Abstract

Purpose

Cancro associados fibroblastos do estroma (CAFS) sofrem transcricional e alterações fenotípicas que contribuem para a progressão do tumor, mas os mecanismos responsáveis ​​por estas alterações não são bem compreendidos. metilação do DNA aberrante é uma importante causa de alterações de transcrição em células cancerosas, mas não se sabe o quão importante alterações de metilação do DNA são ao comportamento CAF.

Experimental Design by

Nós usamos matrizes de exão Affymetrix para comparar genes induzida pelo inibidor da metilação do DNA 5-aza-dC em fibroblastos câncer pancreático associados cultivadas, fibroblastos controle pancreáticas e linhas celulares de cancro do pâncreas.

resultados

Nós descobrimos que FAC pancreáticas e controlar fibroblastos pancreáticas foram menos sensível à reactivação do gene 5-aza-dC-mediada de células de cancro do pâncreas (média +/- DP de genes induzida ≥5 vezes foi de 9 ± 10 genes em 10 culturas CAF pancreáticas, 17 ± 14 genes em 3 de controlo de culturas de fibroblastos de pâncreas, e 134 ± 85 genes em 4 linhas celulares de cancro pancreático). Examinamos genes diferencialmente expressos entre FAC e fibroblastos de controlo para genes candidatos metilado e identificou a desintegrina e metaloprotease,

ADAM12

como hypomethylated e sobre-expresso em linhas CAF pancreáticas e sobre-expressos em fibroblastos adjacentes à adenocarcinomas pancreáticos primários.

Conclusões

em comparação com células de câncer pancreático, alguns genes são reactivados pela inibição DNMT1 na FAC pancreáticas que sugerem estas células não abrigam muitas alterações funcionais importantes na metilação do DNA. FAC também pode não ser muito sensível a terapêutica alvo com inibidores de metilação do DNA

Citation:. Yu J, Walter K, Omura N, Hong S-M, Jovem A, Li A, et al. (2012) Ao contrário das células do cancro do pâncreas Cancro do pâncreas associados fibroblastos Mostrar Indução Gene Minimal após 5-aza-2′-desoxicitidina. PLoS ONE 7 (9): e43456. doi: 10.1371 /journal.pone.0043456

editor: Brock C. Christensen, Geisel School of Medicine, em Dartmouth, Estados Unidos da América

Recebido: 10 Abril de 2012; Aceito: 24 de julho de 2012; Publicado: September 11, 2012 |

Direitos de autor: © Yu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por subvenções do National Cancer Institute (CA62924 e RC2148346), eo Rolfe Fundação Michael. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

As mudanças epigenéticas na expressão dos genes são uma característica fundamental das células [1] cancerosas. Uma das melhores alterações epigenética caracterizados é a metilação do DNA. padrões de metilação do DNA são hereditárias e são mantidos após a divisão celular, principalmente, pelo DNA metiltransferase DNMT1. hipermetilação DNA aberrante muitas vezes ocorre em ilhas CpG em genes promotores e está associada com um estado e do gene da cromatina repressão fechado. Evidência considerável indica que a hipermetilação aberrante de genes e silenciamento dos supressores de tumores e outros genes reguladores contribui para o desenvolvimento de cancros pancreáticos e outros [2]. hipometilação aberrante de genes normalmente silenciosos e metilados foi igualmente descrito no pâncreas e outros cancros como uma causa de sobre-expressão génica aberrante [3], [4].

Os mecanismos responsáveis ​​por estes padrões de metilação aberrante em cancros não são bem compreendido, mas suspeita mecanismos incluem superexpressão de

DNMT1

, acúmulo de alterações de metilação do DNA com a idade [5], [6] e influências ambientais [7], atividade alterada do

de novo

enzimas de metilação

DNMT3a

e

DNMT3B

[8], [9] e, possivelmente, a partir microambiente celular alterado tal como de inflamação crônica [3], [10].

