Abstract

Uma série de relatórios indicaram que Aurora-A ou Aurora-B superexpressão representou um fator prognóstico negativo em várias malignidades humanas. No câncer de tireóide tecidos uma expressão desregulada de cinases Aurora também tem sido demonstrado, butno informações sobre o seu possível papel prognóstico no câncer diferenciado da tiróide está disponível. Aqui, weevaluated Aurora-A e expressão de mRNA Aurora-B e sua relevância prognóstico em uma série de 87 cancros da tiróide papilar (PTC), com um seguimento médio de 63 meses. A análise dos níveis de ARNm de Aurora-B Aurora-A e em tecidos PTC, em comparação com os tecidos normais correspondentes, revelou que a sua expressão estava quer para cima ou para baixo-regulatedin a maioria dos tecidos de cancro. Em particular, os níveis de Aurora-B de ARNm de Aurora-A e foram alteradas, respectivamente, em 55 (63,2%) e 79 (90,8%) de a correlação positiva significativa entre 87 PTC analyzed.A mRNAswas Aurora-A e Aurora-B observada (p = 0,001). A expressão dos dois genes Aurora não foi afetada pela BRAF

mutação V600E. Univariada, multivariada e Kaplan-Mayer análises documentaram a falta de associação entre Aurora-A ou expressão Aurora-B e parameterssuch clínico-patológico como sexo, idade, tamanho do tumor, histologia, estágio TNM, metástases linfonodais e estado BRAF bem asdisease recorrências ou doença intervalo de -livre. Apenas Aurora-B mRNA foi significativamente maior no T (3-4) tecidos, com relação a T (1-2) tecidos PTC. Os dados aqui apresentados demonstram que a expressão de Aurora cinases é desreguladas na maioria dos tecidos PTC, contribuindo provavelmente para a progressão PTC. No entanto, diferentemente de outros cancros sólidos humanos, a detecção de Aurora-A ou Aurora-B mRNAs não é um biomarcador de prognóstico inPTC pacientes

Citation:. Baldini E, Tuccilli C, Prinzi N, Sorrenti S, Falvo L, de Vito C, et ai. (2015) Expressão desregulamentado de Aurora cinases não é um biomarcador prognóstico em papilar da tiróide pacientes com câncer. PLoS ONE 10 (3): e0121514. doi: 10.1371 /journal.pone.0121514

Editor do Academic: Adriano Angelucci, da Universidade de L’Aquila, Itália

Recebido: 09 de dezembro de 2014; Aceito: 02 de fevereiro de 2015; Publicação: 25 de março de 2015

Direitos de autor: © 2015 Baldini et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:. Este trabalho foi o apoio por uma bolsa (PRIN 2010BX2SNA_007) do Ministero dell’Istruzione, dell’Università e della Ricerca. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a incidência de cancros da tiróide diferenciados (DTC) tem vindo a aumentar nas últimas décadas, principalmente devido ao aumento da capacidade de diagnosticar a transformação maligna em nódulos não palpáveis ​​pequenos [1-4]. DTC compreendem duas principais entidades histológicos, o carcinoma da tiróide folicular rara (FTC) e themore carcinoma de tireóide papilar comum (PTC). Seguindo desdiferenciação DTCare assumiu a gerar mal DTC (PDTC) e carcinomas altamente agressivos anaplásico da tiróide (ATC) [5-6]. alterações moleculares relevantes encontradas na progressão do cancro da tiróide compreender rearranjos de genes de receptores de tirosina-quinase, tais como o RET /PTC e NTRK1, activação de mutações pontuais dos genes Ras e BRAF, e a proteína de fusão oncogénica PAX8-PPARy [7].

