Abstract

A expressão do fator potenciador linfóide 1 (LEF1) é freqüentemente alterada em diferentes cancros humanos. Este estudo teve como objetivo avaliar a expressão LEF1 em tecidos de câncer de cólon e explorar fenótipos alterados, expressões de genes, e ao possível mecanismo depois de derrubado LEF1 expressão em linhas celulares de cancro do cólon. Um total de 106 do cancro do cólon e tecidos normais correspondentes paratumorous foram usadas para avaliar a expressão de LEF1 usando imuno-histoquímica e de qRT-PCR. LEF1 lentivírus foi usada para knockdown expressão LEF1 para a avaliação da viabilidade celular, a distribuição do ciclo celular, apoptose, e expressão dos genes. O ensaio do mouse xenotransplante nu foi realizada para detectar os efeitos da LEF1 knockdown

in vivo

. Os dados mostraram que os níveis de mRNA e proteína de LEF1 foram significativamente aumentados em tecidos de cancro do cólon humano em comparação com os tecidos normais paratumorous combinados e foram associadas com a profundidade de infiltração, nódulo linfático e metástases distantes, estágios avançados sistema TNM (tumor-nódulo-metástase), e sobrevivência global mais curto. Além disso, LEF1 knockdown reduzida viabilidade das células de tumor, a capacidade de invasão, MMP2 e MMP-9 de expressão, mas a apoptose induzida. ensaio do mouse xenotransplante Nude mostrou que LEF1 knockdown suprimida a formação de tumores e crescimento

in vivo

. Além disso, a expressão de proteínas relacionadas Notch-pathway RBP-jκ e HES1 foi reduzida em células de knockdown LEF1. Tomados em conjunto, proteína LEF1 foi sobre-expresso em tecidos de cancro do cólon e knockdown de expressão LEF1 inibiu o crescimento do câncer de cólon

in vitro

e

in vivo

. Estes dados sugerem que a segmentação de expressão LEF1 deve ser avaliada para a prevenção e tratamento do câncer de cólon

Citation:. Wang W-J, Yao Y, Jiang L-L, Hu T-H, Ma J-Q, Liao Z-J, et al. (2013) Knockdown do fator Linfóide Enhancer 1 Inibe Colon Cancer Progressão

In Vitro

e

In Vivo

. PLoS ONE 8 (10): e76596. doi: 10.1371 /journal.pone.0076596

editor: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, China

Recebido: 31 de maio de 2013; Aceito: 03 de setembro de 2013; Publicação: 02 de outubro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Wang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da National Natural Science Foundation da China (No.81001090) (https://www.nsfc.gov.cn/nsfc/cen/xxgk/slzz.html).The~~number=plural financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo , coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Nenhum financiamento externo adicional foi recebida para este estudo

Conflito de interesses:. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O cancro do cólon é uma das mais comuns. câncer em homens e mulheres no mundo, representando a segunda causa de morte por câncer nos Estados Unidos [1,2] ea quarta na China [3]. Assim, o cancro do cólon continua a ser um grande problema de saúde pública global, embora não haja um declínio significativamente em todo o mundo na mortalidade relacionada com o cancro do cancro do cólon ao longo das últimas décadas, devido ao considerável progresso no diagnóstico precoce e tratamentos eficazes. Até à data, a patogênese e mecanismo molecular responsável para o desenvolvimento do cancro do cólon tem sido amplamente estudado e um grande corpo de conhecimento foi gerado em relação às alterações moleculares associados a carcinogénese do cólon, o que envolve a activação de oncogenes e silêncio de genes supressores de tumor [4]. No entanto, muito mais precisa ser feito para a compreensão precisa da carcinogênese do cólon e desenvolver novas estratégias para controlar eficazmente esta doença.

Para este fim, a nossa investigação está se concentrando em linfóide factor-1 (LEF1) de ligação potenciador , um membro da família de proteínas grupo de alta mobilidade (HMG).