as células do estroma não neoplásicas dentro do microambiente do tumor também sofrer alterações fenotípicas da transcrição e outras em relação a células normais que se pensa contribuir para a progressão do tumor. cancro do pâncreas é uma doença mortal [11] e é bem conhecida pela sua extensa resposta do estroma desmoplástico compreendendo uma média de 75% das células na massa do tumor [12]. Suspeita-se que o componente do estroma contribui para a resistência de cancros pancreáticos para terapias de drogas [13], e vários estudos implicam diferenças no comportamento do estroma com o resultado do paciente em cancros pancreáticos e outros [14], [15], [16], [ ,,,0],17], [18]. Câncer associado fibroblastos (FAC), o tipo de célula predominante no microambiente estromal, adotar um fenótipo ativado durante a tumorigênese, passando por morfológica, e a expressão do gene funcional muda em relação a fibroblastos normais [19]. Estes FAC activados caracterizam-se por actina α-de músculo liso (SMA-α) expressão de [20], contráctil aumentada e capacidade secretora, e aumentou a síntese de colagénios, proteínas da matriz extracelular [21] e factores de crescimento incluindo o factor de crescimento epitelial, em plaquetas factores de crescimento derivados (PDGF), factor de crescimento de fibroblastos básico, factor de crescimento de hepatócitos, e factor de crescimento transformante beta (TGF-β) [22]. Através destes e de outros sinais, FAC interagir intimamente com células tumorais para promover o seu crescimento, e, portanto, FAC são de considerável interesse como um alvo terapêutico. Com efeito, as estratégias recentes para segmentar FAC incluem a utilização do inibidor da cinase, imatinib para bloquear os receptores do estroma PDGF [23], os anticorpos para bloquear o factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) derivada a partir de ambas as células e FAC de cancro para inibir a angiogénese do tumor [24] e a utilização de inibidores de smoothened (SMO) para bloquear a sinalização de Hedgehog tumor estromal e esgotar fibroblastos estromais que sobre-expressam o receptor de hedgehog (Hh) Smo [25], [26], [27], [28]. Que os ensaios iniciais de inibidores de smoothened em cânceres de pâncreas não mostraram evidência de benefício destaca a necessidade de estudos básicos investigando interações do estroma tumoral. Outra vantagem potencial de segmentação estroma cancro é o de melhorar a acessibilidade de agentes terapêuticos para as células cancerígenas pancreáticas. Por exemplo, a droga nab-paclitaxel (Abraxane), uma formulação de nanopartículas de paclitaxel, liga-se a Sparc, uma proteína da matriz estromal muitas vezes altamente expressa no estroma do cancro do pâncreas que medeia interacções do estroma do tumor, deste modo potencialmente aumentando a entrega da droga para o tumor [29] , [30]. Os ensaios clínicos de Abraxane no cancro mostram a promessa de pâncreas e em modelos animais não há evidências que sugerem que a entrega de gemcitabina ao tumor é melhorada com Abraxane, e com inibidores de hedgehog [25]. Eficácia da combinação droga /Abraxane gemcitabina ainda aguarda os resultados da fase 3 de testes clínicos.

A influência da FAC sobre o crescimento do câncer tem sido demonstrado em vários estudos [31], [32], mas os mecanismos moleculares subjacentes à CAF fenótipo não são bem compreendidos. Embora uma grande influência da FAC é suspeito de ser o microambiente do tumor incluindo influências das próprias células cancerosas, FAC conservam as suas propriedades promotoras de tumores

in vitro

após cultura prolongada de células [33], o que sugere que os mecanismos hereditários são responsáveis . Apesar de alterações genéticas em FAC foram descritas, estudos mais recentes que investigam a possibilidade de que FAC sofrer alterações genéticas clonais semelhantes às células cancerosas não encontraram nenhuma evidência para tais alterações [33], [34], [35], [36], [37 ], [38]. Na ausência de mutações genéticas generalizadas, é razoável suspeitar que mecanismos epigenéticos como a metilação do DNA, que são mitoticamente hereditárias, são responsáveis ​​pelas alterações estáveis ​​de expressão gênica em FAC. De fato, vários genes implicados em interações tumor-estroma e induzida em FAC por co-cultura com células cancerosas, tais como

SPARC

[29], [30],

COX-2 Comprar e metaloproteinases de matriz (MMPs) [39] são regulados por metilação do DNA. Além disso, FAC são submetidos às mesmas influências no microambiente do tumor que são pensados ​​para contribuir para mudanças de metilação em células cancerosas, tais como inflamação crônica [34].

