadas [19]. No entanto, no presente estudo, os dois tratamentos de radiação induzida uma ligeira diminuição da fração de sobrevivência e significativa G

2 /M detenção, mas não conseguiu induzir a apoptose significativa em células BEAS-2B.

Conclusões

Em resumo, os nossos resultados demonstram que

radiação 125I sementes CLDR leva à inibição do crescimento mais notável de A549 e H1299 células do que a de

radiação de raios γ de 60Co HDR. Descobrimos também que as células A549 foram os mais sensíveis à radiação, seguido por células H1299, enquanto que as células BEAS-2B foram mais resistentes aos tratamentos de radiação do que dois A549 e células H1299. Além disso, este estudo mostrou que um desequilíbrio do rácio de Bcl-2 /Bax e a activação de caspase-3 e PARP proteínas pode explicar, em parte para o efeito anti-proliferativa induzida em células A549 e por H1299

radiação 125I CLDR sementes. No entanto, este estudo apenas se concentrou em eventos relacionados à apoptose e não se concentrar em profundidade sobre os pontos de verificação de reparação de danos ao DNA e do ciclo celular, devido a limitações de tempo e de financiamento. No entanto, nossos dados ilustram alguns efeitos radiobiológicos fundamentais em células NSCLC quando submetido a

radiação 125I sementes CLDR.

Informações de Apoio

S1 Dataset. As frações de sobrevivência de A549, as células H1299 e BEAS-2B depois

radiação 125I sementes CLDR e

60Co HDR radiação γ-ray

doi:. 10.1371 /journal.pone.0133728.s001

(DOC )

S2 Dataset. A distribuição do ciclo celular após a irradiação com

sementes de 125I e

raios y 60Co. (%)

Doi: 10.1371 /journal.pone.0133728.s002

(DOC)

S3 Dataset. Os rácios apoptóticos de A549, as células H1299 e BEAS-2B após a irradiação com

sementes de 125I e

raios y 60Co. (%)

Doi: 10.1371 /journal.pone.0133728.s003

(DOC)