Abstract

O câncer de pâncreas é uma das principais causas relacionadas ao câncer de morte no mundo ocidental com uma necessidade urgente de novas estratégias de tratamento. Recentemente, hiperforina e nemorosona têm sido descritos como compostos de chumbo anti-cancro promissor. Enquanto hyperforin foi exaustivamente investigado

in vitro

e

in vivo

,

in vivo

dados para nemorosona ainda estão faltando. Assim, investigámos o potencial inibidor do crescimento de xenoenxertos de cancro da nemorosona no pâncreas em ratos NMRI nu /nu e determinados parâmetros farmacocinéticos básicos. tumores de xenoenxerto foram tratados com nemorosona e gemcitabina, o actual nível de cuidados. secções de tumor foram submetidos a H E, bem como de caspase 3 e Ki-67 coloração. NEMOROSONA cinética plasmática foram determinadas por HPLC e espectrometria de massa. Indução do CYP3A4 e outras enzimas que metabolizam por nemorosona e hyperforin foi testado em hepatócitos primários utilizando qRT-PCR. A uma dose de 50 mg /kg por dia nemorosona, foi observado um efeito inibidor do crescimento significativo em xenoenxertos de cancro pancreático. O composto foi bem tolerado e rapidamente absorvido pela corrente sanguínea com uma meia-vida de aproximadamente 30 min. Diferentes metabólitos foram detectados, possivelmente, assemelhando-se produtos de oxidação independente de CYP3A4. Concluiu-se que nemorosona é um potencial composto de chumbo anti-cancro com uma boa biodisponibilidade, poucos efeitos secundários e efeitos inibidores do crescimento promissores, representando, assim, um composto valioso para uma abordagem de terapia de combinação

citação:. Lobo RJ, Hilger RA, Hoheisel JD, Werner J, Holtrup F (2013)

In Vivo

Actividade e Farmacocinética de nemorosona no cancro do pâncreas xenoenxertos. PLoS ONE 8 (9): e74555. doi: 10.1371 /journal.pone.0074555

editor: Aamir Ahmad, Faculdade de Medicina da Wayne State University, Estados Unidos da América

Recebido: 07 de julho de 2013; Aceito: 02 de agosto de 2013; Publicação: 05 de setembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Wolf et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi financiado por uma bolsa de investigação 3 anos a partir da Escola Internacional de Helmholtz para pesquisa do Câncer de FH. Financiamento do Ministério Federal Alemão de Educação e Pesquisa, como parte do consórcio NGFN PaCaNet é reconhecido agradecimento. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Apesar de muitos avanços no campo da pesquisa e tratamento de câncer, câncer de pâncreas continua sendo um dos tumores mais difíceis, com a sua taxa de mortalidade quase alcançando a taxa [1] incidência. Isto é principalmente devido a dificuldades no diagnóstico de câncer pancreático em estágio resectable cedo e seu pronunciado quimio-resistência. Assim, mais de 80% dos pacientes apresentam tumor em fase avançada já metástases para os nódulos linfáticos regionais e o fígado [2]. Gemcitabina, o padrão atual de tratamento para câncer de pâncreas, apenas moderadamente melhora o tempo de sobrevida média entre 5 e 6 meses [3], enfatizando, assim, a necessidade de explorar novos compostos terapêuticos.

policíclicos acylphloroglucinols polyprenylated (PPAPs) são um a classe de compostos com actividades biológicas diversas variando de anti-depressivo, anti-cancro e anti-inflamatória a actividade anti-microbiana [4]. Entre eles, hyperforin (Figura 1), um remédio a partir de erva de São João (

Hypericum

perforatum

), ganhou interesse público como um anti-depressivo popular de origem natural com um novo mecanismo da acção [5]. Também tem sido demonstrado possuir propriedades anti-câncer

in vitro

e

in vivo

[6-8]. No entanto, através da ligação ao receptor pregnano X (PXR), hiperforina fortemente regula positivamente a expressão de CYP3A4, um membro da família do citocromo P450 envolvidas no metabolismo de xenobióticos [9]. Assim, se forem combinadas com medicamentos quimio-terapêuticos metabolizados por CYP3A4, hiperforina iria reduzir grandemente a eficácia de um potencial anti-cancro da abordagem de terapia de combinação, uma vez que acelera a metabolização da droga (s) é combinado com.