O prognóstico dos pacientes com CDT é geralmente favorável, com uma taxa de 10 anos de sobrevivência para cerca de 90% deles. No entanto, cerca de 20% dos pacientes enfrentam a recorrência da doença e mortes relacionadas com o DTC [8]. A estratificação e prognóstico de pacientes com CDT dependem de variáveis ​​clínico-patológicos, tais como a idade do paciente, tamanho do tumor, histologia, linfa nodais ou distantes metástase [8-11]. Estes parâmetros, contudo, são capazes de proporcionar apenas uma previsão aproximada da evolução da doença, colocando os pacientes com diferentes tempos de progressão e sobrevivência de doenças específicas dentro do mesmo grupo de risco. Da mesma forma, eles não conseguem prever o risco de recorrência do câncer. Portanto, é necessária a identificação de novos biomarcadores moleculares de prognóstico capaz de testemunhar a agressividade do tumor [11-17].

A instabilidade genética levando a célula aneuploidia e de transição para fenótipos mais agressivos representa uma marca de cancros sólidos, incluindo carcinomas da tiróide [18-22] .Na verdade, o número ea frequência de anomalias cromossômicas observadas em cancros da tiróide aumentar de DTC para PDTC e ATC [5, 20]. Diferentes cinases mitóticas, cuja expressão ou função foi encontrado alterado nas células cancerosas, são responsáveis ​​por tumor instabilidade genética. Estes incluem os três membros da família Aurora quinase, Aurora-A, -B e -C, implicados na regulação de vários aspectos da segregação cromossômica e citocinese [23]. Durante o ciclo celular, a sua expressão é regulada de perto, sendo máxima na fase G2 /M, enquanto que a sua rápida degradação no final da mitose pela via da ubiquitina-proteassoma é necessário para permitir que a célula para entrar um novo ciclo celular [23 ]. Aurora-A localiza sobre os centrossomas duplicados e está envolvido na entrada mitótico, maturação do centrossoma e eixo, enquanto os associados Aurora-B com cromatina onde se forma o complexo o chamado cromossómico de passageiros (CPC) com outras proteínas, tais como INCENP, survivina e borealin , participando de condensação cromossomo [23]. Além disso, durante a transição de anaphase para telophase, Aurora-B desempenha um papel na dinâmica do fuso mitótico, conexões de cromossomos a fuso microtúbulos, e sulco de clivagem. Aurora-C é expresso principalmente nos testículos e, de forma semelhante a Aurora-B, demonstrou-se para se juntar ao CPC em células mitóticas [23]. Dadas as tarefas cruciais de cinases Aurora em todos os estágios de mitose, sua disfunção e /ou desregulação são responsáveis, pelo menos em parte, para as divisões celulares anormais e aneuploidia observadas em células malignas. De acordo com isto, a sobre-expressão de Aurora-A e /ou Aurora-B foi mostrado para associar com um prognóstico desfavorável em vários tumores malignos humanos, incluindo cancro da mama, gástrico, da próstata, cabeça e pescoço, bexiga, ovário, cólon, adrenocortical e do pulmão cancros [24-31].

os dados de nossos grupos própria e outras pesquisas mostraram anteriormente uma expressão alterada de cinases Aurora em diferentes linhas celulares derivadas de cancro da tiróide e tecidos [32-35]. Embora essas cinases estão agora a emergir como promissores novos alvos terapêuticos para o tratamento de câncer de tireóide, nenhuma tentativa foi madeso longe para avaliar o possível valor prognóstico da Aurora cinases em pacientes PTC [23, 36-39]. No presente studywe avaliada, por meio de RT-PCR quantitativo, o nível de expressão de Aurora-A e Aurora-B, em um estudo de caso de 87 tecidos PTC contra tecidos normais correspondentes. Os dados foram então correlacionados com os parâmetros clínico-patológicos e com o intervalo livre de doença dos pacientes. Além disso, uma vez que o gene BRAF

mutação V600E, a alteração mais frequente na PTC, foi recentemente mostrado para induzir a expressão de Aurora-B, em células de melanoma, os efeitos da mutação de BRAF sobre a expressão de Aurora cinases em tecidos PTC também foi avaliada [40]