LEF1

codifica uma proteína nuclear de 48 kD, que é normalmente expressa em células T [5,6] pré-B e e desempenha um papel importante na embriogénese e desenvolvimento do cancro [7]. LEF1 é uma proteína multifuncional que influencia inúmeras funções celulares, como a regulação da sinalização Wnt para a proliferação celular, apoptose, mobilidade e transcrição de genes [8,9]. expressão alterada da proteína de LEF1 tem sido referida como estando envolvida na tumorigénese de diferentes cancros humanos, incluindo o cancro do cólon [10]. Molecularmente, LEF1 pode mediar a expressão de genes via de sinalização Wnt recrutamento de β-catenina para o promotor dos genes-alvo [11,12], mas em si LEF1 falta o seu próprio potencial de activação da transcrição em células. LEF1 proteína contendo domínios de ligação β-catenina pode regular a proliferação celular e a invasão de células tumorais [13]. Vários fatores podem influenciar a expressão LEF1, tal como o factor-2 de crescimento de fibroblastos, PITX2 e fator de crescimento de hepatócitos [14-16].

Assim, neste estudo, foi detectado pela primeira vez LEF1 expressão em tecidos de câncer de cólon em comparação com os tecidos do cólon paratumorous e, em seguida, investigaram os efeitos da LEF1 knockdown na regulação da viabilidade das células do cancro do cólon, a distribuição do ciclo celular, apoptose e expressão do gene

in vitro Comprar e em xenoenxertos nu do rato. Nós também explorou os efeitos da LEF1 knockdown na regulação da via de Notch.

Declaração de Ética Materiais e Métodos

O estudo foi aprovado pela conduta da Comissão de Ética Humana Primeira Affiliated Hospital, faculdade de Medicina da Universidade de Xi’an Jiaotong. consentimentos informados por escrito foram obtidas de todos os pacientes.

O animal protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso Animal da Faculdade de Medicina da Universidade de Xi’an Jiaotong.

Pacientes e amostras

neste estudo, retrospectivamente recrutados 106 pares de câncer de cólon ressecado cirurgicamente e amostras de tecidos normais paratumorous (5 cm de distância da lesão tumoral) da primeira Affiliated Hospital, faculdade de Medicina da Universidade de Xi’an Jiaotong entre janeiro de 2006 e março de 2007. Estas amostras de tecido foram obtidos a partir de 60 do sexo masculino e 46 do sexo feminino, com idade média de 55,5 anos (variando de 30 a 81 anos). características clinicopatológicas desses pacientes são mostradas na Tabela 1. diagnóstico patológico destas amostras foi independentemente confirmada por dois patologistas de forma cega. Todos os pacientes que não foram tratados com qualquer quimioterapia ou radioterapia antes da cirurgia. Os últimos paciente follow-ups foram realizadas no final de Maio de 2012. Os pacientes que foram perdidos para follow-up ou morte de outros do que o cancro do cólon causas foram consideradas como dados censurados durante a análise de sobrevivência. Variáveis ​​clínicopatológicos

N

pontuação expressão LEF1 (média ± SD)

P valor

Idade (anos) 60.414,87 ± 2.330.502≥60655.21 ± 2.65Tumor differentiationWell504.84 ± 1.940.274Moderate394. 95 ± 2.87Poor175.59 ± 3.02Infiltration depthT

1 + T

2.404,12 ± 1.980.002T

3 + T

4.665,66 ± 2.56Lymph metástase N

0.464,06 ± 2,12 0,001 N

1-3605,85 ± 2.74Distant metastasisM

0.864,69 ± 2.040.004M

1.206,31 ± 2.77TNM stageI81.39 ± 3,23 0.001II334.14 ± 2.40III455.33 ± 2.25IV207.12 ± 2.69Table 1 . Associação de expressão LEF1 com fatores clínico-patológicos de pacientes.

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seções histopatologia e imunohistoquímica