A heterogeneidade da FAC de tumores diferentes e até mesmo dentro do mesmo tumor [14], [30] também sugere que FAC tem múltiplas fontes que possam contribuir para as diferenças epigenéticas. Além disso a activação de fibroblastos residentes no microambiente do tumor, alguns FAC são de medula óssea precursoras de células mesenquimais derivadas [40], [41] e talvez células epiteliais ou endoteliais submetidos mesenquimais transição [21], [42]. Porque esses processos de diferenciação e transdiferenciação são reguladas por mecanismos epigenéticos [43], FAC provenientes de fontes diferentes têm diferentes epigenética e perfis de transcrição em comparação com os seus homólogos de tecido residentes.

Apenas alguns estudos começaram a explorar mecanismos epigenéticos para essas mudanças de transcrição em FAC. Um dos primeiros estudos que fornecem evidência de diferenças de metilação do DNA entre as células estromais normais e tumorais associadas teve uma abordagem de todo o genoma usando cariotipagem digitais específica de metilação (MSDK) ao perfil células epiteliais, células mioepiteliais e fibroblastos do estroma durante a progressão do tumor da mama [35] . Outra abordagem que combina a laser microdissecção de captura com metilação PCR específico (MSP) de genes candidatos identificados metilação do promotor frequente de

GSTP1 Comprar e

RARB2

em células estromais associadas ao tumor de próstata em relação ao normal células estromais da próstata [ ,,,0],44]. Uma terceira abordagem utilizando SNP análise de arranjo sensível à metilação (MSNP) demonstrou ganhos focais na metilação e hipometilação global em miofibroblastos associados ao câncer gástrico [36].

Uma estratégia útil para a identificação de eventos de metilação é a realização de uma reativação do gene inibidores de metilação do DNA de tela utilizando tais como 5-aza-2′-desoxicitidina (5-aza-dC), que tem como alvo selectivamente a enzima DNMT1 por esgotamento. Este método tem a vantagem de identificar as alterações da metilação do DNA que regulam a transcrição e, portanto, mais provável que seja funcionalmente importante. Embora esta abordagem tenha identificado com sucesso eventos de metilação em células de cancro a partir de vários tipos de tumores [45] para o nosso conhecimento, esta abordagem não tem sido utilizada para identificar genes regulados por metilação em FAC. Para determinar se a metilação do DNA são reguladores semelhante importantes de mudanças de expressão gênica em FAC como para linhas celulares de cancro, foi realizada uma análise de re-expressão do genoma de fibroblastos associados ao câncer de pâncreas humanos e linhas celulares de cancro do pâncreas utilizando 5-aza-DC.

Materiais e Métodos

Cultura de linhas celulares

As culturas primárias de fibroblastos estromais, câncer associado fibroblastos designados (FAC) CAF9, CAF11, CAF12, CAF13, CAF14, CAF15, CAF16, CAF18, CAF19, CAF20, CAF21, CAF22, CAF25 e CAF35 foram estabelecidas a partir de tecido de câncer pancreático cirurgicamente ressecados de 13 pacientes (6 do sexo masculino significa ± desvio padrão (DP) de idade de 58 ± 7 anos), com clinicamente esporádica adenocarcinoma ductal pancreático. Os cancros foram todos moderada a fracamente diferenciado com um tamanho de tumor médio de 3,5 cm. Estas culturas CAF primários foram estabelecidas como descrito anteriormente [27], como foram dois fibroblastos controle imortalizado-hTERT (SC2 e SC3, estabelecidos a partir de tecido pâncreas não-neoplásica cirurgicamente ressecado a partir de 2 fêmeas (idade média de 63 anos) [27]. A imortalizado linha de células humanas pancreáticas expressam Nestin (HPNE) foi generosamente fornecidos pelo Dr. Michel Ouellette (University of Nebraska Medical Center) [46]. Quatro linhas celulares de cancro do pâncreas, incluindo A32-1, Panc2.8, Panc3.014 e Panc215 estabelecida a partir de adenocarcinomas do ducto pancreático primários na instituição, e descritos anteriormente [47] também foram utilizados neste estudo Todas as linhas celulares foram mantidas em DMEM (4,5 mg de glucose /mL; Invitrogen). contendo 10% FBS sob condições padrão como descrito anteriormente [48] . Todos os estudos foram realizados com aprovação do Comitê de Hopkins da Johns de Investigação Clínica.