Materiais e Métodos

As amostras de tecido, histologia e estadiamento do paciente

O estudo de caso incluídos 87 pacientes consecutivos.; tecidos tireoidianos tumorais normais e combinados foram obtidos de espécimes cirúrgicos de 19 homens e 68 mulheres (idades compreendidas entre 11-83 anos, 44.21yrs mediana) que foram submetidos a tireoidectomia total para PTC no Departamento de Ciências Cirúrgicas, “Sapienza” de Roma (n = 31), ou no Departamento de Ciências Médicas e cirúrgicas, da Universidade de Pádua, Itália (n = 56) .Todos os pacientes deram seu consentimento informado por escrito. Durante três pacientes menores de idade do consentimento informado por escrito foi obtido a partir de seus pais. O estudo foi aprovado pela comissão de ética do hospital Policlínico Umberto I (Ref. 2615). As amostras de tecido foram colhidas, congeladas em azoto líquido e armazenado a -80 ° C. Dos 87 pacientes PTC, 76 exibiu o clássico, 10 folicular, e 1 a variante de células de altura. Dois histopathologists diferentes feitos os diagnósticos histológicos de forma independente de acordo com a classificação da Organização Mundial de Saúde e de forma cega em relação à expressão da quinase Aurora [41]. No momento da cirurgia, metástases linfonodais foram encontradas em 38 pacientes. Após o estadiamento TNM, 54 pacientes foram identificados como estando em fase I, 1 no estádio II, 25 no estágio III e 7 na fase IV. Quarenta a cinquenta dias após a cirurgia, todos os pacientes foram submetidos à terapia com iodo radioactivo e toda posterior exame do corpo (WBS) mostrou a ausência de metástases. Os pacientes, em seguida, começou a terapia de reposição hormonal da tireóide. Para determinar a sua condição de livre de doença, de 4 a 5 meses mais tarde, todos os pacientes foram submetidos a ultra-sonografia pescoço e medição de tireoglobulina (Tg). Recorrências foram diagnosticados por aspirativa por agulha fina (FNA) citologia,

131I WBS ou análise histológica após a ressecção cirúrgica da lesão. Dos 87 pacientes, o seguimento (mediana 63 meses, gama 8-133months) estava disponível para 78 (18 homens e 60 mulheres, com uma idade mediana de 44yr), 52of quais estavam em estágio TNM I-II e os restantes 26 no estadio III-IV. O limite inferior de tempos-to-recorrência começou aos 6 meses. Durante os 21 recorrências de seguimento foram registrados, 17 sendo os cervicais linfáticos, diagnosticados por citologia aspirativa, e 4 metástases pulmonares, diagnosticados por WBS.

Determinação do BRAF

mutação V600E

o ADN genómico foi extraído dos tecidos congelados usando o kit DNeasy sangue e tecidos de acordo com o protocolo do fabricante. O estado BRAF do exão 15 foi avaliada por sequenciação directo e específico para o alelo A amplificação por PCR mutante para o T para A substituição no nucleótido 1799 (V600E), usando o procedimento anteriormente descrita e na forma cega no que diz respeito à expressão de quinase Aurora [42].

cultura de células PCCL3

A linha de células epiteliais da tiróide bem diferenciado, não transformada rato PCCL3 foi um presente do Dr. JA Fagin (Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, Nova York). As células foram propagadas em H4 meio completo consistindo de alto teor de zinco meio /F12 de Coon suplementado com 5% de soro fetal de bovino, 0,3 mg /ml de L-glutamina, 1 MUI /TSH ml, 10 ug /ml de insulina, 5 ug /ml de apo transferrina, 10 nM de hidrocortisona, e penicilina /estreptomicina. Estas células condicionalmente expressar BRAF

V600E em uma maneira dependente da doxiciclina [43]. O gene BRAF

indução V600E foi obtido adicionando ao H4 completa doxiciclina médio de 1 ug /ml, e incubando as células durante 48 h.