parafina-encaixados (5 mm) foram desparafinados e reidratadas através de uma série de álcoois graduados. Para imuno-histoquímica, foi utilizado um anticorpo primário contra LEF1 (C12A5, Cell Signaling Technology, Danvers, MA) a uma diluição de 1: 100, e incubados durante a noite a 4 ° C. As secções foram incubadas com um anticorpo de controlo de isotipo coincidente como um controlo negativo. Em seguida, as secções foram coradas com um anticorpo secundário conjugado com biotina e a cor foi desenvolvida usando 0,05% de 3 ‘, 3’-diaminobenzidina tetracloridrato seguido de contracoloração com hematoxilina. As seções foram finalmente revisto e marcou com um microscópio Olympus (BX41; Tóquio, Japão), de acordo com um estudo anterior, utilizando multiplicando a pontuação intensidade e a extensão da marcação com [17]. A intensidade da coloração foi pontuada como 0 (sem coloração), 1 (coloração fraca), 2 (coloração média) ou 3 (coloração forte). O grau de coloração foi avaliada através da atribuição de pontuação de amostras com base na percentagem de células coradas positivamente como se segue: 0 (0%), 1 (1-25%), 2 (26-50%), 3 (51-75%) , e 4 (76-100%). O número de células positivas foi avaliada através da contagem de 10 campos aleatórios no × 400 de ampliação. A pontuação final foi variou de 0 a 12. A pontuação de 0-2 foi definida como expressão negativa, a pontuação 3-5 como “fraca expressão”, a pontuação 6-9 como “expressão moderada” e pontuações 10-12 como “forte expressão “. Para efeitos de posterior análise as amostras com pontuação 0-5 foram definidas coloração ou perda de expressão LEF1 como marcadamente reduzida, enquanto que as amostras com contagens de 6-12 foram agrupadas e definida como expressão positiva.

em tempo real transcrição-polymerase chain Reaction

o ARN celular total foi isolado a partir de tecidos e linhas celulares, utilizando o reagente TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA) reverso, de acordo com as instruções do fabricante. Estas amostras de ARN foram então transcritas reversamente em ADNc utilizando um kit de RT-PCR (Takara, Dalian, China). PCR em tempo real foi realizada em seguida IQ5 multi-cor Sistema de PCR em tempo real de detecção (Bio-Rad, Hercules, CA) utilizando SYBR Premix Ex Taq TM II (Takara). As sequências iniciadoras para amplificar LEF1 foram: 5′-AGCGAATGTCGTTGCTGAGTGTA-3 ‘e 5′-CTCTTGCAGACCAGCCTGGATAA-3’. Um gene GAPDH de limpeza foi usado como controlo interno, e as sequências dos iniciadores eram 5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3 ‘e 5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’. Os dados foram adquiridos como um ciclo limiar (

t Sc) valor. O

valores Sc t foram determinados subtraindo a média gene housekeeping C interna

valor t da média gene alvo C

valor de t. Uma vez que a eficiência de amplificação dos genes alvo e o gene de controlo interno foi igual, a expressão do gene relativo foi calculado usando a

-ΔΔCt método 2. Cada medida foi realizada em triplicado.

Construção de vetor lentivírus transportando LEF1 shRNA

A lentivírus vetor LEF1 shRNA (U6-vshRNA-CMV-PUR-GFP-GV248-shLEF1) foi projetado, sintetizado e construído por Genechem Co. (Shanghai, China). As seguintes sequências alvo no gene LEF1 humana foram selecionados, ou seja, o alvo 1, GCTGACATCAAGTCTTCCTTG; alvo 2, GTGAAGAGCAGGCTAAATATT; Meta 3, GCTGGTCTGCAAGAGACAATT; e direcionar 4, GCTCA TTCCCAACGTGCAAAG. Alvo 3 foi escolhida para as experiências subsequentes. O vector de lentivírus U6-vshRNA-SHNC, que codifica para uma sequência aleatória de RNAi, foi utilizado como um controlo negativo.

As linhas de células, a cultura, a transfecção de genes e tratamentos

linhas celulares de cancro do cólon humano, Caco

2, Colo205, HCT116, HT29, e Lovo foram obtidos a partir celular Resource Center, Institutos de Xangai de Ciências Biológicas (Xangai, China) e cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Hyclone, Logan, UT, EUA) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS; Invitrogen), penicilina (100 UI /ml) e estreptomicina (0,1 mg /ml) em 5% de CO

2 a 37 ° C. Uma linha celular de cancro do cólon humano SW480 foi cultivada em meio RPMI 1640 (Hyclone, Logan, UT, EUA) suplementado com 10% de FBS, penicilina (100 UI /ml) e estreptomicina (0,1 mg /ml) em 5% de CO

2 a 37 ° C, enquanto a outra linha de células de cancro do cólon humano, SW620, foi cultivada em meio L-15 (Invitrogen) suplementado com 10% de FBS, penicilina (100 UI /ml) e estreptomicina (0,1 mg /ml) em 5 % de CO