tratamento de 5-aza-dC e RNA extração

as células foram colocadas em placas a 2 × 10

5 células por frasco T75 e tratou-se no dia seguinte com uma umol /L de 5-aza-2′-desoxicitidina (5-aza-dC, Sigma) [49] durante 4 dias durante a fase de crescimento exponencial, com uma mudança dos meios de comunicação e cada fármaco 24 horas. No dia 5, quando as células estavam quase confluentes, estas foram lavadas com PBS frio e o ARN total isolado utilizando um kit Qiagen (Qiagen) ou o kit miRvana miARN (Ambion), de acordo com as instruções do fabricante, conforme descrito anteriormente [50].

matriz de exões e de selecção de genes para validação

a plataforma Affymetrix GeneChip matriz Exão 1.0ST humano foi usado para analisar os padrões de expressão de genes em não tratada e 5-aza-dC tratada fibroblastos e linhas celulares de cancro, como anteriormente descrito [27]. Estamos em conformidade com as informações mínimas sobre um orientações Microarray experimentar e apresentaram os nossos dados de microarranjos definido para o Gene Expression Omnibus repositório (GEO Adesão # GSE20911).

RT-PCR quantitativa (qRT-PCR)

1 ug ARN total foi transcrito reversamente de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen). O ADNc resultante foi amplificado num ABI 7300 termociclador PCR em tempo real utilizando SYBR Green PCR Master Mix e recomenda condições de PCR (Applied Biosystems). O gene housekeeping

GAPDH

foi utilizado para normalização. Primer especificidade foi confirmada através de análise de fusão curva. Os resultados são expressos como valores de expressão normalizada em relação à linha de células indicada (= 2

-ΔΔCt). Todas as reacções de PCR foram realizadas em triplicado. sequências de iniciadores são como se segue:

Stratifin

RTsense: 5′-TCTGATCCAGAAGGCCAAG-3 ‘;

Stratifin

RTantisense: 5′-GTTTCGCTCTTCGCAGGAG-3 ‘;

TKTL1

RTsense: 5′-AGCTCCGGCCACCCTACATCATG-3 ‘;

TKTL1

RTantisense: 5′-TGCCACATCCACAAACGACAGTCT-3 ‘;

ADAM12

RTsense: 5′-AAATGAAGGTCTCATTGCCAG-3 ‘;

ADAM12

RTantisense: 5′-AGAATTACCCGTGTAATTTCGAG-3 ‘;

GAPDH

RTsense: 5′-CAACAGCCTCAAGATCATCAG-3 ‘;

GAPDH

RTantisense: 5′-ACTGTGGTCATGAGTCCTTC-3 ‘.

Bissulfito Sequencing

O estado de metilação dos 5′ ilhas CpG de genes candidatos foi determinada por sequenciação de bissulfito. modificação bissulfito e PCR foi realizada como previamente descrito [51]. Bissulfito de modificação Sequencing (BMS) iniciadores foram os seguintes:

TKTL1

BMS frente: 5′-TGTGTAGAGAAAGAAGATTTTGTATT-3 ‘,

TKTL1

BMS reversa: 5′-CCCTTTAAAATCTAAAAACCCACTC-3′, e sequenciação interna iniciador

TKTL1

BMS-Seq: 5′-GATTGTAGGAGAGAAGATGAG-3 ‘;

ADAM12

BMS frente: 5′-TTTAGTTTTAGTTTGAAAAGTTGGA-3 ‘,

ADAM12

BMS reversa: 5′-CTAAACTCTTCTAACCTTTCAT-3′ e iniciador de sequenciação interna

ADAM12

BMS-Seq : 5′-TTCTAACACAAACCAACCTTAACC-3 ‘. produtos purificados foram sequenciados no Centro Johns Hopkins Núcleo Sequencing.

Western Blot Análise de DNMT1 Expressão

análise de Western blot foi realizada utilizando lisados ​​de HPNE ou CAF12 não tratada ou-DC-tratados aza 5 células. Um ensaio de Bradford foi usada para estimar a concentração de proteína, utilizando albumina de soro bovino (BSA, Invitrogen) como um padrão. Quantidades iguais de proteína (40 ug por pista) foram separados por electroforese em gradiente de 4-12% de gel SDS (Invitrogen), transferidos para membranas de nitrocelulose, e incubados em solução de bloqueio (leite 5% em TBS com Tween 20 a 0,1%) durante 30 minutos . As membranas foram incubadas durante 60 minutos com um anticorpo policlonal anti-DNMT1 (generosamente fornecida pelo Dr. Bill Nelson, JHU) em 1:200 diluição ou um anticorpo monoclonal contra o GAPDH (Cell Signaling, Danvers, MA) a 1:2000 diluição. anticorpos ligados a HRP secundárias (Santa Cruz Biotechnology, e Amersham Biosciences) foram aplicados em 1:2000 diluição e proteínas detectadas usando um kit ECL (Amersham Biosciences).