Intimamente estruturas químicas relacionadas de hyperforin (esquerda) e nemorosona (à direita), dois policíclicos acylphloroglucinols polyprenylated.

Ser estruturalmente relacionados com hyperforin, pronunciadas propriedades anti-câncer também tem sido demonstrada

in vitro

para nemorosona (Figura 1) em linhas de células de várias origens, entre as quais a leucemia e neuroblastoma [10,11]. Análises mais detalhadas de seu mecanismo de acção sobre as células cancerígenas pancreáticas mostrou uma elevação rápida dos níveis de cálcio cyctosolic e despolarização da membrana mitocondrial seguido pela activação de apoptose através de uma via de resposta de stress conhecido como a resposta a proteína desdobrada [12]. Interessantemente, as células normais diferenciadas foram encontrados para ser 10 vezes menos sensíveis a um tratamento com nemorosona, abrindo assim uma janela terapêutica potencial para explorar também a sua actividade anti-cancro

In vivo

.

neste estudo, demonstramos que, ao contrário hyperforin, nemorosona não induz CYP3A4 e investigar a sua actividade biológica, bem como farmacocinética básico

in vivo

em um modelo de xenoenxerto de cancro pancreático. É mostrado que nemorosona é rapidamente absorvido pela corrente sanguínea e capaz de inibir o crescimento de tumores de xenoenxerto.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de laboratório do National Institutes of Health. O protocolo foi aprovado pela Comissão de Ética de Experimentação Animal do Conselho Regional Karlsruhe, Alemanha (Permissão Número: G-204/09). Todos cirurgia foi realizada sob anestesia xilazina /cetamina, e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento.

Implantação e tratamento de tumores xenoenxerto

seis a oito semanas NMRI nu /ratinhos atímicos fêmea idoso nu nua (Charles River Laboratories, Sulzfeld, Alemanha) foram alojados em grupos de 4 a 6 no ventiladas individualmente gaiolas (IVCS; TECHNIPLAST, Alemanha) a 22 ° C com um 12 h ciclo claro /escuro e permitiu adaptar-se às condições de habitação para uma semana antes da implantação de tumores. MIA-PaCa-2 As células foram mantidas como descrito anteriormente [12], e 200 ul de uma suspensão de células (~ 2 x 10

6) foi injectado por via s.c. no flanco direito de cada rato para estabelecer tumores de xenoenxerto subcutâneo. O volume do tumor foi monitorado regularmente utilizando um paquímetro digital, e os animais foram organizadas aleatoriamente em grupos de tratamento e controle, uma vez a média do volume do tumor atingiu aproximadamente 100 milímetros

3.

nemorosona, purificada a partir de extratos de flores metanólicos conforme relatado anteriormente [ ,,,0],12], foi dissolvido em dimetil sulfóxido (DMSO) a 50 mg /ml, e cloridrato de gemcitabina (Eli Lilly, Alemanha) foi dissolvido numa solução de NaCl a 0,9%. soluções para injecção foram esterilizadas por filtração e administrado intraperitonealmente (i.p.) usando 0,3 ml de insulina seringas (Becton Dickinson, Alemanha), após a esterilização do local de injecção. O peso corporal foi controlada diariamente antes da i.p. injecção. 1 ul /g de peso corporal foi injectada para atingir uma concentração final de 50 e 120 mg /kg para nemorosona e gemcitabina, respectivamente. Nemorosona foi injetado uma vez por dia enquanto que para gemcitabina o esquema de tratamento padrão de cada terceiro dia durante quatro ciclos foi utilizado [13].