Extracção e análise do ARNm

Os tecidos foram da tiróide homogeneizado com o ultra-Turrax, e RNA total foi extraído a partir dos tecidos ou células PCCL3 aplicando o método de tiocianato-fenol-clorofórmio guanidínio ácido [44]. A primeira cadeia de cDNA foi sintetizada a partir de 5 ug de ARN com M-MLV de transcriptase inversa e oligo ancorado (dT) 23 primers (Sigma Chemicals Co.). controles paralelos para a contaminação de ADN foram realizadas omitindo a transcriptase reversa. Os modelos obtidos foram utilizados para amplificações por PCR quantitativas das Aurora cinases e genes de manutenção da utilização do instrumento LightCycler (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemanha), o SYBR Premix Ex Taq II (TliRNase H Plus) (Takara, Otsu, Shiga, Japão) e iniciadores específicos listados na Tabela 1. As especificidades amplicon foram verificados por sequenciação de DNA automatizado (Primm, San Raffaele Biomedical Science Park, Milano, Italy), a avaliação das temperaturas de fusão e /ou electroforese em gel de agarose a 2% contendo brometo de etídio. As curvas padrão para todos os genes foram obtidos com diluições de cinco vezes de células PCCL3 ou de ADNc de tecido humano da tiróide misto. O cálculo dos dados para os tecidos da tiróide humana foi realizada por a ferramenta de software expressão relativa (REST 2009) usando um factor de normalização (NF) calculada como a media geométrica de 3 genes de referência (GAPDH, RPL13A e SdhA), como previamente descrito [45, 46 ]. A mudança dobra de expressão Aurora quinase para cada amostra de tumor foi encaminhado para o seu homólogo normal. Esta análise foi performedin maneira cega em relação aos dados histológicos e clínicos dos pacientes. Fold variações entre 0,8 e 1,2 foram considerados inalterada. O cálculo dos dados para as experiências com células PCCL3 foram realizados utilizando o software LightCycler 1.0 quantificação relativa (Roche Diagnostics), e a expressão de dobragem de Aurora cinases para as células tratadas com doxiciclina PCCL3 foi normalizado contra células não-tratadas. Todos os resultados são apresentados como média ± SEM e valores medianos.

A análise estatística

O teste de Mann Whitney não paramétrico foi utilizado para calcular a significância estatística das diferenças nos níveis de expressão de cinases Aurora em PTC com a expressão desregulada contra PTC com os níveis de mRNA inalteradas e no tipo selvagem contra amostras BRAF mutantes. Além disso, a associação da expressão de Aurora cinases com o sexo, histologia, metástase linfonodal, estádio TNM ou recorrências foi avaliada pelo teste de Mann Whitney. As análises de correlação entre a Aurora-A e Aurora-B níveis de ARNm, bem como entre estas e idade foram realizados utilizando o teste de Rho de Spearman. Para avaliar a associação independente de cinases Aurora com DFI, foi aplicado o texto de regressão de Cox. O impacto de expressão Aurora quinase no intervalo livre de doença (DFI) foi avaliado por meio de análise de Kaplan-Meier combinado com Mantel-Cox log-rank. Para a análise de Kaplan-Meier, valores Aurora cinase foram divididos em três grupos com base no aumento, ou diminuição da expressão inalterada quinase. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando a versão 8.0 do software Stata (Stata Corporação 2003, College Station, TX). Os resultados foram considerados significativamente diferentes se os valores de p foram menores do que 0,05.

resultados

A expressão de Aurora cinases em câncer de tireóide papilar (PTC) tecidos

As análises da Aurora-A e os níveis de Aurora B-ARNm em tecidos PTC, em comparação com os seus tecidos normais pareados, revelou que a Aurora-a mRNA levelswere desregulada em 55 (63,2%) de 87 amostras de PTC, com um aumento em 30 e uma diminuição em 25 (fig. 1A). níveis de Aurora-B de ARNm foram alteradas em 79 (90,8%) de 87 amostras, sendo regulada para cima e para baixo em 57-regulada em 22 (Fig. 1B) dos casos. Conforme relatado na Fig. 1C, os níveis de mRNA de Aurora-A e Aurora-B foram positivamente correlacionados entre si (p = 0,001).

