Abstract

Fundo

O câncer gástrico é um dos cancros mais comuns no mundo. O “países economicamente desenvolvidos” estilo de vida, incluindo a dieta, constitui um factor de risco favorecendo esse tipo de câncer. modulação dieta pode reduzir a incidência de câncer digestivo. Entre os componentes dos alimentos promissores, Propionibacteria lácteos foram mostrados para desencadear a apoptose de células cancerígenas do cólon humano, através da liberação de cadeia curta acetato de ácidos graxos e propionato.

Metodologia /Principais Achados

Um leite fermentado , exclusivamente fermentado por

P. freudenreichii

, foi recentemente concebido. Neste trabalho, o potencial pró-apoptótico deste novo leite fermentado foi demonstrada em células de cancro gástrico humano HGT-1. sobrenadante de leite fermentado induzida características típicas da apoptose, incluindo a condensação de cromatina, formação de corpos apoptóticos, em escada do ADN, interrupção do ciclo celular e surgimento de uma população subG1, exposição de fosfatidilserina no folheto exterior da membrana plasmática, a acumulação de espécies de oxigénio reactivo, mitocondrial transmembranar potencial perturbação, caspase ativação e liberação do citocromo c. Notavelmente, este novo leite fermentado contendo

P. freudenreichii

aumentou a citotoxicidade de camptotecina, uma droga usada na quimioterapia do cancro gástrico.

Conclusões /Significado

Esta alteração leite probiótico fermentado pode, assim, ser útil como parte de uma dieta preventiva destinada a prevenir o câncer gástrico e /ou como um suplemento alimentar para potencializar tratamentos terapêuticos câncer

Citation:. Cousin FJ, Jouan-Lanhouet S, Dimanche-Boitrel MT, Corcos L, Jan G (2012) o leite fermentado por

Propionibacterium freudenreichii

induz a apoptose de HGT-1 células de câncer gástrico humano. PLoS ONE 7 (3): e31892. doi: 10.1371 /journal.pone.0031892

editor: Abbes Belkhiri, Vanderbilt University Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 15 de novembro de 2011; Aceito: 19 de janeiro de 2012; Publicação: 19 de março de 2012

Direitos de autor: © 2012 Primo et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pelo Conseil Régional de Bretagne por meio da chamada développement CBB para projetos e pelo Centro Nacional Interprofissional de l’Économie laitière (CNIEL) através de pelo chamado Comité Científico da Syndifrais para projetos. Investigação no grupo IRSET foi apoiado por subsídios da Ligue Nationale Contre le Cancer (Côte d’Armor, Ille-et-Vilaine, Morbihan, Vendée e Sarthe COMITÉS), INSERM, da Universidade de Rennes 1 e da Região Bretagne. FJC recebeu uma bolsa da CNIEL (doutoramento). SJL foi apoiado pela Association pour la Recherche sur le Cancer (doutoramento). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Diet modula o risco de desenvolver câncer gástrico

o cancro é a principal causa de morte nos países economicamente desenvolvidos resultantes de escolhas de estilo de vida associados ao câncer, incluindo tabagismo, sedentarismo, e “ocidentalizada” dieta [ ,,,0],1]. Na verdade, o papel da dieta no desenvolvimento do câncer é fortemente apoiada por estudos epidemiológicos, em especial relativamente aos cancros do tracto digestivo. O câncer gástrico (GC) representa o terceiro tipo de cânceres letais para os homens no mundo. Em 2008, 640.600 casos de GC foram estimados, causando 464.400 mortes em todo o mundo [1]. Esta doença é particularmente frequente no leste da Ásia e na Europa Central e Oriental. Os fatores etiológicos mais importantes envolvidos na carcinogênese gástrica são dieta e

infecção por Helicobacter pylori

. provas substanciais, principalmente a partir de estudos de caso-controle, sugere que o risco de GC contratação é aumentada pela alta ingestão de alimentos salgados, em conserva ou defumados, tradicionalmente, bem como peixe seco e carne. Pelo contrário, fibras, frutas e legumes frescos, talvez devido ao seu teor de vitamina C, foram encontrados para ser inversamente associado com o risco GC [2], [3]. O impacto de componentes naturais /alimentares na carcinogénese do estômago, assim, tem sido investigada durante as últimas décadas [4] – [6]. Entre estes, probióticos e a sua capacidade para inibir o desenvolvimento do cancro atraído um interesse científico [7], [8]. Um probiótico é geralmente definido como “um microrganismo vivo que, quando administrados em quantidades adequadas, conferem um benefício à saúde do hospedeiro” [9]. Enquanto alguns microorganismos como

