Abstract

Fundo

BORIS

/

CTCFL

é um parálogo de

CTCF

, o principal regulador epigenética de genomas de vertebrados. Boris é normalmente expressa apenas em células germinativas, mas é activado de forma aberrante em muitos tipos de cancro. Embora estudos recentes demonstraram que BORIS é um activador da transcrição de genes específicos do testículo, pouco é geralmente conhecido sobre suas funções biológicas e moleculares.

Metodologia /Principais Achados

Aqui nós mostramos que

BORIS

é expressa como 23 isoformas em células germinativas e câncer. As isoformas são compostos de N- alternativa e C-terminais combinadas com números variáveis ​​de dedos de zinco (ZF) no domínio de ligação ao ADN. Os padrões de

BORIS

expressão isoforma são distintas em células germinativas e câncer. expressão da isoforma é ativado pela regulação baixa de

CTCF

, regulada pela redução na CpG metilação causada pela inativação de DNMT1 ou DNMT3B, e reprimido pela ativação de

p53

. Estudos de isoformas expressas ectopicamente mostrou que todos são convertidos e localizada para o núcleo. Usando o sulfotransferase cerebroside específicas do testículo (

CST)

promotor e o

IGF2 /região de controle do imprinting H19

(ICR), demonstrou-se que a ligação de BORIS isoformas de DNA alvos

em vitro

é sensível à metilação e depende do número e da composição específica ZF. A capacidade de se ligar ao ADN alvo e a presença de um terminal amino de comprimento específico (N258) em diferentes isoformas são necessárias e suficientes para activar

CST

transcrição. A análise de sequência comparativa revelada uma explosão evolutiva em mamíferos com uma forte conservação da BORIS isoprotéicas entre os primatas.

Conclusões

O extenso repertório de emendados

BORIS

variantes em humanos que conferem DNA distinta ligação e as propriedades de activação da transcrição, e os seus padrões diferenciais de expressão entre as células germinativas e células neoplásicas sugerem que o gene está envolvido numa série de aspectos funcionalmente importantes de ambos gametogénese normal e desenvolvimento de cancro. Além disso, uma explosão na diversificação isoforma pode ser evolutivamente ligada a aspectos únicos de especiação primata

Citation:. Pugacheva EM, Suzuki T, Pacote SD, Kosaka-Suzuki N, Yoon J, Vostrov AA, et al. (2010) A complexidade estrutural do Human

Gene BORIS

na gametogênese e Câncer. PLoS ONE 5 (11): e13872. doi: 10.1371 /journal.pone.0013872

editor: Sebastian D. Fugmann, National Institute on Aging, Estados Unidos da América

Recebido: 02 de julho de 2010; Aceito: 11 de outubro de 2010; Publicação: 08 de novembro de 2010

Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da declaração Creative Commons Public Domain que estipula que, uma vez colocado no domínio público, este trabalho pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pelo programa de investigação intramural de NIAID e pela concessão intramural do NIH Office of AIDS Research para AVS e DL os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO dE iNTERESSES:.. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

introdução

BORIS

(Irmão do regulador de Sites Imprinted) é um par�ogo do multifuncional

CTCF

gene, que está envolvida na leitura de marcas epigenéticas, ativação do gene transcrição e repressão, inactivação do cromossoma X, formação de alças de cromatina por meio de dimerização e na organização global genoma tridimensional [1], [2], [3], [4], [5]. Enquanto as duas proteínas partilham uma 11 de dedo de zinco (ZF) ADN Central domínio de ligação, que têm distinta de amino e carboxi-terminais [2], [6]. Em tecidos normais, os dois genes parálogos mostram padrões de expressão que se excluem mutuamente:

BORIS

ARNm é abundante em células germinais masculinas, particularmente em espermatócitos primários e espermatídeos redondas, onde

CTCF

, que é expressa ubiquamente em células somáticas, é reprimida [2]. BORIS actua como activador da transcrição de vários genes alvo específicos do testículo durante a espermatogénese, enquanto CTCF suprime os mesmos alvos nas células somáticas de [7], [8], [9]. Em células germinativas, BORIS foi sugerido para ser envolvido na recomposição de imprinting no

região Igf2 /H19

controle imprinting (ICR) [10]. Em contraste, CTCF é o leitor conhecido e protetor de