A e B) As variações na expressão de Aurora-A e Aurora-B no câncer de tireóide papilar tecidos. As alterações de dobragem foram calculados considerando a Aurora-A ou Aurora-B níveis observados ARNm em tecidos normais da tiróide combinados igual a 1. A avaliação estatística dos dados foi realizada usingthe teste não paramétrico de Mann-Whitney. As pequenas barras no gráfico indicam os valores medianos. C) Análise da correlação entre Aurora-A e Aurora-B mRNAs em tecidos PTC. Os dados foram avaliados através da aplicação do teste de Rho de Spearman.

BRAF

mutação V600E e expressão Aurora quinase em tecidos PTC

Para avaliar o efeito do BRAF

mutação V600E sobre a expressão de Aurora-a e Aurora-B foram analisados ​​em primeiro lugar o nível de ARNm de ambos os genes no gene BRAF

tumores V600E PTC (n = 37), em comparação com aqueles que alberga a proteína de tipo selvagem (n = 38) (fig. 2A). Os resultados mostraram que A presença do V600Emutation BRAF

não afectou os níveis de Aurora-A ou Aurora-B de expressão nos tecidos PTC, em comparação com o tipo selvagem tecidos BRAF PTC. Para corroborar estas

in vivo

observações, foi realizada

in vitro

experimentos sobre a linha bem diferenciado, não transformada rat células epiteliais PCCL3, caracterizada por um dependente de doxiciclina BRAF

V600E sistema de expressão de [50]. Nestas células o BRAF

expressão V600E e subsequente indução da via de fosforilação /ERK MEK apareceu 12 h após a adição de doxiciclina, e o total de expressão de BRAF (de tipo selvagem endógena + induzida mutante V600E) em 48 h foi estimada ser duas vezes maior do que o controlo. Conforme relatado na Fig. 2B, o tratamento de PCCL3 com doxiciclina (1? G /mL durante 48 horas) não afectou os níveis de mRNA de quinase Aurora.

A) Expressão de Aurora-A e Aurora-B nos tecidos papilar cancro da tiróide com tipo selvagem (n = 38) ou BRAF mutante (n = 37). As alterações de dobragem foram calculados considerando a Aurora-A ou nível de Aurora-B ARNm observada em tecidos normais da tiróide combinados igual a 1. A avaliação estatística dos dados foi realizada aplicando o teste de Mann Whitney não-paramétrico. As pequenas barras no gráfico indicam os valores medianos. B) Efeito do BRAF

V600E em Aurora cinases mRNAs em células PCCL3. Os últimos foram induzidas para expressar BRAF

V600E em uma maneira dependente da doxiciclina. As alterações de dobragem de quinase Aurora ARNm foram normalizados contra as células não-tratadas.

relevante para prognóstico da expressão de quinase Aurora em pacientes PTC

As variações na expressão de Aurora-A, não fez associar-se com qualquer um dos parâmetros clínico analisadas (Tabela 2), enquanto contato positivo correlação (p 0,001) foi encontrada entre os níveis de Aurora B-mRNA e tamanho do tumor (Tabela 2) análise .A Kaplan-Meier demonstrou nenhuma correlação entre pacientes da doença-livre intervalo de quinase Aurora e para cima ou para baixo-regulação (Fig. 3). A análise multivariada mostrou que a expressão aumentada ou reduzida de Aurora-A ou Aurora-B, fase TNM, idade ou o BRAF

mutação V600E não conseguiram prever a evolução da doença (Tabela 3). Apenas as fêmeas mostraram uma redução estatisticamente significativa da taxa de risco (HR 0,286) para as recorrências da doença (Tabela 3).

A análise de Kaplan-Meier combinado com teste estatístico de log-rank de Mantel-Cox realizado em 75 pacientes PTC followed- -se de 8 a 133 meses.