H. pylori

pode favorecer GC, outros podem ter um efeito benéfico, impedindo cancros digestivos. Em particular, estirpes seleccionadas de bactérias probióticas podem limitar o desenvolvimento de cancro em modelos de animais da carcinogénese [10]. Isto foi particularmente evidenciado para câncer de cólon enquanto pouco se sabe sobre os possíveis efeitos dos probióticos no GC. Uma possível explicação mecanicista de um tal efeito protector é o

na liberação situ

de metabolitos anti-cancerígenos, tais como ácidos graxos de cadeia curta (AGCC).

ácidos graxos de cadeia curta induzir a apoptose de células cancerosas

SCFA, incluindo acetato, propionato e butirato, são aniões importantes do conteúdo intestinal e a sua concentração pode ser modulada pela dieta. Eles foram mostrados a desempenhar um papel fundamental em funções fisiológicas importantes, incluindo a modulação da proliferação de células epiteliais equilíbrio /apoptose digestivo. Isto envolve a captura de SCFA-mediadas por ciclo celular, inibição da histona desacetilase e a estimulação da apoptose em células transformadas, mas também a estimulação da diferenciação em células saudáveis ​​[11], [12]. Também tem sido relatado que o butirato de SCFA e propionato tanto induzir a apoptose em linhas celulares de carcinoma gástrico humano [13] – [15]. A apoptose é um regulamento número de células processo fisiológico natural, permitindo e constitui um alvo para a quimioterapia anti-câncer [16]. Apoptose permite a depleção das células cancerosas de forma “limpa”. As células cancerosas fragmentar numa reacção em cadeia coordenada e os resíduos são absorvidos pelos tecidos adjacentes e sistema imune [17], [18]. Dois principais vias apoptóticas foram descritas: a via extrínseca, que é mediada pela activação de receptores de morte e a caspase 8, e da via intrínseca, em que as mitocôndrias e caspase 9 estão envolvidos [16]. Geralmente, nas células cancerosas, a função apoptótica é inexistente, o que pode explicar a sua proliferação contínua e, consequentemente, a formação de tumores. A capacidade para induzir a apoptose das células cancerosas é assim reconhecida para o seu potencial terapêutico [16]. Desde Propionibacteria lácteos são capazes de produzir benéficos SCFA pró-apoptóticos, eles podem ser úteis na prevenção ou tratamento do câncer.

Propionibacterium freudenreichii

pode favorecer o esgotamento de apoptose das células cancerosas digestivos

Este Propionibacterium probiótico leiteiro foi mostrada para induzir a morte celular de diferentes linhas celulares de cancro do cólon humano através da indução de apoptose, em co-culturas [19]. Os compostos activos, secretados para o meio, desencadear o circuito apoptótico mitocondrial intrínseca em células de cancro colorectal humano em cultura. Em particular, os SCFA acetato e propionato lançado pela

P. freudenreichii

induzir apoptose, agindo sobre o translocador de nucleótidos adenina mitocondrial, causando despolarização mitocôndrias e permeabilização, o vazamento de citocromo C e a activação de caspase [19], [20]. No entanto, os sobrenadantes propionibacterial são ainda mais pró-apoptótica do que o etilo e propionato de SCFA, utilizados nas concentrações medidos nos sobrenadantes, sugerindo que outros compostos podem estar envolvidos neste efeito. cepas de

P selecionado. freudenreichii

permanecem vivos e metabolicamente ativo no intestino dos seres humanos e de ratos associado a microbioma humano onde produzem SCFA [21], [22]. Consequentemente, foram mostrados para aumentar a apoptose em células epiteliais do cólon tais transformadas de ratos alimentados com o agente cancerígeno 1,2-dimetilhidrazina (DMH), mas não no controlo mais saudáveis ​​[23]. Propionibacteria poderia constituir probióticos favorecendo a profilaxia do cancro do cólon, desde que eles atinjam seus alvos vivos e metabolicamente ativo. Neste contexto, o vector, ou veículo de entrega probiótico, foi mostrado para determinar a sobrevivência e a actividade Propionibacteria [21], [24], [25]. produtos lácteos complexos, tais como iogurte e queijo, em particular, proteger Propionibacteria do stress, mas contêm uma mistura complexa de bactérias. Assim, não é possível atribuir o efeito benéfico a uma estirpe particular.