Igf2 /H19

marcas de imprinting em células somáticas [11], [12], [13], [14], [15]. A segregação de

BORIS

e

expressão CTCF

em diferentes tipos de células em mamíferos é rigidamente controlado. Normalmente, CTCF, p53, e suprimir a metilação CpG

BORIS

transcrição em células somáticas, efectivamente, restringir a sua expressão de células germinativas testiculares [8], [16], onde a ausência de CTCF [2] e várias ondas de desmetilação do genoma criar as condições para

BORIS

ativação.

BORIS

é anormalmente ativados em muitos tipos de células cancerosas, sua expressão coincidindo com a perda de CpG metilação, a primeira mudança epigenética identificados em células cancerosas [2], [6], [17]. expressão aberrante de

BORIS

em células cancerosas prováveis ​​resultados em uma competição entre proteínas Boris e CTCF para a ligação a locais alvo de ligação ao DNA CTCF (CTSes). BORIS pode interferir com as funções CTCF em células cancerosas não apenas em virtude de ter a ZF idêntica domínio de ligação e sobreposição DNA especificidade de ligação, mas também devido à sua amino- distinta e carboxi-terminais que provavelmente conferem um conjunto distinto de funções moleculares [2] . Com efeito, tanto CTCF e BORIS ligar o

MAGE A1

promotor, mas com resultados opostos: enquanto CTCF actua como um repressor da transcrição, BORIS funciona como um activador [8]. Um estudo recente demonstrou também que Boris e CTCF executar diferentes funções de transcrição após a ligação ao promotor de rato específico do testículo

CST

variante de processamento [9]. Em conclusão, embora funções moleculares de BORIS no cancro continuam a ser estudado em profundidade, co-expressão aberrante de

CTCF

e

BORIS

é um dos expressão gênica assinaturas características de muitos cânceres [6 ].

estudos anteriores mostraram que a emergência evolutiva da

BORIS

em amniotes ocorreu antes da divergência de répteis e mamíferos e pode ser atribuída a uma duplicação inicial de toda a

CTCF

sequência [18]. Enquanto BORIS é amplamente expresso em répteis e monotremados, expressão mostrou-se gônada-específico em marsupiais e eutérios, indicando que BORIS tornou-se funcionalmente especializada durante a evolução dos mamíferos em conjunto com a evolução do imprinting genômico [18]. Enquanto

CTCF

é altamente conservada da drosófila para os seres humanos [18], [19], [20],

BORIS

codificação e sequências não codificadoras são de plástico evolutivamente [18]. De fato, uma comparação entre o amino e carboxi-terminais de humano

BORIS jogue com ortólogos em outras espécies revela relativamente baixa similaridade, 32,3% e 23,7%, respectivamente, enquanto a similaridade correspondente de humano

CTCF

com outros ortólogos é 90,1% e 80,7%, respectivamente. No entanto, a região de BORIS ZF tem 80,4% de identidade com os seus ortólogos, semelhante para a conservação de 99,5% para CTCF zFS [18]. A rápida evolução de

BORIS

não está limitado a sequências de codificação de proteínas. Notavelmente, a estrutura do locus como um todo é notavelmente diferente, mesmo entre os ratos e os seres humanos, o que pode sugerir um conjunto especializado de funções e /ou isoformas de splicing. O ser humano

gene BORIS

estende por mais de 29 kb de 20q13 e é composto por 11 exons, 10 dos quais são de codificação [2]. Isto pode permitir a geração de um número de diferentes isoformas de splicing alternativo. Evolutivamente, splicing alternativo é o mecanismo mais utilizado para aumentar a capacidade de codificação de transcrições de mRNA para permitir a geração de diferentes isoformas de proteínas com atividades distintas.