coloração imuno-histoquímica de tumores xenoenxerto

Um dia após o último tratamento, os ratos foram sacrificados por luxação tumores de xenoenxerto e cervicais foram ressecados, congelados instantaneamente em azoto líquido e armazenado a -80 ° C. Os tumores foram montados num cryomicrotome (Leica, Alemanha) a -25 ° C e 5 uM fatias foram gerados a partir de margens e centros de tumor a ser transferidas para lâminas de vidro

para coloração de hematoxilina e eosina (H E). Coloração , secções de tumores foram fixadas durante 5 s em acetona a -20 ° C, seca-se e coradas em hematoxilina (Carl Roth, Alemanha) durante 15 s e ácido eosina 1,5% em EtOH a 96% (Merck, Alemanha) durante 4 s. Após a desidratação por incubação subsequente em 70%, 96% e 2 × 100% de EtOH, a coloração foi fixado em solução RotiClear (Carl Roth, Alemanha) e vidros de cobertura foram montadas em meio de montagem primordial (DAKO, EUA).

Para a coloração imuno-histoquímica com 3 anticorpos Ki-67 e caspase, as secções foram bloqueadas com 3% de peroxidase em metanol após fixação em acetona fria e lavagem em Tris-buffered sline (TBS) suplementado com 0,1% (w /v) de albumina de soro bovino (BSA). Seguindo um outro passo de lavagem, as secções foram incubadas durante a noite a 4 ° C em 1: 100 diluições de coelho Ki-67 ou caspase activa anti-humano de 3 anticorpos (Dako, EUA) em TBS /BSA a 0,1%. As lâminas foram lavadas em TBS /0,1% de BSA suplementado com 0,1% (v /v) de Tween-20 e subsequentemente em TBS /BSA a 0,1% antes da adição de peroxidase de raddish (HRP) -conjugated anti-coelho secundário de anticorpo IgG de cabra (DAKO , EUA) durante 45 min à temperatura ambiente. Após a lavagem, as secções foram coradas com cromogénio líquido de 3,3-diaminobenzidina (DAB) diluído 1: 500 em tampão de substrato (Dako, EUA). O desenvolvimento da cor foi monitorado microscopicamente e parou em dH

2O. As secções foram então contrastadas em hematoxilina, desidratadas e montadas tal como acima referido.

Análise farmacocinética da NEMOROSONA

50 mg /kg i.p. nemorosona foram administrados e os ratinhos foram anestesiados com 7 mg /kg de xilazina e 100 mg /kg de cetamina 5, 20, 40, 60, 80, 100 e 120 min após a aplicação de nemorosona. Colheu-se sangue em seringas heparinizadas por pontuação coração e subsequentemente centrifugadas durante 10 min a 16.000 x g para preparar o plasma. NEMOROSONA foi extraída a partir do plasma por adição de 400 uL de acetonitrilo (ACN) a 100 uL de plasma e centrifugação a 21000 x g durante 5 min à temperatura ambiente. O sobrenadante foi transferido para um novo frasco e concentradas num concentrador de vácuo. O sedimento resultante foi dissolvido em solvente para cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) (50% H

2O, 30% de MeOH, 20% de ACN). 10 ul de cada amostra foram injectados para análise de um sistema de HPLC Waters 2690 (Waters, Alemanha) equipado com um PDA 996 e um detector de ZQ2000 ESI-MS (Waters, Alemanha). A separação foi efectuada utilizando uma coluna Symmetry C18 de fase inversa (5 de tamanho de poro, 4,2 x 250 mm, Waters, Alemanha) e uma taxa de fluxo constante de 1 mL /min usando um gradiente de solvente. NEMOROSONA absorvância foi detectado a 303 nm.