pâncreas Adenocarcinoma Tissue microarrays e ADAM12 Imunohistoquímica

A expressão de proteína ADAM12 foi examinada utilizando marcação imuno-histoquímica (IHC), de micromatrizes de tecidos embebidos em parafina e fixados em formalina (TMA), utilizando um DAKO Autostainer (Dako, Carpinteria, CA). Quatro TMA contendo um total de 72 adenocarcinomas do ducto pancreático cirurgicamente ressecado diferentes e tecidos normais correspondentes pâncreas foram construídos como descrito previamente [29]. ADAM12 IHC coloração foi realizada como descrito anteriormente [29], utilizando um anticorpo anti-humano de coelho ADAM12 (A2601, Sigma) a uma diluição 1:100 e um tempo de incubação de 60 minutos. Rotulagem foi realizada utilizando o Kit de Detecção de Envision-SPLUS (Dako).

Análise Estatística

valores e gráficos estatísticos descritivos foram gerados usando o pacote Microsoft Excel ou o beta v6.3 Partek® Genomics Suíte ™ . O método robusto Multichip médio (RMA) foi utilizada para normalizar as medições da intensidade de todas as matérias-conjuntos de sondas. Os valores de expressão de genes foram então obtidos utilizando o método biweight um passo de Tukey. Two-way ANOVA foi feito para identificar mudanças de expressão significativas entre fibroblastos-DC-tratados com 5-aza não tratada e ou linhas celulares de cancro, ou entre FAC e fibroblastos de controlo. As diferenças foram consideradas significativas para

P Art 0,05, e os valores relatados são médias ± DP

Resultados

análise de expressão gênica global de fibroblastos pancreáticos humanos e linhas celulares de cancro tratados. com 5-aza-dC

Nós estabelecemos culturas CAF pancreáticas primárias e culturas controle fibroblastos como descrito anteriormente [38]. Usando perfis de expressão gênica global, que anteriormente identificou diferenças de expressão gênica em FAC pancreático relativamente ao controlo fibroblastos [27]. agrupamento hierárquico dos perfis de não tratados fibroblastos CAF e controle de expressão gênica é fornecido na Figura S1. Suspeitando que estas mudanças na expressão gênica foram, em parte, mediada por alterações na metilação do DNA, foram comparados os perfis de CAF e culturas controle de fibroblastos de expressão gênica antes e após o tratamento com 5-aza-dC usando Affymetrix Exon Arrays (ST 1.0) (CAF11, CAF12, CAF13, CAF15, CAF16, CAF18, CAF19, CAF22, CAF25 e CAF35 para FAC; HPNE, SC2 e SC3 para células de fibroblastos de controle, respectivamente)

em primeiro lugar, confirmou 5-aza DC-esgotamento. da enzima DNMT1 por Western blot. DC-5-aza tratamento de células HPNE e CAF12 resultou em depleção de proteína em 1 uM DNMT1 concentrações mas não a proteína de controlo GAPDH (Figura 1). Para examinar o efeito do 5-aza-DC concentrações, comparamos o número de genes induzidos por 1 mM e 10 mM de 5-aza-dC em duas FAC adicionais, CAF19 e ​​CAF35, e não encontrou nenhuma diferença importante no número de estes genes induzidos entre as concentrações de fármaco (dados não mostrados). Nós, portanto, usado 1 mM concentrações de 5-aza-DC para tratar cada CAF. Foram tratados CAF células durante 4 dias como este foi duração suficiente para a proliferação celular. tratamentos mais longos (por 5-7 dias), muitas vezes resultou em FAC crescimento até à confluência (dados não mostrados). Consistente com isto, foi realizada ensaios de proliferação em CAF19 em diferentes concentrações de 5-aza-dC (0 uM, 1 uM, 5 uM, 10 uM e 20 uM) e descobriram que o crescimento não foi significativamente afectada na concentração de 1 uM foi empregado (Figura S2).

proteína DNMT1 está esgotada (em relação ao GAPDH) em 5-aza-dC trataram células HPNE e CAF12.