A primeira evidência para a alternativa

BORIS

transcrições veio a recente demonstração de que humana

BORIS

é expressa de pelo menos três promotores alternativos, utilizando cinco UTRs 5 ‘distintas [16]. No presente estudo, caracterizamos 23

BORIS

variantes de processamento com perfis de expressão distintos nas células germinativas e cancerosas normais, ao mesmo tempo, exibindo actividades de ligação de ADN diferencial e variando as propriedades de transcrição. Assim,

BORIS

é expressa como um repertório de transcritos alternativos e proteínas, indicando que splicing alternativo gera um mecanismo complexo para a função mediada BORIS em células da linha germinativa e cancerosas.

Resultados

Multiple

BORIS

transcritos são expressos em testículo humano, células-tronco embrionárias e linhas de células de diferentes tipos de cânceres

Nós já demonstraram que a expressão de

BORIS

é restrito a testículo tecidos e células cancerosas, com expressão dependentes do estado de metilação CpG de alternativa

BORIS

promotores [8], [16]. Na análise

CTCF

e

expressão BORIS

no testículo humano,-tronco embrionárias células (ES), e várias linhas celulares de cancro por RT-PCR, fomos capazes de amplificar o full-length ZF- regiões de codificação de ambos os genes. Apenas uma única banda PCR específico para o

CTCF

domínio ZF foi detectada em todos os tipos de células examinadas; no entanto, múltiplas bandas de PCR foram gerados por primers que amplificam a região

BORIS

correspondente ao domínio ZF (Fig. 1A). Análises de sequências de produtos

BORIS

PCR clonados identificadas um número de transcritos alternativos com diferentes combinações de exões ZF que foram geradas devido à utilização de locais de splicing alternativos (Fig. 1a). A abundância e distribuição de

BORIS

transcrição variantes diferiu entre linhas celulares de cancro e no testículo, sugerindo mecanismos distintos de regulação da

gene BORIS

em células germinativas e cancerosas normais.

(a) ARN total das linhas celulares indicadas e testículo tecido foram analisadas por RT-PCR utilizando iniciadores desenhados para amplificar o comprimento total

CTCF

e

BORIS

domínios zFS. As sequências dos iniciadores são apresentadas na Tabela S1. Nested PCR foi realizado com 20 e 35 ciclos para a primeira e segunda rodadas, respectivamente. As fontes de RNA são mostradas na parte superior de cada gel. Setas apontam para o single

CTCF

transcrição e múltiplas

BORIS

transcritos alternativos. (B) a estratégia 3 ‘RLM-RACE para clonagem

BORIS

formas de splicing alternativo. Três

BORIS

promotores alternativos e 12 exons com sequências não-codificantes (caixas brancas) ou sequências codificadoras (caixas cinzentas) são mostrados. O ARN total de testículo humano adulto e a linha celular K562 foi processada com o kit GeneRacer de PCR para a amplificação de cDNAs de comprimento total. A primeira ronda de PCR foi realizada com determinado gene e três para a frente (GSP) iniciadores A, B e C que foram concebidos para identificar mRNA expressa a partir alternativa correspondente

BORIS

promotores A, B ou C, respectivamente. O ‘GeneRacer iniciador 3 ligada a cauda poli A foi utilizada como um iniciador inverso. l ul da mistura de PCR da primeira rodada foi utilizado como um molde para realizar PCR aninhada com três gene específico aninhado-frente (NGSP) iniciadores A1, B1 e C1. (C) 3? RLM-RACE foi realizada no testículo humano e a linha de células K562. Multiple

BORIS

transcrições foram detectados em ambas as amostras. Os produtos de PCR do PCR aninhado são mostrados separados em géis de agarose a 1%. M é o marcador de tamanho.

Sabendo que CpG hipometilação está envolvido em

BORIS

activação [2], [8], [16], comparamos

BORIS

expressão na linha de células de câncer de cólon HCT116 às células HCT116 tratados com 5aza-dC, e HCT116 tendo um nocaute duplo (NSO) de

DNMT3B

e

DNMT1

[21]. A diminuição dramática na metilação de CpG em células HCT116 NSO e HCT116 tratada com 5aza-DC, descrito anteriormente [21], correlacionada com o aparecimento de múltiplos

BORIS

espec�icos produtos de RT-PCR (Fig. 1A), onde estavam ausentes na linha celular HCT116 parental. Interessantemente, as células ES humanas foram encontrados para expressar, pelo menos, dois alternativa

BORIS

transcritos, confirmando

expressão BORIS

em linhas de células ES, como demonstrado anteriormente por imunofluorescência [22]. Concluímos, portanto, que enquanto

CTCF

é expresso como um único transcrito no testículo humano e cancros,

BORIS

é expresso como várias isoformas do testículo, células ES e em linhas celulares de cancro, especificamente nos células com aumento da hipometilação do DNA.

