Abstract

Purpose

Enquanto a ressecção cirúrgica é a pedra angular do tratamento do câncer, recorrências locais e distantes continuarão a afetar negativamente resultado em uma proporção significativa de pacientes. A prova de que uma estratégia de diminuição de volume alternativa que envolve a ablação por radiofrequência (RFA) induz imunidade antitumoral solicitado a investigação em curso sobre a eficácia de realizar RFA antes da ressecção cirúrgica (pré-resectional RFA) em um modelo pré-clínico mouse.

Experimental Design

eficácia e sistêmicas respostas imunes terapêuticas foram avaliadas após o tratamento RFA pré-resectional de murino adenocarcinoma do cólon CT26.

resultados

O tratamento com o crescimento do tumor significativamente atrasada pré-resectional RFA e melhorado sobrevida global em comparação com sham cirurgia, RFA, ou ressecção sozinho. Os ratos no grupo RFA pré-resectional que atingiram uma resposta completa demonstrou imunidade antitumoral durável em cima tumor re-desafio. Incapacidade de alcançar um benefício terapêutico em ratinhos imunodeficientes confirmou que o controle do tumor através da pré-resectional RFA depende de uma resposta imune adaptativa intacta ao invés de alterações nos parâmetros físicos que fazem tumores ablacionadas mais propícios à excisão cirúrgica completa. RFA provoca um aumento acentuado na intratumoral CD8 infiltração

+ T de linfócitos, aumentando assim substancialmente a proporção de células T CD8

+ células T efectoras: FoxP3

+ células T reguladoras. Importante, pré-resectional RFA aumenta significativamente o número de específica do antigénio CD8

+ T células dentro do microambiente do tumor e do nó de linfa de drenagem do tumor, mas não teve nenhum impacto na infiltração por células derivadas de mielóides supressores, macrófagos M1 ou macrófagos M2 em locais de tumor ou em órgãos linfóides periféricos (isto é, do baço). Finalmente, RFA pré-resectional de tumores primários retardou o crescimento dos tumores distantes através de um mecanismo que depende CD8

+ T mediada por células da imunidade antitumoral sistêmica.

Conclusão

Melhoria da sobrevivência e antitumoral imunidade sistémica provocada pela RFA pré-resectional apoiar o potencial translacional deste tratamento neoadjuvante para pacientes com câncer e de alto risco de recorrência local e sistêmica

Citation:. Ito F, Ku AW, Bucsek MJ, Muhitch JB, Vardam -Kaur T, Kim M. et ai. (2015) Immune Adjuvante Atividade de Pré-Resectional Ablação por Radiofreqüência Protege contra a recorrência local e sistêmica em Agressivo murino de cancro colorrectal. PLoS ONE 10 (11): e0143370. doi: 10.1371 /journal.pone.0143370

editor: Fabrizio Mattei, Istituto Superiore di Sanità, ITALY

Recebido: 10 de fevereiro de 2015; Aceito: 04 de novembro de 2015; Publicação: 23 de novembro de 2015

Este é um artigo de acesso aberto, livre de todos os direitos autorais e pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita. O trabalho está disponível sob a licença Creative Commons CC0 domínio público dedicação

Data Availability:. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento: Este trabalho foi apoiado por subsídios os Institutos Nacionais de Saúde (CA79765 e AI082039 a SS Evans; CA098156 e CA109480 a SO Gollnick, e P30CA016056 para Roswell Park Cancer Institute); ea Jennifer Linscott Family Foundation Tietgen (J.J. Skitzki e S. S. Evans). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a cirurgia continua a ser a terapia de primeira linha e melhor opção de cura para pacientes com câncer e doença ressecável. O objetivo da excisão cirúrgica é a completa remoção de tumores com margens livres de câncer microscópicas. Infelizmente, muitos pacientes desenvolvem a recidiva local ou sistêmica, apesar dos avanços na técnica cirúrgica e quimioterapia adjuvante ou radioterapia. Em metástases hepáticas colo-rectal, por exemplo, a taxa de recaída é de até 60% em pacientes submetidos a uma ressecção potencialmente curativos, provavelmente devido à doença residual microscópica ou micrometástases presente no momento da cirurgia [1-3]. A evidência de uma alta taxa de recorrência e disseminação metastática em pacientes pós-cirurgia sugere ainda que, embora a imunidade anti-tumoral sistémica é evidente em pacientes com câncer avançado, a resposta imune de estado estacionário é insuficiente para o controlo adequado do tumor [4]. Por os tumores são detectáveis ​​tempo que já desenvolveram mecanismos para escapar ao reconhecimento imunológico e eliminação [4]. Assim, as amostras tumorais ressecados muitas vezes mostram infiltração escassa por CD3

+ linfócitos T CD8, incluindo

+ células T efetoras citotóxicas, que se correlaciona com pior prognóstico em vários tipos de tumores histológicos, incluindo o cancro colorectal [5-7].