Um leite fermentado foi avaliada como veículo de entrega Propionibacteria neste contexto

Neste estudo, foi utilizado um novo grau alimentício leite fermentado contendo apenas

P. freudenreichii

como um único microflora. Como este produto contém ambos os Propionibacteria vivos e dos seus metabolitos activos, deve trazê-los em contato com a mucosa gástrica quando ingerido. Este leite fermentado foi investigada com relação a HGT-1 indução gástrico humano apoptose de células cancerosas. Com efeito, Propionibacteria são conhecidos para matar células de cancro do cólon humano, mas o seu efeito sobre as células de cancro gástrico é desconhecido. O leite fermentado matou células HGT-1 de uma forma tempo e dose-dependente. Foram observadas características típicas do processo de apoptose, incluindo queda de viabilidade, condensação da cromatina, formação de corpos apoptóticos, escada do ADN, a produção de ROS, mitocondrial membrana perturbação potencial, ativação da caspase, parada do ciclo celular e surgimento de uma população subG1.

resultados de

P. leite freudenreichii

fermentado mata gástrica humana e células cancerígenas do cólon

P. freudenreichii

ITG P9 cresceu em 72 h a 30 ° C no leite suplementado e ultrafiltrado leite suplementado para chegar população final de 9,43 log

10 unidades formadoras de colônia (UFC) /mL e 9,35 log

10 ufc /mL, respectivamente. As concentrações de SCFA foram etilo 26,21 mM e propionato de 54,47 mM (2,08 propionato rácio /etilo) no leite fermentado sobrenadante enquanto que eles eram 24,00 e 53,32 mM mm (2,22 ratio) no sobrenadante de leite ultrafiltrado fermentado. Estas proporções eram esperados para Propionibacteria, que geralmente produzem duas vezes mais propionato de etilo como [26]. Doze outras estirpes Propionibacteria laticínios de grau alimentício também foram testadas (ver Tabela S1 e Figura S1). Usando estas estirpes, foram obtidos doze leites fermentados. As concentrações de propionato variaram de 36 a 67 mm populações e Propionibacteria 9,0-9,7 log

10 ufc /mL, para o menor, e para a estirpe mais eficiente, respectivamente.

O potencial citotóxico do sobrenadante preparado com leite ou leite ultrafiltrado, tanto fermentado por

P. freudenreichii

ITG P9, foi investigada. Células HT-29 de cólon humano e HGT-1 células de cancro gástrico humano foram tratadas com estes sobrenadantes. Diferentes diluições que variam de ½ a foram testados. Além disso, a citotoxicidade de uma mistura de etilo e 30 mM de propionato de 15 mM foi testado, em concentrações perto de sobrenadantes diluídos estes ½. Como controlos positivos de indução da apoptose, a camptotecina fármacos de quimioterapia (4 uM) e etoposido (100 uM) foram usadas para células HGT-1 e HT-29, respectivamente. Três métodos diferentes de monitorização da morte celular foram comparados. Como mostrado na Figura S2, azul de metileno, e MTT Os ensaios de exclusão de azul de tripano deu cinética semelhante de morte. Consequentemente, o ensaio de azul de metileno foi utilizado neste estudo para avaliar ainda mais a viabilidade celular. Os produtos lácteos não fermentado (leite ou leite ultrafiltrado) não teve nenhum efeito, nem no modelo HT-29, nem sobre a viabilidade celular HGT-1 (Fig. 1 A, B). O sobrenadante de leite ou leite ultrafiltrado fermentado por