Vinte e três de splicing alternativo

BORIS

isoformas são expressas em testículo e em células cancerosas

motivada por nossa identificação prévia de cinco alternativa 5′-UTR splicing

BORIS

variantes gerados a partir de três alternativa

BORIS

promotores (a, B e C) [16], realizamos uma tela para full-length de splicing alternativo

BORIS

transcrições no testículo humano e a linha de células de câncer K562, as células com os mais altos níveis de expressão

BORIS

. Para isolar full-length

BORIS

transcritos alternativos, utilizamos a abordagem 3′-RLM-RACE mostrado na Figura 1B. Nós amplificada múltiplas

produtos BORIS

RT-PCR que foram então clonados e sequenciados (Fig. 1C). A partir disso, foram identificados 19

BORIS

variantes de processamento anteriormente desconhecidos (Fig. 2). As duas principais fontes de heterogeneidade em

BORIS

mRNAs foram a utilização de promotores alternativos e locais de splicing. Observou-se também o uso diferencial dos distintos 5′- e 3′-UTR, bem como estruturas de tradução alternativos nas regiões de codificação amino e carboxi-terminais. Alinhamento do

BORIS

sequência genómica com transcritos alternativos revelou que as fronteiras exão-intrão tinha sequências de locais de emenda clássicos (Tabela S4). A maior parte da alternativa

BORIS

transcrições possuía uma cauda poli localizado 20-30 pb a jusante do sinal de poliadenilação canônica, AAUAAA (S1 Arquivo), indicando que

BORIS

isoformas alcançado o estágio de expressão como madura mRNAs.

(a) ilustração esquemática do

BORIS

gene com três promotores alternativos e dezesseis exons utilizados para a geração de 23 mRNAs isoformas. tamanhos exons são apresentados no âmbito do regime, com o número máximo de nucleotídeos para os exons alternativos e mínimo. Os códons de início e parada para ORF são indicados como ATG e Parada, respectivamente. A primeira

BORIS

transcrição representa o originalmente clonado

BORIS

forma, designada aqui como

B0

;

BORIS

transcrições abaixo são novas isoformas clonadas. À esquerda são os nomes dos

BORIS

isoformas, correspondentes a representação esquemática de dados transcritos. À direita, os seis

BORIS

subfamílias, divididos com base em extremidades semelhantes 3 ‘, são indicados. As linhas vermelhas e azuis na parte superior ou na parte inferior da representação esquemática das isoformas representam as posições das sondas Taqman. regiões não traduzidas são representados por caixas abertas. Íntrons (linhas finas) não são mostrados em escala exata. (B) O splicing alternativo cria um novo ZF no

C6

isoforma. comparações de sequências de aminoácidos da ZF 4 de

B0 Comprar e nova alternativa ZF 4/9 de

C6,

que combina a primeira metade da ZF 4 e na segunda metade do ZF 9. (C) splicing alternativo cria um novo espaçador de codificação entre o ZFS 5 e 6 em

A3

isoforma.

O

BORIS

isoformas foram classificados de acordo com o uso de promotor (Fig. 2A ). Isoformas expulsos do promotor A incluiu

BORIS A1

,

A2

,

A3, A4, A5

, e

A6

. Em comparação com o

BORIS

transcrição originalmente descrita [2], que é agora designado como o

BORIS B0

isoforma, isoformas

A1

e

A2

contido 5 ‘UTRs alternativas, mas o mesmo polipeptídeo codificado BORIS (Fig. 2A, Tabela S3). Isoforma