área do pico no cromatograma NEMOROSONA foi quantificada com a ajuda de uma curva de calibração (Figura S3) derivada a partir de amostras de plasma humano inoculadas com concentrações definidas de nemorosona (10 ng /ml a 100 ug /ml). cromatogramas de HPLC foram analisados ​​utilizando o software Empower 2, e cinética de concentração nemorosona plasma após i.p. injecção foram montados usando TopFit 2.0 [14] sob a suposição de uma disposição de dois compartimentos seguindo uma absorção de um segmento.

Análise das mudanças de enzimas que metabolizam em hepatócitos primários humanos

Cerca de 7,5 expressão × 10

5 hepatócitos humanos primários (Zen-Bio, NC, EUA) foram semeadas em cada poço de uma colagénio I-revestido de 12 poços da placa de cultura de células em plaqueamento médio (Zen-Bio, NC, EUA) e deixou-se aderir durante 10 h. meio de plaqueamento foi trocado com meio de manutenção (Zen-Bio, NC, EUA) e as células foram cultivadas até à confluência de 80% antes da incubação com 0,5 e 1 uM nemorosona e hiperforina diciclohexilamónio sal (Sigma Aldrich, Alemanha) ou 10 pM rifampicina (Sigma Aldrich , Alemanha) durante 48 h. As células foram então colhidas através de tripsinização e o ARN total foi isolado com um kit RNeasy Mini (Qiagen, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. O ARN foi submetido a análise quantitativa por PCR em tempo real utilizando o kit QuantiFast SYBR Green RT-PCR (Qiagen, Alemanha) e os iniciadores QuantiTect (Qiagen, Alemanha), como descrito anteriormente [12].

Os testes estatísticos

Todas as experiências foram realizadas pelo menos em triplicado, a menos que indicado de outra forma. Para todos os experimentos, foi utilizado o teste t de Student (em SigmaPlot 10.0) para a análise de significância da diferença entre os dois grupos.

Resultados

nemorosona não induzir a expressão de CYP3A4 em hepatócitos primários humanos

a metabolização é uma parte importante das propriedades farmacocinéticas de uma droga. A maioria dos xenobióticos são metabolizados pela família do citocromo P450 (CYP) no fígado depois de ser detectada por receptores nucleares [15-17]. Sendo estruturalmente muito semelhante ao nemorosona, hiperforina (Figura 1) foi demonstrada para induzir a expressão de CYP3A4, por ligação a receptores nucleares pregnano X (PXR) e, assim, um metabolismo mais rápido de drogas co-administradas com hiperforina [9,18]. A fim de testar se também nemorosona é detectado pelo PXR e induz a expressão de CYP3A4, bem como outras importantes enzimas que metabolizam drogas, hepatócitos humanos primários foram cultivados na presença de nemorosona, hiperforina e rifampicina, uma droga conhecida por induzir a expressão de CYP3A4 por ligação ao receptor de PXR (controlo positivo). Após 48 horas de incubação, o ARN foi extraído a partir de hepatócitos e submetido a análise de qRT-PCR para avaliar a expressão de enzimas seleccionados.

hepatócitos humanos primários foram tratados com as concentrações indicadas de rifampicina, hiperforina, nemorosona única ou veículo. O ARN foi extraído após 48 h e submetida a análise de qRT-PCR para detectar mudanças de genes seleccionados envolvidos no metabolismo de drogas de expressão. valores de expressão são em relação ao controlo do veículo e representam as médias ± DP de medições em triplicado.

A Figura 2 mostra que o tratamento de hepatócitos humanos com hiperforina e rifampicina conduziu a um significativo aumento da regulação de

CYP3A4

expressão do gene de 15 a 20 vezes, em comparação com o controlo de veículo. Em contraste com isso, o tratamento com 1 PM nemorosona induziu apenas

CYP3A4

expressão de 3 vezes, enquanto que quase não houve indução após tratamento com 0,5 mM nemorosona. tratamento Hyperforin também um pouco sobre-regulada