P. freudenreichii

induziram uma citotoxicidade semelhante de uma maneira dependente do tempo em HT-29 e células HGT-1, e perto da citotoxicidade induzida por drogas ou pela mistura de acetato /propionato. morte de metade do máximo de células HGT-1 ocorreu após 24 h e 26 h de tratamento com o leite fermentado e leite fermentado do ultraf iltrado sobrenadantes respectivamente, após 17 h de tratamento com camptotecina e depois de 24 h de tratamento com a mistura de SCFA (Fig. S3) . Além disso, a citotoxicidade dos sobrenadantes de produtos lácteos fermentados em células HGT-1 foi dependente da dose (Fig. 1C). Para cada diluição testada, a queda na viabilidade celular HGT-1 induzida pelo leite fermentado ou leite ultrafiltrado fermentado foi muito semelhante (figura 1C . A Fig. S3). É por isso que os próximos passos do estudo foi realizada apenas com o sobrenadante de leite ultrafiltrado fermentado. Tomados em conjunto, estes dados indicam que a Propionibacteria eficazmente matar células de cólon humano e cancro gástrico, pelo menos em parte, através da produção de propionato de metilo e de etilo (Fig. 1). Alguns outros leites fermentados, fermentados por diferentes estirpes Propionibacteria leiteiro, mostraram efeitos citotóxicos sobre células de cancro semelhantes (Tabela S2).

P. freudenreichii

ITG P9 sendo conhecido pela sua actividade metabólica

in vivo

[22], o leite fermentado correspondente foi ainda estudada.

(A) Efeito da

P. freudenreichii

leite fermentado em células de câncer colorretal humano HT-29. Células HT-29 foram tratadas com uma diluição de ½, em DMEMc, de sobrenadantes obtidos a partir de leite fermentado ou leite ultrafiltrado fermentado (quadrados). Como controlos negativos, as células foram tratadas com ½ diluições de leite fermentado ou leite ultrafiltrado (diamantes). Como controlos positivos (triângulos), as células foram tratadas com DMEMc contendo uma mistura de acetato e propionato de etilo (C2 /C3, 15/30 mM) ou etoposido (100 uM). (B) Efeito do

P. freudenreichii

leite fermentado em HGT-1 células cancerosas gástricas humanas. HGT1 células foram tratadas com uma diluição de ½, em DMEMc, de sobrenadantes obtidos a partir de leite fermentado ou leite ultrafiltrado fermentado (quadrados). Como controlos negativos, as células foram tratadas com ½ diluições de leite fermentado ou leite ultrafiltrado (diamantes). Como controlos positivos (triângulos), as células foram tratadas com DMEMc contendo uma mistura de acetato e propionato de etilo (C2 /C3, 15/30 mM) ou camptotecina (4 uM). (C) Dose-dependência do efeito citotóxico de leite fermentado. células HGT-1 foram tratadas com diferentes diluições de sobrenadante obtidas a partir de leite (símbolos vazios) ou leite ultrafiltrado (símbolos simples), ambos fermentado por

P.

freudenreichii. A viabilidade celular foi determinada pelo ensaio de azul de metileno após diferentes períodos de tratamento. A percentagem de viabilidade foi calculada utilizando a seguinte fórmula: 100 (valores de densidade óptica de células /valores de densidade óptica tratados de células não-tratadas) ×. Os resultados são valores médios de três experiências.

P. leite fermentado induz freudenreichii

marcas típicas da apoptose em células de cancro gástrico humano

morfologia núcleo das células HGT-1, incubadas na presença de

P. freudenreichii

leite ultrafiltrado fermentado foi analisada por microscopia de fluorescência após coloração com Hoechst 33342 (Fig. 2A). A fluorescência nuclear de células não tratadas (controlo) manteve-se inalterada durante o curso de tempo da experiência, com núcleos normais azul (tempo 0 h, a Fig. 2Aa). Durante o tratamento, as células HGT-1 exibiu os condensados ​​de cromatina e núcleos fragmentados características dos núcleos apoptóticos (Fig. 2AB, C), seguidos pelo aparecimento de corpos apoptóticos em 72 h (Fig. 2AD). fragmentação do DNA Inter-nucleosomal resultando em escada do ADN, uma marca típica da apoptose [27], também foi monitorada durante o tratamento de leite ultrafiltrado fermentado. fragmentação do ADN foi observada a partir de 24 h de tratamento com leite ultrafiltrado fermentado (Fig. 2B), e em menor grau com camptotecina (Fig. S3). teor de ADN também foi quantificada por citometria de fluxo após a marcação de iodeto de propidio para estudar o impacto do leite ultrafiltrado fermentado em HGT-1 distribuição do ciclo celular (Fig. 2C). As células não tratadas HGT-1 apresentaram uma distribuição de ciclo celular (Fig. 2Ca) sem fase subG1, que se manteve inalterado no decurso do tempo da experiência (dados não mostrados). A percentagem de células em fase subG1, indicativa de um processo apoptótico, aumentou significativamente com o tempo durante a fermentação de tratamento do leite ultrafiltrado (Fig 2CB, Cc, Cd.): A 24 h (39,24 ± 4,87%), às 48 h (91,63 ± 0,28 %) e em 72 h (94,79 ± 0,45%). Após 48 h e 72 h de tratamento, todas as células estavam em fase de ciclo celular subG1, indicando a morte completa das células HGT-1. Como um controlo, camptotecina induzida características semelhantes em células apoptóticas HGT-1 (Fig. S4).