In situ

técnicas de ablação térmica, tais como a ablação por radiofrequência (RFA), surgiram como opções de tratamento promissor para tumores sólidos malignos irressecáveis ​​[8, 9]. RFA é aprovado por os EUA Food and Drug Administration (FDA) para a ablação de tumores primários e metastáticos, e tem sido aplicada no tratamento de uma variedade de neoplasias incluindo fígado, colo-rectal, do pulmão, da próstata, do rim, da mama, cérebro, tiróide, melanoma, tumores ósseos e [9]. Na gestão de metástases hepáticas de cancro colorrectal, RFA tem sido usada mais frequentemente

via

abertos, laparoscópica, ou abordagens percutâneas guiadas por imagem e pode ser realizada sob anestesia geral ou local com o mínimo de complicações [8, 9]. RFA também é usado em combinação com a ressecção cirúrgica em doentes com múltiplas lesões hepáticas em que a ressecção completa não é viável devido à proximidade do tumor para estruturas vitais (por exemplo, vasos sanguíneos ou canais biliares) ou parênquima insuficiente para suportar a função pós-hepatectomia [2, 10].

A energia entregue por RFA provoca agitação iónico que é convertido por atrito em hipertermia focal de alta temperatura (≥50 ° C), desse modo induzindo danos irreparáveis ​​celular e necrose coagulativa [8]. Em adição a esta actividade antitumoral directa citorredutor, RFA foi mostrado para provocar efeitos imunomoduladores em estudos pré-clínicos e clínicos [8, 11]. Em contraste com a ressecção cirúrgica, o tecido de tumor danificado seguinte RFA permanece

In situ

e fornece uma fonte de antigénios tumorais. Estes antigénios são absorvidos e processados ​​por células dendríticas locais (DC) e apresentados aos linfócitos T em nódulos linfáticos de drenagem de tumor (TdLN), levando assim à expansão de uma CD8

+ piscina de células T efectoras específicas do tumor [8 , 12, 13]. Notavelmente, uma densa CD3

+ infiltrado de células T tem sido relatada em locais de tumor após a RFA, em consonância com antitumoral locais reactividade imune [14, 15]. Outra evidência da imunidade sistêmica induzida RFA decorre de relatórios pré-clínicos e clínicos de efeitos abscopal envolvendo regressão espontânea das lesões metastáticas distantes após a ablação do tumor primário [16-20]. No entanto, o anti-tumoral resposta imunitária dependente das células T geradas por RFA em pacientes e modelos de rato parece ser relativamente fraco [11, 14, 15] e um problema grave permanece a elevada taxa de recorrência local no local de tratamento, especialmente para tumores 3 cm ou perto das principais redes vasculares onde os limites de afluxo de sangue de concentração térmica no tecido alvo através de efeitos do dissipador de calor [2, 8]

as preocupações com a rebrota tumor na zona de transição de hipertermia subletais (≤45. ° C) que rodeia a zona necrótica centrais têm limitado o uso de RFA principalmente a paliação ou para pacientes que não toleram a cirurgia resectional. Aqui, testamos a hipótese de que o resultado cirúrgico local poderia ser melhorada se RFA foi usado como uma estratégia imunogênica pré-resectional para aumentar a imunidade antitumoral. Nós relatamos que o controle de tumor local e sistêmica ea sobrevida global foram significativamente melhorados como resultado da indução de uma CD8

+ resposta adaptativa mediada por células T imune após pré-resectional RFA em um rato modelo para o cancro colorectal.