CYP1A2

,

CYP1B1

e

CYP2B6

expressão, mas não houve mudança detectável para os outros testados metabolizando enzimas como aldeído desidrogenase 1A1 (ALDH1A1 ), um epóxido hidrolase (EPHX1) ou glutationa-S-transferase A2 (GSTA2). Assim, pode-se supor a partir destes dados, que a hiperforina é metabolizada principalmente por CYP3A4 após ser detectado pelo PXR. Apesar de ser estruturalmente semelhante à Hyperforin, nemorosona não parece ligar o PXR e, por isso, metabolizando enzimas são apenas fracamente induzida prestação nemorosona potencialmente útil em uma abordagem terapêutica de associação anti-câncer.

nemorosona inibe o crescimento de tumores de xenoenxerto in vivo

a Figura 3 mostra que a injecção diária de 50 mg /kg resultou nemorosona em anulação completa e significativa do crescimento do tumor, em comparação com a média dos tumores de controlo, que o aumento de 5 vezes em volume. Um efeito semelhante foi observado no grupo de controlo que recebeu 120 mg /kg de gemcitabina. Ao mesmo tempo, o tratamento com nemorosona demonstraram uma boa tolerabilidade, uma vez que o peso corporal manteve-se estável durante o período de tratamento de 28 dias (Figura S1). No entanto, ele necessita de ser notado que os animais que receberam nemorosona começou a hiperventile logo após a injecção. A respiração normal foi restaurado novamente 5-10 min após i.p. aplicação.

Para examinar os efeitos histológicos de tratamento nemorosona, os animais foram sacrificados após o período de tratamento e os tumores foram excisados. E tecido de controlo tratado foi, em seguida, coradas para marcadores de apoptose e a proliferação.

diferenças histológicas entre os tumores de controlo e tratados eram visíveis em H E-secções de tumor coradas (Figura 4). Enquanto os tumores de controlo exibiu uma distribuição homogénea de células viáveis, secções de tumores tratados com NEMOROSONA demonstraram grandes áreas necróticas de células apoptóticas ou de fim de caracterizadas por apenas coloração eosina. A ausência de coloração com hematoxilina nestas áreas indica cariólise. coloração imuno-histoquímica utilizando um anticorpo dirigido contra a caspase 3 verificada regiões activas de apoptose excessiva (células escuro-castanho), enquanto que secções de controlo exibiram alguma apoptose apenas fundo (Figura 4C e D). Em áreas sem células caspase-positivo, foi encontrado o número de células que expressam o marcador de proliferação Ki-67 a ser reduzida em secções de tumores tratados com NEMOROSONA (Figura 4F). Em contraste com isto, uma distribuição homogénea de células em proliferação, caracterizado por uma coloração castanho escuro era visível nas secções de controlo.

Em resumo, o tratamento de tumores nemorosona MIA-PaCa-2 xenoenxerto

in vivo

foi demonstrada para reduzir o número de células em proliferação e induzir a apoptose, o que conduz a uma redução na massa tumoral caracterizado por grandes regiões de morte de células tumorais.

a análise farmacocinética revela rápida absorção e metabolização de nemorosona

a absorção e metabolização da nemorosona

in vivo

foi avaliada pela retirada de sangue antes e em diferentes momentos após o ip injecção de 50 mg /kg nemorosona. NEMOROSONA, bem como possíveis metabolitos foram extraídos do plasma do rato, e a concentração de plasma foi analisado para cada ponto de tempo por cromatograf ia líquida de alta pressão de fase inversa (RP-HPLC; detecção a 303 nm)

Os ratinhos foram tratados com injecção i.p. diariamente. injecções de 50 mg /kg nemorosona, apenas, ou 120 mg /kg de gemcitabina nos pontos de tempo indicados (pontos verdes) veículo. O volume do tumor foi medido 2-3 vezes por semana utilizando um calibrador digital. Os valores representam a média ± desvio padrão de 8 animais por grupo

* p 0,05, ** p 0,01 (em comparação com o controle do veículo).