A3

teve vários recursos novos que distinguem-lo do

B0

incluindo um não-codificante 5 ‘UTR de comprimento e a exclusão de exão 6 devido ao splicing alternativo. Isto resultou na presença de apenas 9 zFS, em vez de a 11 de

B0 BORIS

, mas também produziu um novo longo espaçador entre ZF5 e ZF8 (Fig. 2A, C). Para isoformas

A4

e

C2

, que ambos codificam o mesmo polipéptido, ORFs continuar no intrão 4, até um codão de paragem alternativa resultou na truncagem do domínio ZF, enquanto a produção de um terminal COOH alternativa . Isoformas

A5

e

A6

ambas codificadas 10 ZFS completos e metade do ZF11, que é de splicing alternativo do exon 8 a novos exons 9a ou 9a (1), respectivamente, resultando em dois carboxi alternativa -termini. A isoforma

B1

tem os mesmos 10 exons de codificação como o

BORIS B0

protótipo, mas possuía um exão adicional de 11, que codificou uma alternativa carboxi-terminal. Além disso, algumas isoformas tinha terminais amino alternativa, devido à utilização de diferentes codões de iniciação, os quais resultam de splicing alternativo do exon Eb ao exão 2 (em

B3

e

B4

) ou exão 3 (em

B2, B5, B6, B7

).

O mais surpreendente, apenas 7 dos 23

BORIS

isoformas codificado um full-length 11 ZF DNA vinculativo domínio, com o número de ZF nas outras isoformas variando de 1 a 10 (S1 ficheiro, Tabela S3). Tal como mostrado pelos exemplos seguintes, as reduções nos números de zFS resultou da utilização de locais de splicing alternativos e os codões de paragem. A isoforma

C5

tinha apenas um ZF e uma carboxi-terminal a partir de splicing alternativo resultante a partir do meio do exão 3 ao exão 10b. Enquanto isoforma

C8

continha todos os 11 exões, a presença de um exão 6a adicional com um codão de paragem em enquadramento resultou em apenas seis zFS. Notavelmente, a partir de splicing exão 4 ao exão 8 da isoforma

C6

criado um novo ZF híbrido constituído por metade da ZF 4 e metade da ZF 9. Isto levanta a possibilidade de que a nova ZF pode conferir novas propriedades de ligação ao ADN esta isoforma (Fig. 2B). Finalmente, alguns exons alternativos, como 5a em

B6, B7, C7

, e

C9

, manteve sequências intrônicas que incorporaram códons de paragem prematuro e, portanto, pode não produzir proteína estável devido à mRNA decadência (NMD) via mediada-nonsense, uma possibilidade que deve ser verificado experimentalmente.

características dos

BORIS

variantes alternativas e sua conservação evolutiva em humanos e primatas não-humanos

a 23

BORIS

variantes mRNA splicing têm o potencial para codificar 17 polipeptídeos diferentes que designam como BORIS proteínas isoformas de 1 a 17. para categorizar as isoformas, o amino alternativo e carboxi-terminais foram nomeados de acordo para o número de resíduos de aminoácidos a montante e a jusante do domínio ZF, respectivamente (Tabela S3). Por exemplo, N258 indica um amino-terminal com 258 resíduos de ácidos aminados a montante do domínio que ZF é codificado em muitos

BORIS

incluindo isoformas

B0, B1, A3, A4, A5, A6, C3, C4, C5, C6, C7 /C9

e

C8

. Notavelmente, N24 e N53, versões truncadas de N258, não têm diferenças de aminoácidos com N258 dentro dos 24 e 53 aminoácidos a montante de ZF1. Onze alternativa carboxi-terminais distintas encontradas em isoformas são designadas “C”, com os seus números correspondentes ao número de codões a jusante do último ZF. Por exemplo,

B1

tem C132,

C3

tem C97,

C5

tem C53, etc. (File S1, Tabela S3).