(A) leite fermentado condensação nuclear induzida por ultrafiltrado. As células foram cultivadas (0 h) ou tratados durante 24, 48 ou 72 h com uma diluição de ½

P. freudenreichii

leite fermentado ultrafiltrado sobrenadante (UF). As células foram então coradas com Hoechst 33342 antes da microscopia de fluorescência. As setas indicam a condensação da cromatina (b), a fragmentação nuclear (c) e formação de corpos apoptóticos (d). (B) O leite fermentado fragmentação do DNA induzido por ultrafiltrado em células HGT-1. O ADN genómico foi extraído e analisado em 1% de gel de agarose. células HGT-1 foram tratadas como em (A). (C) leite alterações induzidas por ultraf iltrado fermentado em distribuição de fases do ciclo celular. conteúdo em ADN de células HGT-1 foi analisada por citometria de fluxo, após coloração com iodeto de propídio. histogramas representativos correspondentes à análise de conteúdo de DNA de células HGT-1 são mostrados. A percentagem da população de células com teor de ADN sub-G1, indicativo de apoptose, é indicado. Proporção de cada subconjuntos de células (sub-G1, G0 /G1, S, G2 /M), dentro da população total de células, é mostrado para cada momento do tratamento. Os resultados são valores médios de três experiências independentes ± DP. *

P Art 0,05, **

P Art 0,01, as células tratadas versus controlo (0 h). A distribuição de fases do ciclo celular de células não tratadas (controlo) manteve-se inalterada durante todo o experimento.

para confirmar a indução da apoptose, translocação phosphatdylserine a partir do interior para o folheto exterior da membrana plasmática foi avaliada por coloração HGT-1 células com uma combinação de anexina V-FITC (AV) e 7-AAD, seguido por citometria de fluxo de análise de fluorescência (Fig. 3). células não tratadas (0 h) apresentou uma alta proporção de células vivas (AV

– /7AAD

-; 92%) e apenas 5% das células foram coradas com anexina V (Fig 3B.). Estas percentagens determinadas em células não tratadas não se alterou durante o curso do tempo da experiência (dados não mostrados). Durante o tratamento de células HGT-1 com ½ diluída leite ultrafiltrado fermentado em DMEMc, a percentagem de células coradas apenas por 7-AAD (necrose indicando) foi muito baixa (Fig. 3B). No entanto, as percentagens de células coradas com anexina V aumentou significativamente de uma forma dependente do tempo e atingiu 80% às 72 h (Fig. 3B). Assim, as células HGT-1 sofreram apoptose após o tratamento com

P. freudenreichii

leite ultrafiltrado fermentado, caracterizado por primeiro coloração positiva AV, indicando a exposição de fosfatidilserina, e, em seguida, tanto AV e coloração positiva 7-AAD, indicando uma perda da integridade da membrana mais tarde. Como um controlo, camptotecina induzida características semelhantes apoptóticos (Fig. S5).

A citometria de fluxo de análise cinética da morte celular em células HGT-1 tratadas com

P. freudenreichii

fermentado leite ultrafiltrado. (A) Uma experiência representativa de Anexina V /7-AAD coloração de células HGT-1 em cada tempo de tratamento é mostrado, com proporções de células positivas Anexina V (AV +; células apoptóticas). (B) análise quantitativa de FACS de anexina V-FITC (AV) ligação a células HGT-1 foi realizada após contracoloração com 7-aminoactinomycin-D (7AAD). Os valores apresentados correspondem à proporção de cada um dos subconjuntos de células, dentro da população total de células, para cada tempo de tratamento. Os resultados são valores médios de três experiências independentes ± DP. *

P Art 0,05, **

P

. 0,01, as células tratadas versus controlo (0 h)