Materiais e Métodos

ratos

fêmea BALB /c e C57BL 6 ratos /(8-12 semanas) eram do Instituto Nacional de Câncer ou Charles River. ratinhos imunodeficientes combinados graves (CbySmn.CB17-Prkdc

scid /J SCID /BALB /c; Jackson Laboratory) e Clone 4 ratinhos transgénicos (CBy.Cg-

Thy1a

Tg (Tcra (C14, TcrbC14) 1Shrm /ShrmJ) expressando um receptor de células α /β T específicas para hemaglutinina da gripe (HA;. de Linda Sherman, Scripps Research Institute, La Jolla, CA) foram criadas no Roswell Park Department of Laboratory animal Resources os ratinhos foram mantidos em pathogen- condições de barreira livres. Todos os cuidados e procedimentos animais estavam em conformidade com as políticas institucionais para a saúde animal e bem-estar e aprovado pelo Comitê animal Care e Uso do Roswell Park Cancer Institucional (IACUC).

transplantáveis ​​modelos de tumor e CD8

+ T depleção de células

células tumorais (células de adenocarcinoma de cólon CT26 e o ​​derivado CT26-HA transfectadas com um gene que codifica a hemaglutinina [21, 22] singênica para BALB /c ou SCID; B16.F10 melanoma singeneicos para C56BL /6 ratos) foram cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal de vitelo inactivado pelo calor (Life Technologies, Carlsbad, CA), 2 mM de L-glutamina, 100 U /ml de penicilina, 50 ug /ml de estreptomicina, 50 uM β-mercaptoetanol, e G418 (400 ug /ml; para CT26-HA). As células tumorais (10

6 para CT26 ou 3×10

5 para B16; em 100 mL PBS) foram injectados s.c. no flanco de ratinhos singeneicos, a menos que indicado de outra forma. Os volumes tumorais (variando de 150-500 mm

3) não foi significativamente diferente entre os grupos atribuídos no momento do tratamento inicial. Os volumes dos tumores foram calculados através da determinação do comprimento de curto (

l

) e longo (

G)

diâmetros (Volume = L

2 x l /2). pontos finais experimentais foram alcançados quando os tumores excedeu 20 mm de diâmetro ou quando os ratos se tornou moribunda e mostrou sinais de recumbancy lateral, caquexia, a falta de resposta a estímulos nocivos, ou perda de peso observável. O nó inguinal ipsilateral foi identificado como o TdLN sentinela por localização de corante azul de Evans 1 minuto após a injecção de corante próximo do s.c. local do tumor. Para modelar final metástase pulmonar fase, 10

5 CT26 células foram injectados na veia da cauda 7 dias após primária, s.c a injecção do tumor; 30 dias depois, nódulos CT26 foram enumeradas por investigadores cegos para provar identidade em pulmões inflados coradas com uma solução de 15% da Índia tinta e branqueada pela solução da Fekete. Para a depleção de células T CD8

+ células T in vivo, os ratinhos foram injectados i.p. com 400 mcg de CD8a anti-mAb (53-6,72, BioXCell) a cada 7 dias começando imediatamente o tratamento pós-RFA. CD8

+ depleção de células T foi confirmada por citometria de fluxo utilizando anti-CD8β mAb (YTS156.7.7, Pe-Cy7) (BioLegend); + células T 2% de CD3

eram CD8

+ após tratamento com o anticorpo

RFA

Os ratinhos foram anestesiados com o gás isoflurano por via inalatória (4% de isoflurano para a indução anestésica;. 1,5% para manutenção). Os ratos foram posicionados no propenso uma almofada de terra condutora de electricidade, e a área de tumor foi molhada com água destilada antes de se inserir a sonda StarBurst SDE (AngioDynamics) no centro do tumor. Maintining uma temperatura ponta da sonda de 90 ° C durante 1 minuto, utilizando o gerador de RFA RITA 1500 (AngioDynamics) simulado a definição clínica de recorrência do tumor após RFA, como anteriormente descrito por Johnson et al [23]. Sham RFA foi realizada pela inserção da sonda no interior do tumor sem corrente eléctrica. Para os grupos de controlo adicionais RFA foi administrada sob a pele para longe da s.c. tumor (de volta ou seja, superior). Os ratinhos foram recuperados em uma manta de aquecimento e uma dada analgésico (buprenorfina 0,05 mg /kg de peso corporal) por via s.c. para controle da dor.