Depois de comparar os perfis de cada CAF expressão antes e depois de 5-aza-dC tratamento, identificado pela primeira vez que os genes foram regulados positivamente por uma média geral dobrável mudança de ≥2.0 em todos os dez FAC tratados com 5-aza-dC relativos a FAC não tratados. Nós escolhemos um cut-off de 2 vezes de diferenças mais modestas em ARN foram considerado mais provável para ser relacionada com a variação experimental. Uma vez que estávamos interessados ​​em identificar genes silenciados na FAC cuja expressão foi induzida por 5-aza-DC, que, em seguida, excluído o subconjunto de genes que foram expressos em FAC não tratados. Este critério identificados 42 genes candidatos (Tabela 1).

Para confirmar ainda mais a indução de genes mediada por 5-aza-dC foi realizada qRT-PCR do gene

Stratifin

(14- 3-3 sigma) e

Transcetolase-like protein 1

(

TKTL1

) porque sua expressão é regulada por metilação em outros tipos de células e análise de matriz exão identificada sua expressão como induzida por 5- aza-dC [52] [53]. Consistente com o resultado matriz exão,

stratifin

(

SFN

) níveis de mRNA foram baixos ou indetectáveis ​​em todos os fibroblastos não tratados (FAC e fibroblastos controle) e aumento da expressão de

SFN

ARNm foi detectada na maioria dos fibroblastos tratados com 5-aza-dC (Fig. 2 a e B). Observou-se próximo à metilação completa da

SFN e região do promotor em todos os FAC por sequenciação de bissulfito (dados não mostrados). Da mesma forma,

TKTL1

níveis de ARNm de fibroblastos foram indetectáveis ​​em quase todos os não tratados, com excepção células SC2, e expressão aumentada de

TKTL1

foi detectado na maioria da 5-aza-dC fibroblastos tratados (Fig. 2 C). Coerente com isso, encontramos evidência de metilação de 5 ‘CpGs de

TKTL1

em fibroblastos de MSP (dados não mostrados). seqüenciamento bissulfito de 18 locais CpG a montante do

TKTL1

local de início da transcrição (Fig. 2 D) revelou que a totalidade ou a maioria dos locais de CpG foram totalmente metilado nas linhas de fibroblastos não expressam, HPNE e SC3 e CAF19 e CAF25 (Fig. 2 E). Em contraste, o

TKTL1

linha -expressing, SC2, faltou-metilação de muitos desses sites, apoiando um papel para a metilação do DNA na regulação da

expressão TKTL1

. Nós também identificou a regulação positiva de

DAZL

e

ANXA3

(dados não mostrados), genes previamente relatado para ser induzida por 5-aza-dC [36],

NDN

, relatou a ser impresso [54], e

MT1G

, relatou a ser metilado em outros tipos de câncer [55].

(a) Affymetrix exão análise de matriz de

SFN

a expressão de ARNm em cinco FAC antes pancreáticas (verde) e depois (vermelho) tratamento com 5-aza-dC. (B) e (C) Análise quantitativa RT-PCR de

SFN

e

TKTL1

expressão de mRNA em relação ao

GAPDH

mRNA em culturas de fibroblastos pancreáticas antes (barras azuis) e depois (barras vermelhas) tratamento com 5-aza-dC. Cada ensaio foi realizado em triplicado. Os dados são médias de três experiências independentes; barras são valores SD. (D) Top:

TKTL1

estrutura e distribuição dos dinucleótidos CpG gene. barras verticais curtas representam locais CpG. Seta aponta para local de início da transcrição. Abaixo: Bissulfito análise de sequenciamento genômico em FAC pancreáticas e fibroblastos de controlo. Os círculos abertos representam locais de CpG não metilados, círculos pretos sólidos metilado locais de CpG, e incubados círculos locais CpG metilados parcialmente. (E) cromatogramas seqüenciamento bissulfito do

TKTL1

promotor num CAF pancreático (CAF19) e linhas de fibroblastos de controlo (HPNE e SC2). Setas apontam para resíduos de citosina.

Foram examinados perfis de RNA para determinar se houve quaisquer respostas diferenciais aos 5-aza-dc em FAC comparação para controlar fibroblastos. Trinta e cinco dos 42 genes induzidos em FAC por 5-aza-DC (Tabela 1) também foram induzidos em um ou mais do controlo de linhas de fibroblastos pancreáticas que indicam que poucos ou nenhuns genes estão selectivamente e de forma consistente regulada positivamente por 5-aza-dC no FAC.