2 a 37 ° C. células SW480 e SW620 foram infectados com vectores lentivírus a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 10 e 100, respectivamente, e, em seguida, seleccionados em meio de crescimento contendo puromicina. Após 7 dias de cultura, as colónias resistentes puromicina foram apanhados, expandidos e analisados ​​separadamente

γ-secretase DAPT inibidor (100 uM; Sigma-Aldrich, EUA). Foi utilizado para ensaios de inibição farmacológica, que pode eficazmente bloco Notch domínio intracelular (NICD) de entrar no núcleo da célula. Em resumo, as células foram semeadas em placas de seis poços e tratadas com 2 ml de meio contendo 1% de FBS e DAPT. As células de controlo foram tratados com quantidades iguais de sulfóxido de dimetilo (DMSO). Após 48h de incubação, prepararam-se os extractos celulares por Western blot, conforme descrito abaixo.

Extracção de proteínas e Western blot

A proteína foi extraída a partir de tecidos e células, e estes lisados ​​de proteína foram separadas por 6% de electroforese em gel de poliacrilamida de dodecilsulfato de sódio a 12%; proteínas separadas foram então electronicamente transferidos para membranas de difluoreto de polivinilideno (Millipore, Danvers, MA). As membranas foram então bloqueados e subsequentemente incubadas com os anticorpos primários seguintes: anticorpo anti-LEF1 (1: 800; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), anti-MMP2 (1: 500; Cell Signaling Tecnologia, Danvers, MA), anti -MMP7 (1: 100; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anti-MMP9 (1: 100; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anti-NICD (1: 800; Cell Signaling Technology), anti- RBP-jκ (1: 100; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anti-HES1 (01:50; Santa Cruz Biotechnology), ou anticorpo anti-actina β (1: 1000; Santa Cruz Biotechnology). No passado, as manchas foram visualizadas por um sistema de detecção de ECL (Millipore) com um anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano (Santa Cruz Biotechnology). As transferências de Western foram repetidos três vezes para cada amostra de proteína.

A viabilidade celular MTT

As células (5 × 10

3 por poço) foram cultivadas com 200 ul de meio de crescimento numa 96 placa -bem e cresceu até 7 dias. No final das experiências, 3- [4,5-dimetiltiazol-2-il] -2,5-difenil-tetrazólio (MTT, 0,5 mg /mL, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) foi adicionados a cada poço. As células foram então cultivadas a 37 ° C durante 4h, e 150 ul de DMSO foi adicionado a cada poço e misturou-se por agitação à temperatura ambiente durante 10 min. Depois disso, a taxa de absorção foi medida a um comprimento de onda de 490 nm utilizando um espectrofotómetro. Cada experimento foi realizado em triplicado e repetidos pelo menos três vezes.

A citometria de fluxo ensaios de ciclo celular e apoptose

Para a análise do ciclo celular, as células (5 × 10

5) foram cultivadas e recolhido, lavado duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS), e fixadas com gelo frio de 70% de etanol durante 24 h a 4 ° C. As células fixadas foram coradas com iodeto de propídio a 150 ul e 150 ul de ARNase A (Sigma-Aldrich) sequencialmente. Após incubação durante 30 min a 37 ° C, as amostras foram analisadas por um citómetro de fluxo (FACS calibre, Franklin Lakes, NJ), e software de busca celular foi usado para analisar os dados. Cada experiência foi repetida pelo menos três vezes.

Para a análise da apoptose, as células (5 × 10

5 por poço) foram cultivadas em placas de seis poços, recolhidas, e lavadas duas vezes com PBS gelado. Em seguida, 500 ul de tampão de ligação, 5 jil de anexina V-APC, e 5 ul de 7-AAD (KEYGEN Biotech, Nanjing, China) foram sequencialmente adicionados às amostras. Após mistura e incubação durante 15 min a 37 ° C, as amostras foram corridas na citometria de fluxo imediatamente. Cada experimento foi repetido pelo menos três vezes.

células tumorais Matrigel ensaio de invasão

A capacidade de invasão das células cancerígenas do cólon foi avaliado usando uma câmara de invasão Millicell (Millipore, Billerica, MA, EUA) . As inserções de poro de 8 um foram revestidas com Matrigel (Becton Dickinson e Company, Franklin Lakes, NJ, EUA). As células (5 × 10