A ressecção cirúrgica

Os ratos foram anestesiados com gás isoflurano por via inalatória e os tumores foram retirados com 1 margens mm em torno da borda visível do tumor. Fáscia foi ressecado juntamente com tumor (

en bloc

) em todos os casos para minimizar a recorrência da margem de profundidade. avaliação patológica da interface tumor /estromal no momento da excisão em ratinhos sentinela revelaram tumor infiltrante nas fronteiras em 40-60% dos ratos independentemente de pré-resectional RFA foi administrado. As incisões foram fechadas com sutura 4-0 Vicryl® (Ethicon, Inc., Somerville, NJ) e /ou agrafos de aço, que foram removidos em 7-10 dias. Como um controlo simulado cirúrgica, os ratos foram submetidos a uma incisão na pele de 1 cm e de fecho no flanco contralateral sem manipulação do local do tumor. Em experiências seleccionadas, a ressecção parcial foi realizada, classificadas por doença residual macroscópica e microscópica detectável em que ~ 50% da massa do tumor foi excisado. Os ratinhos foram recuperados em uma manta de aquecimento e uma dada analgésico (buprenorfina 0,05 mg /kg de peso corporal) por via s.c. para controle da dor.

A transferência adoptiva de Clone 4 CD8

+ células T

esplenócitos reunidas e linfonodo (LN) de células a partir do clone ratinhos transgénicos de receptor de células T 4 foram positivamente enriquecida por célula magnética classificação usando um kit de isolamento de células T CD8a (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). populações isoladas foram composto de ~ 85-90% L-selectina

hi CD44

baixo naïve CD8

células + T de análise de citometria de fluxo como determinado. números equivalentes de Clone 4 CD8

+ T células (5-10 x 10

6) marcado com acompanhamento de corante (TRITC 4 mm; Molecular Probes) [22, 24] i.v. foram injetados em ratinhos individuais 6 horas após a RFA ou tratamento simulado. tecidos TdLN e tumorais foram congeladas em óptimo composto temperatura de corte (Sakura Finetek).

Serum IFN-γ análise

O soro foi adquirido a partir de ratos 1 dia e 7 dias post RFA ou tratamento simulado via sangramento retro-orbital. Os espécimes foram armazenados congelados a -80 ° C até ao ensaio por ELISA comercial para IFN-γ (R D Systems).

Para a análise imuno-histoquímica, série 9 mm seções criost�icas

imunohistoquímica e histologia imunofluorescência de TdLN ou tumor foram fixadas em acetona, bloqueados com tampão de bloqueio Superblock (Pierce), e coradas com anticorpos de rato anti-monoclonais específicos para CD8a (53-6,7; BD Biosciences) [22]. Os complexos imunes foram visualizados utilizando os kits de substrato Vectastain Elite ABC e DAB (Vector Laboratories). Para a histologia imunofluorescência, 9 uM criocortes foram fixadas à temperatura de -20 ° C em metanol /acetona (3: 1), e coradas com anticorpos monoclonais (anticorpo anti-rato PNAD, MECA-79; anticorpo anti-ratinho CD31, MEC 13,3, BD Biosciences) e anticorpo secundário conjugado com fluorocromo (Jackson ImmunoResearch), como descrito [22, 24]. As imagens digitais de ≥10 campos selecionados aleatoriamente (unidade de área = 0,34 mm

2 por campo) foram capturados por observadores cegos para provar a identidade utilizando um microscópio de fluorescência ereto Olympus BX50 equipado com uma câmera SPOT RT (Spectra Services). O número de adoptivamente células transferidas localizados dentro do parênquima do TdLN ou tumores (ou seja, designado por localização das células T marcado com fluorescência fora PNAD

+ ou CD31

+ navios, respectivamente) foi quantificada com o software ImageJ como descrito [ ,,,0],21, 24, 25].

a citometria de fluxo

tumores CT26 de 1,100-1,700 mm

3 foram utilizados para o tratamento de RFA, a fim de ter o tecido do tumor residual suficiente para analisar por citometria de fluxo . Tumores ou baços foram desagregados (Medimachine, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) e análise fenotípica foi efectuada utilizando citometria de fluxo multiparamétrica após coloração com anticorpos monoclonais: anti-CD8a (53-6,7, Pe-Cy7), anti-CD4 (RM4- 5, PerCP ou V450), anti-CD25 (PC61, APC), anti-L-selectina (Mel-14, a APC ou PE), anti-CD44 (IM7, FITC), anti-CD3 (17A2, FITC), anti -CD11b (M1 /70, Pe-Cy7), anti-Gr-1 (RB6-8C5, APC), anti-F4 /80 (T45-2342, PE), anti-MHC II (2G9, FITC), anti- CD45 (30-F11, BUV395) (BD Biosciences); anti-FoxP3 (FJK-16, PE) (eBioscience); anti-CD8β (YTS156.7.7, Pe-Cy7) e anti-CD206 (C068C2, BV421) (BioLegend). análise de citometria de fluxo foi realizada utilizando um LSR II ou LSRFortessa com software FACSDiva (BD Biosciences) e programa de processamento de WinList (Verity Software House).