Discussão

em estudos anteriores, nosso e de outros grupos de pesquisa demonstraram uma expressão desregulada de cinases Aurora na tireóide diferenciado e anaplásico tecidos de câncer [23]. Esta foi confirmada no presente estudo onde foi encontrada a Aurora-A e a expressão do gene da Aurora-B, quer regulada para cima ou para baixo-regulado (63,2% e 90,8%, respectivamente), em que a maioria do cancro papilar da tiróide (PTC) tecidos analisados, em comparação com os seus tecidos tireoidianos pareados normais. Vale ressaltar que tanto o aumento da regulação ou para baixo-regulação das cinases Aurora pode ser proliferatively vantajoso para as células cancerosas da tiróide. De facto, vários relatórios demonstraram que a quantidade de Aurora-A proteinin o centrossoma é crítico para as suas funções de replicação e mitóticos, e que tanto a falta ou o excesso de chumbo Aurora-Acan a mitose anormal, bem como a defeitos de segregação de cromossomas e citocinese [ ,,,0],47].

foi recentemente mostrado que, em células de melanoma a expressão de Aurora-B cinase e proteína Wee1 semelhante são induzidos pela presença de BRAF

V600E [40]. Desde BRAF

mutação V600E é frequentemente encontrado em PTC, também procuraram determinar se a mutação em células de câncer de tireóide foi associado ao aumento da expressão das cinases Aurora. Em nossa série, o estado BRAF foi avaliada em 75 tecidos PTC e BRAF

V600E foi encontrada em 37 (49,3%) deles. No entanto, não houve diferença na Aurora-A ou Aurora-B expressão levelswas encontrada entre o tipo selvagem e BRAF

tecidos V600E PTC. Estas observações foram confirmedby

in vitro

experimentos sobre células PCCL3 rato da tireóide, que expressam a V600E BRAF

de uma forma dependente doxiciclina [43]. Na verdade, o tratamento destas células com doxiciclina não afectou o nível de qualquer das Aurora-A ou Aurora-B expressão.

Ao longo da última década, um número de relatórios indicam que a sobre-expressão de Aurora-A ou Aurora-B representa um factor de prognóstico negativo em várias malignidades humanas, incluindo cancro da mama, gástrico, da próstata, cabeça e pescoço, bexiga, ovário, cólon, cancros pulmonares e adrenocorticais [25-32]. Poucos estudos, no entanto, associada a sobre-expressão de Aurora-A ou Aurora-B com um prognóstico favorável em colorectal, gástrico e carcinomas do ovário [48-50]. Até o momento, nenhuma informação sobre o possível papel prognóstico da Aurora cinases no câncer diferenciado da tireóide tem sido relatada. Neste contexto, nós aqui avaliada a relevância prognóstico da Aurora-A e os níveis de Aurora B-mRNA em uma série de 78 PTC, com um seguimento médio de 63 meses. Análises univariada documentou a ausência de associação entre Aurora-A expressão e os parâmetros clínico, incluindo idade, sexo, tamanho do tumor, metástase linfonodal, histologia, TNM, estado BRAF e recorrências. Do mesmo modo, a expressão de Aurora-B não se correlacionou com nenhum destes parâmetros, com excepção do tamanho do tumor, em que os níveis de ARNm eram significativamente mais elevados em T (3-4) tecidos, no que diz respeito aos t (1-2) tecidos. Kaplan-Meier e análise multivariada confirmou que a expressão desregulada de cinases Aurora não é um biomarcador de prognóstico de pacientes com câncer de tireóide papilar. Na análise multivariada sexo feminino mostraram um efeito protetor significativo (Risco 0,286, p = 0,021). Este último está de acordo com dois estudos recentes realizados em grande série de casos mostrando o papel protetor do sexo feminino na sobrevivência específica da doença [51, 52] .Ele tem de ser mencionado que um limite do presente estudo é a relativa baixa número de pacientes analisados ​​que proporcionam um poder estatístico (1-β) de 0,63.

Conclusões

Em conclusão, embora os dados relatados hereneed a ser confirmado por meio de estudos de casos maiores, eles demonstraram que a expressão de Aurora cinases é desreguladas na maioria dos tecidos PTC, e provavelmente contribui para a progressão da PTC e aneuploidia de células de cancro. No entanto, de forma diferente a partir de outros cancros sólidos humanos, de Aurora-A ou Aurora-B expressão ao nível do ARNm não é um biomarcador prognóstico no caso de pacientes PTC.