4) foram re-suspensas com 200 uL de meio isento de soro com 5 ug /ml de mitomicina C (Sigma-Aldrich) para a câmara de topo e da câmara inferior foi preenchida com o meio de cultura normal. Após incubação durante 24 h, as células não invasoras sobre a superfície superior foram removidas com uma cotonete e as células invasoras sobre a superfície inferior do filtro foram fixadas em metanol, coradas com 0,1% de violeta de cristal e contadas sob um microscópio usando 10 campos selecionados aleatoriamente em uma ampliação de 200x

rato Nude ensaio de xenoenxerto de células tumorais

Homem BALB /c ratos pelados (idades entre 4 e 6 semanas;. Shanghai Centro Experimental animal, Xangai, China) foram inoculadas por via subcutânea com 1 × 10

7 células e alojados em uma instalação livre de patógenos do Centro animal de Xi’an Jiaotong University. O volume do tumor foi determinado pelo comprimento (L) e a largura (W), medida com um compasso de calibre de deslizamento e calculado como L x W

2 × 0,5. Os ratinhos foram sacrificados 45 dias após a injecção subcutânea de células tumorais. Tumor rolamento ratinhos nus foram observados por sistema de imagem IVIS (espectro IVIS, Xenogen, CA, EUA) antes de serem sacrificados.

A análise estatística

Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o software SPSS 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL). Os dados descritivos foram analisados ​​com o teste do qui-quadrado de Pearson (frente e verso). Os dados de medição foram analisados ​​com o estudante de

t

-teste ou análise de variância (ANOVA). A

valor P

inferior a 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

expressão LEF1 em tecidos de cancro do cólon humanos e linhas celulares

Neste estudo , determinamos primeira expressão da proteína LEF1 em tecidos de cancro do cólon humanos e linhas celulares utilizando imuno-histoquímica. Os resultados mostraram que 71 de 106 tecidos do cólon e 23 de 106 paratumours tecidos de cólon normais expressa a proteína LEF1, indicando que os tecidos de câncer de cólon expressaram níveis mais elevados de LEF1 do que aqueles nas paratumours tecidos do cólon normal (

P Art 0,05; Figura 1A). Obviamente, LEF1 expressão foi observada nos núcleos em tecidos de cancro do cólon e paratumours tecidos do cólon normal (Figura 1A). Além disso, a expressão da proteína LEF1 foi associado com profundidade de infiltração, linfonodo e metástases à distância e estágios do câncer de cólon TNM avançada (tumor-nódulo-metástase) (

P Art 0,01; Tabela 1). A análise de sobrevivência (5-year follow-up de 106 pacientes com câncer de cólon) mostrou que a taxa média de sobrevivência de pacientes com LEF1 expressa tumor foi de 48,5 meses, o que foi significativamente mais pobres do que aqueles com LEF1-negativos tumores (mais de 60 meses) (

P Art 0,05; Figura 1B)

(A) coloração imuno-histoquímica de LEF1 sobre os tecidos do cólon paratumorous (A) e tecidos de cancro do cólon (bd) (barra de escala, 25 um):. ( a) expressão negativa, (b) a expressão fraco, (c) a expressão moderada, (d) forte expressão. (B) curva de Kaplan-Meier para a associação da expressão de proteínas com LEF1 sobrevivência global dos doentes. (C) qRT-PCR foi utilizado para detectar os níveis de expressão relativa de ARNm de LEF1 (cc tecidos: tecidos de cancro do cólon; tecidos normais: Os tecidos do cólon paratumorous). Colunas, média (n = 106); bares, SD; ***

P Art 0,001 em comparação com os tecidos do cólon paratumorous.

P

valor foi determinado pelo aluno de

t

-teste. (D) Análise de Western blot de expressão LEF1 em sete células de câncer colorretal (Caco

2, Colo205, HCT116, HT29, Lovo, SW480 e SW620). β-actina foi utilizada como controlo interno.