Para busca de homologia com as proteínas ou domínios conhecidos, a única alternativa onze C-terminais foram comparados por BLAST a sequências de aminoácidos do GenBank. Apenas uma alternativa carboxi-terminal, C97, mostraram um significativo grau de similaridade com múltiplas proteínas não-BORIS, incluindo vários envolvidos nos processos de transcrição ou tradução (Fig. S2). Este domínio putativo recentemente reconhecido é um componente previamente uncharacterized de um domínio conhecido helicase-like (COG0553). Outras análises de 3’UTRs alternativas de algumas isoformas revelou a presença de elementos específicos de DNA repetitivas. Por exemplo, uma parte do 3’UTR para o

B6

e

C7

isoformas pertence a um consenso Alu-J. A 3’UTR de isoformas

B1

também é altamente repetitivo em genomas humanos e primatas. Isoformas

C3, B2, B3, C4, C5

, e

C8

ter o elemento específico do primata repetitivo DNA, MER1 [23] em suas 3’UTRs.

o fato de que

BORIS

isoformas são conservados em outras espécies sugere sua importância biológica. Por exemplo, todos os recursos do ser humano

BORIS

isoformas são altamente conservadas nos macacos

Pan troglodytes Comprar e

Macaca mullata,

com locais de splicing conservadas e identidades de proteínas correspondentes que variam de 96 % a 100% e de 53% para 97%, respectivamente (Fig. 3). Entre os terminais C mais conservadas são: C95 (com identidades de 99% e 89% em chimpanzés e macacos, respectivamente), C97 (97% e 91%), C68 (98% e 96%), C35 (100% e 97%), e C24 (96% e 96%). C132 é altamente conservada no chimpanzé (96%), mas em menor grau em macacos (53%). Enquanto o alinhamento da

BORIS

isoformas humanas com o locus genómico de ratinho descoberto várias rato putativo BORIS carboxi-terminais (C95, C90, C35 e C34), os níveis de homologia foram bastante baixas, variando de 9% para 42% . Isto sugere que o ritmo de

BORIS

evolução em mamíferos tem sido bastante rápida ea complexidade do

BORIS

lócus provavelmente coincidiu com o surgimento de primatas. O fato de que o mouse

Boris

lugar não tem a mesma gama de isoformas como seres humanos ou outros primatas pode estar relacionada com a evolução específica primata das sequências de intrão de

BORIS

loci [18]. Resta determinar se os ratos têm

Boris

espécies de isoformas alternativas. Se existirem, isso deve-se prever que eles seriam distintas das dos seres humanos, apesar da conservação dos locais de splice. O surgimento de isoformas em primatas pode, assim, ser atribuída a potenciadores de splicing intr�icas putativos.

(A) A percentagem de identidade do ser humano (

H.sapiens

) BORIS isoformas C-terminais de aminoácido alternativa putativa sequências aqueles de chimpanzé (

P.troglod.

), Macaca (

M.mulatta

), e do rato (

M.mus

.). Onze alternativa terminais C encontrados em isoformas distintas são definidas pelo número de codões a jusante do último ZF. A tabela mostra os nomes de BORIS isoformas com C-terminais e sua identidade em percentagem correspondente. (B) Alinhamento da BORIS alternativa C-terminais no ser humano, chimpanzé, macaco e rato. As sequências de aminoácidos alternativos de humano, chimpanzé, macaco e rato estão alinhados por ClustalW (Vector NTI). variantes de splicing BORIS humano são altamente conservadas em primatas, mas não em ratinhos. As sequências de aminoácidos para alguns dos BORIS alternativa terminais C (C132, C97, C68, C53, C36, C30, C24) são completamente ausente em ratos. Amarelo destaque sequências são 100% idênticas à sequência de aminoácidos humana; o destaque azul indica substituições prudentes em relação às sequências de BORIS homólogos humanos. Pontos indicam inserções ou exclusões.