A análise estatística

A significância estatística do crescimento do tumor foi determinada por 2-way ANOVA para medidas repetidas. A sobrevivência foi analisada com o método de Kaplan-Meier e os grupos foram comparadas pelo teste de log-rank ou pelo teste Gehan-Breslow-Wilcoxon. Todas as outras diferenças entre os grupos foram avaliadas por 2 caudas de Student não pareado

t

-teste. Os dados são apresentados como média ± SEM e

P Art 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

Pré-resectional RFA melhora o controle local do tumor e sobrevivência

para determinar se o tratamento RFA antes da ressecção cirúrgica poderia diminuir a recorrência local e melhorar a sobrevivência, foi utilizado um modelo de rato para CT26 adenocarcinoma do cólon para simular o ambiente clínico onde RFA fornece controle inicial do tumor, mas é muitas vezes seguida de recorrência local. Em estudos-piloto que optimizaram o tamanho do tumor no momento da ablação em conjunto com a temperatura e a duração da RFA. Para estes estudos s.c. CT26 tumores de tamanho aproximadamente equivalente (~ 150-500 mm

3 em volume) foram tratados com ARF (1 minuto de ablação a 90 ° C) no dia 10 após a implantação. A ressecção da mesma lesão foi efectuada no dia 17, como indicado no desenho esquemático mostrado na Figura 1A e 1B. Nós somos eleitos para usar este intervalo de 7 dias entre RFA e cirurgia para que haja tempo suficiente para uma resposta imune antitumoral primário a ser gerado após a ablação [11, 13, 26]. Os ratinhos de controlo tiveram ressecção ou RFA somente no dia 10, seguido por cirurgia sham (fora da região do tumor) no dia 17, ou cirurgias simuladas em ambos os dias 10 e 17 (Fig 1A).

(A) Tempo cronograma descrevendo o diferentes tratamentos utilizados. Ratinhos BALB /c (10-12 ratos /grupo) foram injectados s.c. com 10

6 CT26 células no flanco esquerdo no dia 0. Os tratamentos foram realizados 10 dias após a inoculação do tumor. Os tumores primários foram tratadas como indicado com cirurgia simulada, ressecção (Rxn), ou RFA nos dias 10 ou 17. (B) sequência esquemática ilustrando administração de RFA (90 ° C durante 1 minuto) 7 dias antes da ressecção cirúrgica. As curvas de crescimento do tumor (C) e as curvas de sobrevivência (D) de ratinhos portadores de tumores CT26 em diferentes grupos de tratamento. Em (C), o número de sobreviventes a longo prazo sem reincidência do tumor no dia 150 é indicado para cada grupo experimental; para (D) *

P Art 0,001 para o grupo de pré-RFA resectional em comparação com todos os outros grupos. (E) os ratinhos sobreviventes (n = 9) no grupo pré-RFA resectional foram retomou com 10

6 CT26 células para o (direita) contralateral flanco no dia 150. curvas de crescimento do tumor são descritos em que

T

= 0 corresponde à altura da injecção de tumores secundários. Como um controlo, o crescimento do tumor foi monitorizado após a inoculação da mesma dose de células de tumor para não-tumor (NT) -experienced ratinhos BALB /c naive (n = 10); *

P Art 0,005, tal como determinado por análise de Kaplan-Meier. Uma experiência representativa de ≥ três experimentos independentes é mostrado.