De modo semelhante, a análise por PCR em tempo real mostraram que os níveis de ARNm de LEF1 foram significativamente aumentados nessas 106 pares de tecidos de cancro de cólon em comparação com os tecidos normais de cólon paratumours (

P Art 0,05; Figura 1C). Além disso, a expressão LEF1 foi altamente expressa em linhas celulares de cancro do cólon SW480 e SW620 (Figura 1D). Assim, escolhemos estas duas linhas celulares para knockdown expressão LEF1 para um estudo mais aprofundado.

knockdown Estável de expressão LEF1 em células de cancro do cólon

Para explorar o papel da LEF1 em células cancerígenas do cólon, utilizamos um lentivírus transportando LEF1 shRNA para infectar SW480 e SW620 para knockdown de expressão LEF1. Alvo 3 foi utilizado para estabelecer os LEF1 knockdown linhas celulares estáveis. Obtivemos sucesso células knockdown LEF1 estável denominado shLEF1 e SHNC (com vector de controlo negativo). a análise por PCR em tempo real mostraram que a expressão de ARNm de LEF1 foi inibida até 70% em células shLEF1 em comparação com células SHNC (

P

0,05; Figura 2A). Do mesmo modo, os níveis de proteína LEF1 também foram derrubados significativamente em células do que em células shLEF1 SHNC (Figura 2B).

(A) análise de qRT-PCR da expressão LEF1 após infecção de diferentes vectores de expressão lentivirus LEF1 shRNA, *

P

0,05 em comparação com a célula mãe. (B) Análise Western blot da expressão da proteína LEF1. β-actina foi utilizada como controlo interno. 1-4 (vetores posição alvo diferentes) e SHNC (controle negativo). Meta 3 foi usado para estabelecer as LEF1 knockdown linhas celulares estáveis.

Knockdown de expressão LEF1 inibiu a viabilidade das células cancerígenas do cólon

in vitro

e tumor formação e crescimento

in vivo

estáveis ​​transfectantes LEF1 shRNA foram semeadas e cultivadas em meio de crescimento contendo puromicina para a avaliação da viabilidade celular. Os nossos dados mostraram que as células SW480-shLEF1 e células SW620-shLEF1 cresceram muito mais lentamente do que as células SW480-SHNC e células SW620-SHNC, respectivamente, (

P

0,01; Figura 3A). a distribuição do ciclo celular detectada por um citómetro de fluxo mostrou um atraso prolongado e proeminente da progressão da fase G0 /G1 para a fase S na fase de células shLEF1 comparada com a de células SHNC (

P

0,01; Figura 3B e 3C). Além disso, analisou-se ainda se a viabilidade celular do tumor é reduzido devido à indução de apoptose e descobriram que as células SW480 e SW620 com transfecção estável LEF1 shRNA tinham significativamente mais apoptose em comparação com as células de controlo (Figura 3D e 3E).

(A) ensaio de MTT. **

P

0,01, quando comparada com as células correspondentes SHNC. (B e C) fluxo de distribuição do ciclo celular por citometria. Colunas, média (n = 3); bares, SD; **

P

0,01, quando comparada com as células correspondentes SHNC. (D e E) Fluxo ensaio de apoptose por citometria. Apoptose espontânea celular foi avaliada por citometria de fluxo. Colunas, média (n = 3); bares, SD; ***

P Art 0,001 em comparação com as células SHNC controle

Além disso, foi realizado um ensaio de rato xenotransplante nu para avaliar o papel da LEF1 knockdown

in vivo.

. Quarenta e cinco dias após injecção de células tumorais, xenoenxertos LEF1 knockdown-tumorais mostraram uma redução do crescimento tumoral em comparação com xenoenxertos de tumor de controlo-SHNC. Além disso,

in vivo

de imagem mostraram que os dois tipos de ratos não têm metástases tumorais observáveis ​​aos órgãos distantes (Figura 4A). Os volumes médios da massa de tumor derivado de células SW480-shLEF1 e células SW620-shLEF1 foram muito menores do que os dos xenoenxertos de tumor derivado de células SW480-SHNC e células SW620-SHNC, respectivamente (

P

0,001 ; Figura 4B). O peso do tumor, também mostrou que a expressão do knockdown de LEF1 inibiu o crescimento de células de cancro do cólon em ratinhos nus (Figura 4C), porque o peso dos tumores de massa em SW480 e células SW620 que expressam shLEF1 foi significativamente mais leves do que aqueles nos ratinhos de controlo. Estes achados sugerem que LEF1 formação knockdown inibida e crescimento de xenoenxertos de tumor in vivo.