Alternativa

BORIS

transcritos são expressos em macho normal e gônadas femininas

Nós relatado anteriormente que a expressão de

BORIS B0

em tecidos humanos normais foi restrito a testículo [2]. Para analisar os padrões de

BORIS

expressão isoforma no testículo, nós projetamos uma série de primers e sondas Taqman para amplificar os transcritos alternativos por qRT-PCR. Apenas 8 de 23

BORIS

isoformas poderia ser especificamente discriminados por qRT-PCR porque a maioria das isoformas partilham sequências, tornando impossível para projetar primers e sondas que detectam as

BORIS

isoforma como uma espécie separada . Consequentemente, nós operacionalmente dividido as 23 isoformas em seis subfamílias (SF1 de SF6) com base nos seus únicos ‘sequências terminais 3, os quais foram utilizados para desenhar sondas Taqman 6 por qRT-PCR (Fig. 2A, Materiais e Métodos). Entre 13 e 13 adulto tecidos fetais testados, a expressão das seis

BORIS

subfamílias foi detectada apenas no testículo adulto e embrionário em células de ovário, mas os níveis relativos de expressão da isoforma foram reprodutivelmente diferente nos dois tecidos (Fig. 4A , B). Em testículo adulto, todos os seis subfamílias foram expressas em níveis comparáveis, com SF1 sendo o grupo mais prevalente, expresso em cerca de 1.3- a 3 vezes mais elevados do que os níveis de outros cinco subfamílias (Fig. 4a). Em contraste, SF3 era a forma mais prevalente nos ovários embrionárias (Fig. 4B), sendo expresso em níveis aproximadamente quatro vezes maior do que SF1 e SF4, e de 11 a 127 vezes maior do que os grupos de SF6, SF2 e SF5 ( A Fig. 4B). Enquanto que entre os tecidos adultos única testículo era fortemente positivo para

BORIS

isoformas, eles foram expressas em níveis muito baixa embora reprodutível em vários tecidos do painel fetal, incluindo testículo, pele, baço e (Fig. 4B). Isto sugere que o

BORIS

isoformas podem ser funcionalmente ativa fora da linha germinativa durante o desenvolvimento fetal.

análise de qRT-PCR de

BORIS

expressão isoforma no ser humano adulto normal (A) e (B) os tecidos fetais, respectivamente, foi quantificada pelo método de quantificação absoluta. A 23

BORIS

isoformas foram divididos em 6 subfamílias com base em suas sequências de ‘finais 3 únicas para permitir a concepção de sondas Taqman (Material e Métodos). (C)

BORIS

expressão isoforma no testículo adulto normal humano analisado pelo

in situ

hibridação, RNA FISH. Para os ensaios de peixes, as sondas para seis

BORIS

subfamílias (sf1-SF6) foram marcadas com digoxigenina-11-dUTP por PCR e individualmente hibridizado ao tráfego fixo-formaldeído adulto testículo humano. As lâminas foram incubadas com anticorpos anti-DIG durante a noite e, em seguida, visualizadas com um anticorpo secundário conjugado com rodamina. Para identificar espermatogônias e espermatócitos, realizamos imunocoloração com anticorpos contra SCP3 (vermelho) e E-caderina (verde claro), respectivamente. imagens fundidas de núcleos DAPI-coradas (azul) e

BORIS

RNA isoforma (vermelho) tomado com ampliação de 20x; A ampliação das imagens mais elevados são 63X. Setas com letras indicam: SG-espermatogônias, SC – espermatócitos, St – espermátides (células pequenas, alongadas com núcleos alongados, respectivamente). O controle (CTR) é a coloração com anticorpo secundário rodamina conjugado sozinho.

Para identificar os tipos específicos de células que expressam

BORIS

isoformas no testículo adulto, realizou-se RNA

in situ

hibridação usando preparações fixas de testículo humano normal. A imunocoloração de testículo com anticorpos para SCP3 e E-caderina foi usada para distinguir espermatogônia e espermatócitos, respectivamente, enquanto espermatídeos foram identificados morfologicamente células como pequenas e alongadas com núcleos alongados (Fig. 4C, E-cad, SCP3). A seguir à hibridação com seis sondas de PCR marcados com o objectivo de detectar especificamente a cada um dos seis

BORIS

subfamílias, os transcritos de isoformas foram detectadas em quase todos os estádios da espermatogénese (Fig. 4C). Todos os seis

BORIS

subfamílias de transcrição eram menos abundantes no citoplasma das espermatogônias de espermatócitos, enquanto espermátides foram altamente positivas para