Usando este plano experimental descobrimos que o tratamento de CT26 com RFA sozinho resultou em 60-80% de necrose das lesões tumorais individuais seguidos por ≥ tumor de 75% recorrência se nenhuma terapia adicional foi dado (Fig 1C). Do mesmo modo, a excisão cirúrgica sozinho foi associada a uma taxa de recorrência local ≥ 75%. Em contraste, a combinação de RFA seguido por ressecção nitidamente retardado desenvolvimento de tumor em comparação com os grupos de tratamento individuais ou grupos de controlo excisão sham (Fig 1C). Notavelmente, a recorrência do tumor não foi detectado por mais de 150 dias em ~ 80% (9 de 11 ratinhos) de ratinhos tratados com a combinação de RFA e cirurgia subsequente. RFA seguido por ressecção ainda demonstrou melhorou significativamente a sobrevida em comparação com todos os outros grupos neste modelo de tumor CT26 letal (Fig 1D). A este respeito, RFA seguido por ressecção resultou em ~ sobrevida livre de recorrência local de 80% em comparação com a sobrevivência ~ 20% após o tratamento único com qualquer RFA ou ressecção sozinho.

experiências adicionais excluída a possibilidade de que o benefício terapêutico observado combinada de RFA e ressecção poderia ser atribuído a

(1)

diferenças no tempo total do hospedeiro foi exposto a antigénios de tumor em diferentes grupos de tratamento (isto é, 10 dias para o grupo ressecção seguido por cirurgia simulada contra 17 dias para RFA + grupo ressecção),

(2)

cirurgia mais eficaz por causa do debulking tumor inicial durante RFA pré-resectional, ou

(3)

inflamação desencadeada pela inserção da sonda (S1A Fig). Para estas experiências, não se observou melhoria nos CT26 atraso do crescimento do tumor ou sobrevivência se inicial do tumor-citorredução foi obtida no dia 10 por ressecção parcial (isto é, 50% de redução da massa tumoral) seguido por ressecção excisional no dia 17 ou após RFA sham em qual a sonda foi inserida a ablação em tumores sem corrente eléctrica (S1B e Fig S1C). Estudos adicionais em melanoma B16 em singênica camundongos C57BL /6 (S2A-S2C Fig) estabeleceu que RFA na configuração antes da cirurgia neoadjuvante tem um benefício terapêutico semelhante ao observado para os tumores do cólon CT26. Assim, as actividades de protecção de RFA pré-resectional não se restringem a um tipo de tumor histológico particular.

Uma característica da imunidade adaptativa é o desenvolvimento de memória imunológica definido pela capacidade de exposição prévia a antigénios tumorais para desencadear uma recordar resposta após re-exposição. Portanto, nós investigamos se os ratinhos sobreviventes RFA e ressecção de tumores CT26 após combinado desenvolvido reactividade antitumoral por rechallenging sobreviventes a longo prazo (, 150 dias a implantação do tumor pós-primária ou seja) com s.c. tumor CT26 no flanco contralateral. -Idade correspondente, não tratado não tumoral (NT) -experienced ratinhos naive foram usadas como controlos. Como mostrado na Fig 1E, um atraso significativo no crescimento do tumor CT26 foi observada em ratinhos reexpostos que tinham sido tratados anteriormente com RFA seguido por excisão cirúrgica. Tomados em conjunto, estes dados são consistentes com o desenvolvimento de uma resposta imune adaptativa após RFA pré-resectional que reduz a recorrência local e melhora a sobrevida, promovendo a imunidade de longa duração, sistêmica.

Sobrevivência benefício da RFA pré-resectional depende na imunidade adaptativa

para investigar formalmente se a ativação RFA de uma resposta imune adaptativa específica do tumor antes da excisão cirúrgica é causal para limitar o crescimento do tumor foram examinados os efeitos deste regime terapêutico combinado na progressão do tumor CT26 em ratinhos imunodeficientes combinados graves (SCID) que carecem de células T funcionais e células B (Fig 2A). A sobrevivência foi utilizado como o ponto final primário para determinar a eficácia uma vez que a análise do volume do tumor primário não foi informativo em ratinhos imunodeficientes que frequentemente sucumbiram a doença disseminada (isto é, no peritoneu), independentemente do tamanho do tumor primário ou o tipo de terapia. Em nítido contraste com o benefício de sobrevivência observada em camundongos imunocompetentes (Fig 1D), não conseguimos detectar qualquer vantagem de sobrevivência em camundongos SCID tratados com RFA combinado e ressecção quando comparados com um ou outro tratamento sozinho (Fig 2B). Esta dependência da resposta imune adaptativa fornece evidência adicional de que o benefício do pré-resectional RFA não podem ser explicados apenas com base dos efeitos citoredutores de ablação térmica.