Cinco minutos após i.p. aplicação, de cerca de 40 ug /ml (80 uM) nemorosona foram detectados em plasma de ratinho, que aponta no sentido de uma absorção muito rápida na corrente sanguínea (Figura 5A). Ao mesmo ponto de tempo, que se assemelham a 7 picos adicionais possíveis metabolitos foram encontrados no cromatograma de HPLC (Figura 5A, Figura S2). No entanto, a concentração no plasma de metabolitos potenciais (M01-M09) foi calculada como sendo de 20 a 200 vezes mais baixa do que a de nemorosona. Ao longo do tempo observado de 120 minutos, a concentração no plasma diminuiu nemorosona logaritmicamente desde 40 a 2,7 ng /ml, com uma meia-vida de aproximadamente 30 min. Farmacocinética de nemorosona após injecção i.p. foram encontrados aplicativo a ser melhor descrito por um modelo de disposição de dois compartimentos produzindo uma linha bifásica na trama escala log na Figura 5B. De acordo com este modelo, nemorosona é rapidamente absorvida e distribuída na corrente sanguínea nos primeiros 10 minutos após a injecção. 20 min após a aplicação, a eliminação parece ser o processo predominante caracterizado por a linha recta equipada. No entanto, deve ser notado, que os processos anteriores para o ponto de tempo de 5 minutos (absorção e distribuição) foram assumidos e requer uma confirmação adicional em um estudo mais detalhado. Assim, a concentração de pico dentro dos primeiros minutos, poderia ser muito mais elevada (~ 100 ng /ml)

secções de 5 um de e tumores de controlo foram coradas com hematoxilina-eosina tratados com nemorosona (H . E; A e B) ou imuno-histoquimicamente analisadas com anticorpos dirigidos contra a caspase 3 (C e D) ou Ki-67 (e e F). Os tumores tratados demonstrou massa tumoral reduzida devido à apoptose /necrose (setas pretas) e um menor número de células em proliferação em comparação com o (células-escuro marrom) controle.

As amostras de plasma foram tomadas no pré Os pontos de tempo definidos após IP aplicação de 50 mg /kg nemorosona. NEMOROSONA e seus metabolitos foram quantificados por RP-HPLC, com a ajuda de uma curva de calibração (Figura S3). concentração (A) Plasma de nemorosona (linha verde superior) e seus possíveis metabolitos (M01 a M09). (B) Farmacocinética de nemorosona foram melhor descrita por um modelo de dois compartimentos com uma meia-vida de 30 min.

Identidade do nemorosona foi ainda confirmada por um detector de espectrometria de massa ESI exibindo picos molécula para protonada nemorosona e os seus sais de sódio e potássio (Figura S4). Além disso, a massa dos picos da molécula de alguns metabolitos foi encontrado para ser aumentada em 16 u, sugerindo que a oxidação de nemorosona pode ser um dos principais passos de metabolização. No entanto, devido à baixa resolução do detector ESI-MS, a estrutura de metabólitos nemorosona não podia ser caracterizada em detalhe.

Discussão

Hyperforin e nemorosona estão entre os melhores membros estudados do diversificada classe de policíclicos polyprenylated acylphloroglucinols e ambos são considerados compostos de chumbo para o desenvolvimento de terapias anticâncer [4,6,12,19]. No entanto, até agora a atividade anticancerígena

in vivo

só foi demonstrada para hyperforin mas não para nemorosona [6]. Assim, este estudo piloto teve como objetivo avaliar a atividade de nemorosona contra tumores de xenotransplante de cancro do pâncreas

in vivo

bem como identificar parâmetros farmacocinéticos básicos como cinética de absorção e metabolização.