(A)

Em

vivo

análise de imagem. Crescimento de tumores formados por células shLEF1 e controle de células SHNC em ratinhos nus foi fotografada por IVIS. (B) O volume do tumor foi medido a cada 3 dias desde o dia 9 após a inoculação do tumor medindo o comprimento e largura. Colunas, média (n = 6); bares, SD; ***

P Art 0,001 em comparação com as células SHNC controle. (C) O peso do tumor foi comparado no dia 45 após inoculação das células tumorais. Colunas, média (n = 6); bares, SD; ***

P

. 0,001 comparado ao controle SHNC

Knockdown de expressão LEF1 diminuiu invasão das células cancerígenas do cólon e expressão de MMP-2 e MMP-9

Depois disso, determinou-se o efeito de LEF1 knockdown sobre a regulamentação da invasão de células do cancro do cólon usando o ensaio de invasão Matrigel. Nós tratado as células com mitomicina C para eliminar a influência do aumento da proliferação. Os resultados mostraram que os números de invadir células SW480-shLEF1 e células SW620-shLEF1 foram muito mais baixas do que a de células SW480-SHNC e células SW620-SHNC (

P

0,01; Figura 5A e 5B). Além disso, knockdown de expressão LEF1 poderia diminuir significativamente os níveis de MMP-2 e MMP-9 de proteína, mas não a MMP-7 de proteínas em células shLEF1 comparada com a de células de cancro do cólon SHNC (Figura 5C).

( A e B) ensaio de invasão de células tumorais. imagens de coloração representativas, × 200. A análise quantitativa das células tumorais invadiram entre LEF1 knockdown e as células controle. Colunas, média (n = 3); bares, SD; **

P

0,01 em comparação com as células de controlo SHNC. (C) análise de transferência de Western de MMP2, MMP-7 e MMP-9 de proteína. β-actina foi utilizada como controle interno.

Knockdown de expressão LEF1 inibiu a atividade da RBP-jκ

Até agora, vários estudos têm relatado que Wnt e Notch via de controlar a proliferação celular e cooperativamente tumorigénese nos intestinos [18]. Para divulgar os possíveis pontos de convergência e esclarecer o mecanismo potencial pelo qual LEF1 regula a proliferação e tumorigênese, detectamos a expressão do domínio intracelular de Notch (NICD) /RBP-jκ /HES1 genes da via nessas células cancerígenas do cólon. Nós não encontramos nenhuma diferença significativa nos níveis de expressão NICD em células cancerígenas do cólon com diferentes tratamentos; No entanto, os níveis de proteínas e RBP-jκ HES1 foram reduzidas em células SW480-shLEF1 e células SW620-shLEF1 em comparação com células de controlo (Figura 6A).

(A) análise de transferência de Western de baterias de NiCd, RBP-jκ e expressão Hes1. (B) análise por Western blot da expressão LEF1 depois de ser tratado com DAPT inibidor da via do Notch (100 uM). β-actina foi utilizada como controle interno.

Os nossos dados não publicados mostraram um aumento da atividade do promotor de LEF1 de corpo inteiro em cima co-transfecção de NICD cDNA em SW480, HepG2, HEK293, A549 e células HeLa ; Assim, utilizou-DAPT, um inibidor da via do Notch, para bloquear a expressão NiCd SW480 e SW620 células. Nossos dados mostraram que NICD downregulation afetados expressão de proteínas HES1 e LEF1 (Figura 6B), sugerindo uma regulação recíproca entre LEF1 e Notch via.

Discussão

No estudo atual, primeiro analisou o expressão de mRNA LEF1 e proteínas em amostras de tecido de câncer de cólon e, em seguida, investigaram os efeitos da LEF1 knockdown na regulação da viabilidade das células tumorais alterados, a distribuição do ciclo celular, apoptose e expressão dos genes

in vitro Comprar e em xenoenxertos nus rato . Descobrimos que os níveis de mRNA e proteína de LEF1 estavam significativamente aumentados em tecidos de cancro do cólon e associada com a profundidade de infiltração, nódulo linfático e metástases distantes e sobrevivência global mais curto. LEF1 knockdown reduzida viabilidade de células de tumor, a capacidade de invasão, e expressão de MMP2 e MMP-9, mas a apoptose induzida em células de cancro do cólon. LEF1 knockdown suprimida a formação de tumores e crescimento em ratinhos nus. Além disso, a expressão de RBP-jκ e HES1 foi reduzida em células de knockdown LEF1. Estes dados sugerem que LEF1 poderia ainda ser avaliada como um alvo para prevenção e tratamento de câncer de cólon.