(a) O cronograma descrevendo grupos de tratamento. ratinhos SCID (5 ratinhos /grupo) foram implantados s.c. com 10

6 CT26 células no flanco esquerdo no dia 0. Os grupos de tratamento incuded cirurgia fictícia, a ressecção (Rxn), ou RFA nos dias 10 ou 17. curvas (B) de sobrevivência são representativos de duas experiências independentes; ns, não significativa, conforme determinado pela análise de Kaplan-Meier.

Pré-resectional RFA aumenta circulando Th1 /CD8

+ T citocinas dirigida por células e a proporção de CD8

+ células T para células T reguladoras no microambiente tumoral

para obter conhecimento sobre o papel da resposta imune na mediação da actividade anti-tumoral de pré-resectional RFA foram avaliados os níveis de citocinas imunitárias após a administração da ARF em tumores CT26 circulante. Encontramos uma tendência para um aumento das concentrações do protótipo Th1 /CD8

+ T dirigida por células citocina IFN-γ em circulação tão cedo quanto 1 dia pós-RFA, quando comparados com os ratos tratados com placebo e indução de IFN-γ ainda mais forte foi evidente 7 dias após o tratamento RFA (Fig 3A). Estes dados estão de acordo com as contribuições de Th1 /CD8

+ T dirigida citocinas de células na geração de uma resposta imunitária anti-tumoral sistémica.

(A) perfil de IFN-γ no soro de murganhos portadores de tumor CT26 de 1 e 7 dias de tratamento pós-RFA. *

P Art 0,02, sham contra RFA. (B) fotomicrografias representativas de imunocoradas endógena CD8

+ T células e quantificação de CD8

+ infiltração de células T em secções de tecido de tumor de 7 dias após a cirurgia sham ou RFA. barra de escala, 100 mm. (C)

Painel esquerdo

, quantificação de leucócitos de infiltração em tumores 7 dias após o tratamento por citometria de fluxo; células T reguladoras CD8

+ células T (CD3

+ CD8

+), CD4

+ células T (CD3

+ CD4

+), (CD3

+ CD4

+ Foxp3

+ CD25

+ T

reg), células supressoras derivadas mielóides (CD11b

+ Gr-1

+ F4 /80

-); M1 (CD11b

+ Gr-1

-F4 /80

+ CD206

loMHCII

oi) e M2 (CD11b

+ Gr-1

-F4 /80

+ CD206

hiMHCII

lo) macrófagos. Os dados são para 10

3 células totais em amostras de tumor.

Painel direito

, proporção de CD8

+ células T efetoras (T

eff, L-selectina

baixo CD44

oi): T

reg em tumores determinado pelo fluxo citometria. (D)

Painel esquerdo

, quantificação de leucócitos totais em baços de ratinhos portadores de tumores 7 dias após tratamento RFA por citometria de fluxo.

Painel direito

, proporção de CD8

+ células T efetoras (T

eff, L-selectina

baixo CD44

oi): T

reg em baço. Dados (B-D) são representativos de ≥ 2 experimentos independentes (

n

= 3-5 ratos por grupo); Os volumes tumorais variaram de 1,100-1,700 mm

3) no momento do tratamento RFA. *

P Art 0,05, sham contra RFA; ns, não significativo.

Estes resultados, em conjunto com evidência de controle do tumor a longo prazo após combinado RFA e cirurgia, levou-nos a hipótese de que o controle local do tumor melhorada pode envolver mudanças na proporção de intratumoral células T subconjuntos que não tenha sido previamente investigados seguinte RFA. Estudos pré-clínicos em coelhos relataram aumento da infiltração intratumoral por CD3

células + T em lesões tratadas após RFA, embora CD4 específica

+ ou CD8

subpopulações de células T + não foram examinadas [14, 27]. Estudos clínicos têm demonstrado adicionalmente um aumento na circulação de CD4 específico de tumores

+ e CD8

+ células T em doentes com carcinoma hepatocelular (HCC) a 4 semanas de tratamento pós-RFA [15]. Por outro lado, RFA supostamente provoca uma diminuição na circulação de CD4

+ CD25

+ Foxp3

+ células T reguladoras imunossupressores (T

reg) 30 dias pós-tratamento em pacientes com câncer de pulmão que é notável, uma vez T

reg neutralizar a função de citotóxico CD8

+ células T efetoras [6, 28]. Além disso, os altos níveis circulantes de células imunológicas supressoras incluindo t

reg ou células supressoras derivadas de mielóides (MDSC) foram recentemente mostrado ser prognóstico de recorrência do tumor após RFA no cancro do pulmão de células não pequenas, (NSCLC) pacientes e HCC pacientes [29, 30]. No entanto, as implicações desses resultados ainda não está claro uma vez que flutuações na circulação de células do sistema imunológico não são necessariamente reflexo de seu nível de localização intratumoral após RFA.