BORIS

sf2 e marginalmente positivo para SF5 e SF6. Assim, sf2, SF5 e SF6 parecem caracterizar as fases posteriores da espermatogênese de espermatócitos para espermátides. Um estudo anterior [2] usando a galinha anticorpo anti-Boris e um 5 ‘-end rotulados

BORIS

sonda, tanto específico para o terminal N258, mostrou que a expressão do

BORIS B0

isoforma foi restrita aos espermatócitos. O presente trabalho complementa a anterior avaliação de

BORIS

localização transcrição, fornecendo provas para a expressão de todos os seis

BORIS

subfamílias em testículo humano adulto. A expressão diferencial aparente de subfamílias individuais durante a progressão da cedo para fases posteriores da espermatogênese indica que a expressão de

BORIS

isoformas é regulada pelo desenvolvimento.

BORIS

isoformas codificar câncer putativa -testis antígenos

estudos anteriores mostraram que o

BORIS B0

isoforma é anormalmente expressa em muitos tipos de cancros humanos, incluindo os cânceres primários e linhas celulares de cancro, qualificando-o como que codifica uma putativa câncer antigénio testículo (CTA) [6], [8], [24], [25], [26]. Para entender a relevância do múltiplo recém-descoberto

BORIS

isoformas ao desenvolvimento e progressão do cancro, nós testamos o câncer painel de linha celular NCI-60 por RT-PCR e descobriu que cerca de 70% dessas linhas de células expressa transcrições de algumas isoformas (Fig. 5A). A maioria das linhas positivas, no entanto, manifestou níveis de

BORIS

transcritos que eram bastante baixa a menos de 500-1,500 transcritos por 50 ng de ARN total. No entanto, os níveis eram suficientes para detectar dois padrões distintos de

BORIS

expressão isoforma. O primeiro padrão, exemplificada na Figura 5B para a linha celular K562, foi associada com mais de 20.000

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transcrições (somado em todos os seis

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subfamílias) por 50 ng de RNA total. Neste subconjunto de linhas celulares (8 de 60, 13% do painel NCI-60), as transcrições SF1 estavam presentes nos níveis mais altos, com uma média de cerca de 3 vezes mais elevado do que os níveis de SF2, 10 vezes mais elevada do que para a SF3 e SF4, 50 vezes mais elevada do que para SF6, e mais do que 100 vezes maior do que para SF5 (Fig. 5B). As linhas de células que mostram este padrão de expressão originado a partir de diferentes tecidos, incluindo os do ovário, do pulmão, da mama, do sangue e da pele, indicando que a expressão de

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isoformas não está especificamente associada com cancros de origens particulares.

(a) O

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subfamílias são significativamente regulada positivamente em células cancerosas, em comparação com células normais. No caso de células normais (N) – a expressão de

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isoformas foi analisado em 13 tecidos e 4 linhas de células primárias. Para as células tumorais (T) – as linhas celulares de cancro do NCI-60 foram analisadas. 59 das linhas celulares de cancro do NCI-60, 13 tecidos normais, e 4 linhas de células primárias normais foram analisados ​​pela abordagem de quantificação absoluta com normalização de níveis de GAPDH, e representada graficamente usando uma escala logarítmica. Os níveis de

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expressão da isoforma variar bastante (de 0 a 60000 transcritos por 50 ng de ARN total). linhas vermelhas indicam valores médios para cada

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subfamília. (B) O primeiro padrão de

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expressão isoforma em NCI-60 células cancerosas, como representado pela linha de células de câncer K562. (C) O segundo padrão de

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isoformas expressão no painel NCI-60 é exemplificado pela linha celular de cancro OVCAR3. (D-J)

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isoformas expressão analisados ​​por RPA. Alíquotas de RNA total obtido a partir de rim, testículo e uma linha de células K562 foram hibridizadas com sondas de RNA anti-sentido

32P-rotulados. Os fragmentos protegidos RNase (setas) foram detectados apenas no testículo e K562, mas não no rim. A primeira pista de cada gel é um controlo, uma sonda não digerida incubadas com RNA de levedura. (D) RPA com riboprobe sf1 /SF5 produz 154 pb e 40 pb fragmentos, correspondentes a sf1 e SF5, respectivamente.