Estudos anteriores demonstraram que a expressão e ativação da proteína LEF1 contribuiu para o desenvolvimento de câncer [10,13,19]. Na verdade, o nosso estudo analisou a expressão de mRNA LEF1 e proteína no cancro do cólon e tecidos do cólon paratumorous e descobriu que LEF1 foi sobre-expresso em tecidos de câncer de cólon. Os níveis de expressão LEF1 foram associados com profundidade de infiltração, linfonodos e metástases à distância e estágios avançados TNM dos cancros do cólon, bem como pobres taxa de sobrevida global em doentes com cancro do cólon. Os últimos dados eram diferentes dos dados reportados pelas Kriegl, L et al [20], mas foram semelhante a outro estudo anterior [21]. Estes dados sugerem que LEF1 pode ser um marcador útil para a previsão da progressão do câncer de cólon.

Para entender melhor o papel da LEF-1 em cancro do cólon, nós derrubado LEF1 expressão em duas linhas celulares de cancro do cólon, SW480 e SW620. Nós exploramos ainda mais o papel de LEF1 no crescimento do cancro do cólon. desorganização ciclo celular foi definida como um indutor que levam a proliferação descontrolada de células e progressão do cancro seguido de tumorigénese, por exemplo, Shtutman et al identificaram que a ciclina D1 foi um dos genes alvo complexos β-catenina /LEF1 [22], que foi responsável para a proliferação de células tumorais e a progressão do tumor. Consistente com este estudo, os dados atuais mostraram que a regulação negativa da LEF1 proliferação de células do cancro do cólon inibiu significativamente a

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através do aumento da população sub-G1 apoptótica, prolongando a fase G0 /G1 e reduzindo fase G2 /S em LEF1-derrubado SW480 e SW620 células

in vitro Comprar e em xenoenxertos rato nu, que confirmaram dois outros estudos anteriores em endometrial humana e cancros do cólon [9,23].

Além disso, nosso atual LEF1 estudo mostrou que a sobre-expressão nos tecidos CRC primários foi associada com metástases distantes de pacientes de CRC, o que é consistente com vários estudos anteriores que documentam que LEF1 foi caracterizado como um biomarcador para a metástase do cancro do cólon para o fígado [21]. Na verdade, os nossos atuais

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dados confirmaram que knockdown de expressão LEF1 inibida capacidade invasão de SW480 e SW620 células em comparação com o controle de células shRNA-transf. Ao nível molecular, MMP2, MMP9 MMP7 e estão associados com o processo de migração celular, influenciando o desenvolvimento e progressão [24,25] cancro. Descobrimos que knockdown de expressão LEF1 MMP2 suprimida e MMP-9 de expressão, mas não MMP-7, o que indica que a modulação selectiva de MMP por LEF1 poderia ter o significado biológico na progressão do cancro do cólon. Em contraste, LEF1 foi capaz de regular a MMP-7 de expressão e actividade em células de cancro da mama [26], enquanto outro estudo anterior demonstrou que circula de MMP-2 e MMP-9 pode ser utilizado para potencialmente classificar os pacientes em baixo risco e alto risco, doença benigna e câncer de mama [24]. No entanto, o nosso ensaio de xenoenxerto de ratinho nu não mostra qualquer metástase tumoral, tanto no LEF-1 knockdown e os xenoenxertos de tumor de controlo; Assim, são claramente necessários estudos adicionais.

Além disso, a via Notch é frequentemente ativada em vários cancros humanos, tais como cancros do cérebro, glândulas mamárias, colo do útero, pulmão, cabeça e pescoço, cólon, rim, pâncreas e mielóide aguda [27,28]. A inibição de células tumorais induzidas caminho do entalhe para a apoptose e a proliferação de células de tumor reduzida no cancro colorectal [29]. Uma publicação recente demonstrou que a via Wnt foi capaz de regular o caminho do entalhe [30]. A conversa cruzada entre Notch e as vias de Wnt pode ser parcialmente mediada pela regulamentação específica da fosforilação Notch GSK-dependente de 3β. Fosforilação de proteínas Notch foi indiretamente correlacionados com a ativação Notch e translocação nuclear, bem como a transformação celular. Além disso, Jagged1, um dos ligandos de Notch, pode ser activado por p-catenina durante a formação ectópica do folículo de cabelo na epiderme adultos [31].