Para determinar se RFA pré-resectional afetados infiltração intratumoral por subpopulações de células imunes específicas na altura da excisão cirúrgica, que quantificada células CD8

+ T 7 dias após a ablação em tumores ressecados CT26, bem como no baço como um exemplo de um órgão linfóide periférico que é um local de activação imunitária. A análise imunohistoquímica mostrou mínima infiltração intratumoral linha de base endógena CD8

+ T células em camundongos tratados com placebo (Fig 3B), em linha com os relatórios do nosso grupo e outros que tumores CT26 não são permissivas ao acúmulo de células T intensiva [21, 22 , 31]. No entanto, um aumento marcado em

+ infiltração de células T CD8 intratumoral foi detectada após tratamento RFA quando comparados com os controlos sham (Fig 3B). análise de citometria de fluxo revelou ainda que a infiltração por CD8

+ células T em relação à população total de células intratumoral foi significativamente melhorada de 7 dias após RFA enquanto que a densidade relativa de um total de CD4

+ células T ou CD4

+ CD25

+ Foxp3

+ T

reg subconjunto permaneceu inalterada (Fig 3C)

Foi examinado o impacto da RFA em CD8

celulares + T:.

rácios reg T dentro tumores uma vez que este é declaradamente um forte indicador prognóstico de um desfecho favorável para câncer colorretal metastático [32]. RFA foi encontrado para aumentar a proporção global de CD8

+ efetoras (L-selectina

baixo CD44

oi) de células T: T

reg dentro RFA tumores tratados (Fig 3C). Um aumento significativo na CD8

+ de células T: rácio Treg também foi observado no baço 7 dias pós-RFA (Figura 3D); no entanto, este rácio mais favorável foi conseqüência de uma diminuição global na proporção de T

reg dentro do compartimento do baço, em vez de um aumento de CD8

células + T como foi observado no microambiente tumoral (Fig 3C). Diminuição T

reg no baço poderia refletir a carga tumoral reduzida que resulta da terapia de ablação. A densidade relativa de células mielóides que expressam marcadores fenotípicos para CD11b

+ Gr1

+ MDSC, CD11b

+ Gr-1

-F4 /80

+ CD206

loMHCII

oi macrófagos M1, ou CD11b

+ Gr-1

-F4 /80

+ CD206

hiMHCII

lo M2 macrófagos subconjuntos não foi alterada pelo tratamento RFA quer dentro tumores ou o baço. (Figura 3C e 3D). Em conjunto, esses resultados sugerem que a RFA-induz alterações na tessitura imunológico favorecendo Th1 /CD8

+ ativação de células T nos órgãos microambiente do tumor e linfóides periféricos contribuir para um melhor controle do tumor local e sistêmica após a ressecção cirúrgica.

expansão Antigen dependente de CD8

+ células T ocorre nos gânglios linfáticos de drenagem do tumor e do microambiente tumoral após pré-resectional RFA

Nós fundamentado que o aumento da CD8

+ células T efetoras detectada em tumores após RFA poderia resultar a partir da geração de uma resposta imunitária adaptativa específica de antigénio, como descrito anteriormente [11, 14, 15], ou, alternativamente, a partir de um aumento de localização não restrita do antigénio devido à inflamação aguda que se segue depois a morte celular causada por catastrófica ablação térmica. Para distinguir entre estas possibilidades, os ratos foram implantados s.c. murino com adenocarcinoma do cólon CT26 manipulada para expressar um antigénio associado a um tumor substituto, hemaglutinina (HA-CT26), permitindo, assim, para monitorar

+ resposta das células do tumor-antigene (HA) espec�ico T CD8. Um segundo grupo de ratinhos foi implantado com a linha de tumor CT26 parentais faltar antigénio HA. *

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