DAZL

era o gene mais altamente induzida em quatro FAC (CAF12, CAF15, CAF16 e CAF19) e esteve entre os dez melhores genes induzidos em dois FAC (CAF18 e CAF22) e fibroblastos um controle (HPNE) ( dados não mostrados). Foi realizada agrupamento hierárquico dos genes induzidos por 5-aza-dC na FAC e fibroblastos de controle para determinar se havia diferenças observáveis ​​nos padrões gerais de resposta gene a 5-aza-dC, mas não houve agrupamento por classe de fibroblastos (Figura S3). Cinco das sete FAC agrupadas, os outros dois FAC agrupamento com os fibroblastos de controlo.

Outra evidência para esta escassez de genes silenciados por metilação do DNA na FAC vem de avaliar os genes underexpressed no FAC. Foram identificados genes que foram underexpressed por uma média de ≥4.0 vezes em todos FAC em relação aos fibroblastos de controlo pancreáticas (Tabela S2). Notavelmente, não houve sobreposição entre esta lista de 86 genes underexpressed e os genes induzidos por uma média de duas vezes por 5-aza-pb no FAC (Tabela 1). Estes dados indicam que poucos ou nenhuns genes consistentemente underexpressed na FAC são silenciados por metilação do DNA.

Identificação de genes candidatos para análise de hipometilação

Temos anteriormente identificados 200 genes, tais como

Smo

, regulada no FAC pâncreas em relação aos fibroblastos controle pancreáticas [27]. Para identificar genes candidatos hypomethylated em FAC, que fundiu esta lista de genes sobre-expressos em FAC pancreáticos com a lista de 581 genes induzidos por ≥3.0 vezes em, pelo menos, uma linha de células de fibroblastos por tratamento com 5-aza-dC. Este critério identificados 49 genes candidatos (Tabela S1) alguns dos quais podem ser regulados por metilação, e potencialmente hypomethylated em FAC pancreáticas em relação ao controlo fibroblastos.

tratamento com 5-aza-dC de FAC pancreáticos humanos, fibroblastos de controlo e linhas celulares de cancro

a seguir, compararam as respostas de FAC e fibroblastos de controlo de 5-aza-dC com as respostas de linhas celulares de cancro do pâncreas. Geramos uma lista de genes individuais para cada linha de fibroblastos ou linha celular e, em seguida, contado o número total de genes induzidos por ≥5 vezes em cada linha (Figura 3). Em seguida, comparou o número médio de genes induzidos por ≥5 vezes por 5-aza-dC nos dez FAC, as linhas de fibroblastos 3 de controle, e as linhas de células de câncer de pâncreas 4. Significativamente menos genes foram induzidos por 5-aza-dC no FAC do que em linhas celulares do cancro do pâncreas (

P

= 0,0009). O número de genes induzidos por ≥5 vezes nos dez FAC foi apenas 9 ± 10 genes (média +/- desvio padrão), em comparação com 17 ± 14 genes induzidos por ≥5 vezes nos fibroblastos de controlo de três pancreáticas, e 123 ± 86 genes induzidos por ≥5 vezes nos 4 linhas de células de cancro pancreático (figura 3). Não houve diferença significativa no número de genes induzidos por ≥5.0 vezes na FAC e nos fibroblastos de controlo pancreáticas. Para garantir que nós tinha escolhido um corte razoável fold-change para comparação, também compararam o número de genes induzidos por ≥3 vezes. Foram também observadas diferenças similares: O número de genes induzida ≥3 vezes por 5-aza-dC foi de 83 ± 47 genes induzida em fibroblastos de controle e 48 ± 42 genes induzidos em FAC e 430 ± 271 genes em linhas celulares de cancro pancreático (

P

= 0,0006 para o FAC em relação a linhas celulares de cancro). Não houve diferenças significativas em relação à idade ou sexo do número de genes induzidos por 5-aza-DC.