Nossos resultados indicam que nemorosona potente inibe o crescimento de xenoenxertos de cancro do pâncreas

in vivo

e parece ser ainda mais eficaz do que o atual padrão de gemcitabina cuidados (Figura 3). Embora a dose administrada nemorosona de 50 mg /kg por dia foi bem tolerada durante o período de tratamento, foi observado hiperventilação directamente após a aplicação de nemorosona indicando alguma actividade sistémica deste composto directamente após a absorção para a corrente sanguínea. Observações semelhantes foram feitas para humulona, ​​um composto estruturalmente relacionado isolado a partir de lúpulos, após injecção intravenosa em gatos [20]. Isso indica propriedades farmacodinâmicas comparáveis ​​que pode ser devido à ação destes compostos sobre a homeostase do cálcio nos músculos. Esta hipótese é suportada pela perturbação induzida por nemorosona instantânea da homeostase do cálcio celular observada

In vitro

[12]

Efeitos do tratamento nemorosona em tumores de xenoenxerto foram confirmadas por H . E coloração de tecidos secções, bem como por coloração imunohistoquímica da caspase 3 activa e o marcador de proliferação Ki-67. tratados com nemorosona MIA-PACA-2 tumores exibiram mais de necrose e /ou regiões apoptóticos, que foram associados à elevada atividade da caspase 3 e um menor número de células em proliferação expressar Ki-67, consistente com os resultados obtidos em células MIA-PaCa-2

in vitro

[12].

a medição da cinética plasmática após ip injecção de 50 mg nemorosona confirmada biodisponibilidade /kg e a absorção do composto para a corrente sanguínea (Figura 5). Cinco minutos após a injecção, a concentração de plasma nemorosona verificou-se ser de 40 pg /ml (80 uM) com a eliminação logarítmica dominando 20 min após a injecção e nemorosona demonstrando um tempo de semi-vida de aproximadamente 30 min. Os valores medidos para a cinética de plasma foram melhor equipado assumindo um modelo de disposição de dois compartimentos, como também observada em estudos farmacocinéticos de concentração plasmática hyperforin por administração oral [21,22]. Calculado pico de concentração plasmática de nemorosona foi ~ 100 M. Assim, considerando a dose elevada durante a primeira 5-10 minutos após a aplicação, a hiperventilação aguda observados podem ser explicados pelo nemorosona reversivelmente interferir com as células saudáveis ​​entre a concentração de pico no plasma e o início da fase de eliminação, aproximadamente, 10 minutos mais tarde.

no total, 9 possíveis metabolitos foram detectados em plasma de rato, a maior parte deles já estavam presentes em 5 min após IP injecção (Figuras 5 e S2). Isto aponta para uma rápida metabolização da nemorosona, consistente com a sua meia-vida calculada de apenas 30 minutos. Infelizmente, a estrutura dos metabolitos não poderia ser obtido devido à baixa resolução do detector de ESI-MS. No entanto, considerando o facto de que os tempos de retenção observados no cromatograma de RP-HPLC são mais baixas para todos os metabolitos em comparação com nemorosona, processos de oxidação ou de hidroxilação pode ser assumida. Esta suposição é ainda apoiada pelo facto de, em comparação com nemorosona, a massa de metabolitos seleccionados é aumentada por 16 u, a massa molecular de oxigénio (Figura S4). Para se obter informação estrutural detalhada sobre os metabólitos, um sistema de LC /ESI-MS com maior resolução ou uma abordagem preparativa para análise de RMN terá de ser estabelecida. Ambos os métodos foram aplicados para hiperforina metabolizados em sistemas de microssomas de fígado de rato e resultou na identificação de quatro metabolitos hiperforina, cada hidroxilado no grupo metileno terminal da uma das cadeias laterais de quatro prenil [23]. Os autores especularam que duas isoformas de citocromo P450 de rato ortólogo para CYP3A4 humana eram principalmente envolvidos na metabolização de hiperforina. Isto é consistente com o facto de que a hiperforina induz a expressão de

CYP3A4 através

ligação ao receptor pregnano X (PXR) [9,24].