Uma média de 123 ± 86 genes foram induzidos 5 vezes ou mais por 5-aza-dC tratamento em quatro linhas celulares de cancro do pâncreas, 9 ± 10 genes em dez FAC pancreáticas (

P

= 0,0009) e 17 ± 14 genes em cada três de controle de linhas de fibroblastos pancreáticas.

metilação Diferencial do candidato gene hypomethylated ADAM12

a nossa análise de genes regulados positivamente selectivamente por 5-aza-dC na FAC não gerou genes conhecidos por ser regulada por metilação do DNA que influenciam o comportamento dos fibroblastos do estroma. Examinámos também os nossos listas de genes expressos diferencialmente em FAC em relação ao controlo fibroblastos pancreáticas para candidatos que influenciam as interacções de tumor /estromais. Um dos candidatos sobre-expressos em FAC era

ADAM12

.

ADAM12

(Proteína Adam 12), um regulador de interacções célula-célula e célula-matriz, é sobre-expresso em fibroblastos associados ao cancro e está implicada na progressão tumoral [56]. Em primeiro lugar, confirmou a regulação positiva de

ADAM12

mRNA no FAC relativamente ao controlo fibroblastos utilizando RT-PCR quantitativo. Consistente com nossa matriz resultado exão (Fig. 4a),

ADAM12

mRNA foi altamente sobre-expressos em fibroblastos controle de pâncreas derivada de uma amostra de pancreatite (SC3) e nove FAC em relação ao fibroblastos controle HPNE e SC2 (Fig. 4b).

(a análise) Affymetrix exão conjunto de

ADAM12

expressão de mRNA em FAC pancreáticas e fibroblastos de controlo. (B) Análise quantitativa RT-PCR de

ADAM12

expressão de mRNA em FAC pancreáticas e fibroblastos de controlo após a normalização para

níveis de GAPDH

. Cada ensaio foi realizado em triplicado. Os dados são médias de três experiências independentes; barras são valores SD.

Para determinar se

ADAM12

foi diferencialmente metilado na FAC comparação para controlar fibroblastos, foi realizado o seqüenciamento bissulfito do

ADAM12

promotor do gene em 9 FAC e 3 linhas de fibroblastos de controlo. Nós amplificou um montante região 481-bp do

ADAM12

local de início da transcrição contendo 38 locais CpG (Figura 5a). seqüenciamento bissulfito revelou que 29 de 38 (76%) locais CpG foram totalmente metilado na linha de controle de fibroblastos HPNE (Figura 5b). Em contrapartida, seis dos nove FAC (CAF12, CAF14, CAF15, CAF16, CAF20, e CAF22) foram totalmente (100%) não metilado em todos os locais CpG. Os restantes FAC foram parcial metilado de 2 a 7 dos 38 locais CpG não metilado e totalmente em todos os outros CpG (Figura 5A). Os fibroblastos de controlo SC2 e SC3 foram totalmente metilado em CpG próximo da extremidade 5 ‘da região sequenciada e parcialmente metilado em CpG próximo da extremidade 3’ desta região. Eles eram totalmente não metilado em todas as outras CpGs. Assim, houve hipometilação relativa a vários CpGs entre os fibroblastos que expressam

ADAM12

e aqueles que não o fizeram, implicando hipometilação aberrante de

ADAM12

como um mecanismo para a sua sobre-expressão na FAC pancreáticas em relação ao controle fibroblastos pancreáticas

(A) superior:.

ADAM12

estrutura e distribuição dos dinucleótidos CpG gene. barras verticais curtas representam locais CpG. Seta aponta para local de início da transcrição. Abaixo: Bissulfito análise de sequenciamento genômico em FAC pancreáticas e fibroblastos de controlo. Os círculos abertos representam locais de CpG não metilados, círculos pretos sólidos metilado locais de CpG, e incubados círculos locais CpG metilados parcialmente. (B) cromatogramas seqüenciamento bissulfito do e linha

ADAM12

promotor num CAF pancreático (CAF19) de controle de fibroblastos (HPNE). Setas apontam para resíduos de citosina.

Para determinar se a proteína ADAM12 foi overexpressed no estroma de adenocarcinomas pancreáticos primários, foi realizada imuno-histoquímica em microarrays de tecido. Embora a expressão da proteína ADAM12 não foi detectada em fibroblastos em torno do ducto pancreático normal (Figura 6b), FAC de adenocarcinomas pancreáticos primários foram positivas para a expressão da proteína ADAM12 (Figura 6c). expressão ADAM12, também foi observado em células do epitélio pancreático e cancros pancreáticos invasivos.

(A), a expressão da proteína ADAM12 é indetectável na camada de células de grânulos do cérebro (tecido de controlo negativo).