CYP3A4

expressão também foi encontrada para ser fortemente induzido por hiperforina e rifampicina, uma substância que se sabe activar PXR, mediante tratamento de hepatócitos primários humanos neste estudo (Figura 2). Curiosamente, nemorosona foi apenas moderadamente eficaz na indução

CYP3A4

expressão: Incubação de hepatócitos com 1 PM nemorosona só resultou em um aumento de 3 vezes de

CYP3A4

mRNA em comparação com um aumento de 15 vezes em cima incubação com 1 uM de hiperforina. Este resultado é surpreendente, considerando a cavidade de ligação do ligando altamente flexível do PXR, que foi demonstrada a hiperforina perfeitamente ligam [24,25]. Assim, dada a relação estrutural próxima com Hyperforin, o PXR se deve esperar que também se ligam e induzir

expressão CYP3A4

em concentrações nemorosona equimolares. Este não parece ser o caso, tornando assim maiores concentrações de nemorosona para tratamento de câncer preferível sobre aqueles de hyperforin para as quais foram relatadas várias interacções medicamentosas relacionadas com a indução do CYP3A4 [9,18]. Considerando o facto de que uma expressão elevada PXR também tem sido observada em várias células pancreáticas [26], o tratamento de cancro pancreático com uma abordagem de terapia de combinação é mais provável que seja bem sucedida com nemorosona em vez de hiperforina.

Em conclusão, o presente estudo demonstrou um efeito inibidor do crescimento significativo de nemorosona em xenoenxertos de cancro do pâncreas ao serem bem tolerados. A análise farmacocinética básica sugere, que nemorosona é rapidamente absorvido e metabolizado por oxidação de um modo independente de CYP3A4. Isso faz com que nemorosona um composto de chumbo muito promissora para terapias de combinação. Assim, estudos mais detalhados sobre os modelos de xenotransplante ortotópicos e farmacocinéticas, de maior resolução deve ser conduzida.

Informações de Apoio

Figura S1.

peso do corpo de ratos tratados e de controlo. O peso corporal dos murganhos tratados e de controlo foi determinada de forma rotineira, numa base diária antes da i.p. injecção. Os valores representam a média ± SD de 8 animais por grupo

doi:. 10.1371 /journal.pone.0074555.s001

(TIF)

Figura S2. Os cromatogramas de HPLC da

nemorosona e seus metabolitos detectados no plasma. Sobreposição de cromatogramas de HPLC selecionados (detecção a 303 nm) de rato (verde) e (azul) amostras humanas de plasma, bem como plasma humano enriquecida com 100 nemorosona ng /ml (vermelho) e plasma de ratinho 5 minutos após a administração i.p. aplicação de nemorosona (preto) é mostrado

doi:. 10.1371 /journal.pone.0074555.s002

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Figura S3.

linha padrão de plasma humano enriquecida com concentrações crescentes nemorosona. Uma linha de calibração para nemorosona cravado em amostras de plasma humano foi calculado e executado em paralelo com as amostras extraídas de plasma de rato para permitir a quantificação de nemorosona

doi:. 10.1371 /journal.pone.0074555.s003

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Figura S4.

ESI-MS espectros de nemorosona e metabólitos selecionados. ESI-MS Os espectros foram registados para cada pico, e espectros de nemorosona, bem como para os metabolitos M01, M06 e M08 são exibidos. Os picos molécula de iões de nemorosona protonada (m /z = 503,2) bem como seus sais de sódio (m /z = 525,2) e potássio (m /z = 541,1) sais estão marcados com setas pretas. Potencialmente oxidado nemorosona de sódio (m /z = 541,1) e potássio (m /z = 557,2) sais são marcadas com setas cinzentas

doi:. 10.1371 /journal.pone.0074555.s004

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Reconhecimentos

os autores são gratos à Facilidade DKFZ Laboratory animal e Sven Rüffer para ajuda técnica durante a cultura de células e de trabalho animal, bem como Dr. Shereen Keleg, Europeu Pâncreas Center, Heidelberg, por sua ajuda com coloração imuno-histoquímica.