Como AGCC agem diretamente sobre as mitocôndrias, também foram determinados três parâmetros mitocondriais importantes: o potencial ΔΨm interior da membrana, e a geração de ROS, utilizando duas sondas fluorescentes, DIOC (6) 3 (que é ΔΨm-sensível) e de DHE (que detecta o

2

– nível), e a localização do citocromo c. As células não tratadas (0 h) exibiu uma fluorescência elevada (alta ΔΨm) e uma fluorescência de DHE baixa (baixa produção de O

2

-) (Fig. 4A, B). Após o tratamento com leite ultrafiltrado fermentado, uma diminuição dependente do tempo em incorporação de DiOC6 (3) foi observada sonda fluorescente, revelando uma perda de ΔΨm e despolarização da membrana, portanto, mitocondrial (Fig. 4A). As percentagens de células tratadas HGT-1 diminuiu com o potencial de membrana interna aumentou de uma forma dependente do tempo para atingir 96% de células em 72 h. tratamento FCCP foi usada como um controlo positivo da despolarização da membrana mitocondrial. Esta perda de ΔΨm foi confirmada pela perda característico na fluorescência vermelha de JC-1 na sequência de coloração (Fig. 4B). Quanto à produção de ROS em células HGT-1, o leite tratamento ultrafiltrado acumulação induzida fermentado de O

2

-, significativamente após 48 h e 72 h de tratamento (Fig 4C.). Esta acumulação de ROS pode ser parcialmente evitada se as células são pré-tratadas por o sequestrante TEMPOL ROS (Fig. S6). Citocromo c libertação da mitocôndria para o citoplasma é um evento celular chave do programa de apoptose. Imunotransferência exame das fracções enriquecidas em citoplasma, para a presença de citocromo c confirmada uma alteração da sua localização subcelular (Fig. 4D). Citocromo c foi detectado na fracção enriquecida em citoplasma de 24 h de tratamento, indicando deslocalização desta proteína (Fig. 4D). Esta relocalização do citocromo C no citoplasma foi confirmada por imunomarcação, que mostra a imunocoloração difuso em toda a célula após o tratamento, enquanto que a coloração pontuado antes do tratamento (Fig. 4E).

A análise cinética dos acontecimentos mitocondriais em células HGT-1 tratadas com

P. freudenreichii

ultrafiltrado leite fermentado (A) Citometria de fluxo análise cinética da dissipação mitocondrial membrana interna (ΔΨm) com DIOC (6) 3 coloração. Uma vista de sobreposição de uma experiência representativa é mostrado. A dissociação FCCP (50 uM, 20 min) foi utilizado como controlo positivo. As análises quantitativas de perda ΔΨm em 3 experiências independentes são apresentados. Os valores são representados como uma percentagem de células com baixo ΔΨm, dentro da população total de células, para cada tratamento. Os resultados são valores médios de três experiências independentes ± DP. *

P Art 0,05, **

P Art 0,01, tratados em relação ao controlo (0 h). (B) As células HGT-1 foram coradas com JC-1. A perda do potencial de membrana mitocondrial é indicada pela perda progressiva de vermelho-JC-1 agregado de fluorescência e difusão citoplasmática de fluorescência monómero verde (C) por citometria de fluxo de análise cinética de anião superóxido (

2

O -) acumulação com coloração de DHE. Uma sobreposição de uma experiência representativa de detecção de ROS em cada tempo de tratamento é mostrado. As células foram coradas com dihydroethidium e analisadas por citometria de fluxo. A menadiona pró-oxidante (Homens., 100 uM, 15 min) foi utilizado como controlo positivo. Os valores são representados como uma percentagem de células com um aumento de ROS (aumento da intensidade de fluorescência), dentro da população total de células, para cada tratamento. Os resultados são valores médios de três experiências independentes ± DP. *

P Art 0,05, **

P Art 0,01, tratados em relação ao controlo (0 h). (D) O citocromo c deslocalização ao longo de todo o período de tratamento com

P. freudenreichii

leite ultrafiltrado fermentado ½ sobrenadante foi avaliado por análise de Western blot. Após o tratamento de células, fracções citoplasma-Enrich foram analisadas por transferência Western e revelada utilizando um anticorpo anti-citocromo c. Os anticorpos dirigidos contra HSC-70 foram usadas como um controlo de carga. (E) Localização subcelular de citocromo c. As células foram imunocoradas com um anticorpo anti-citocromo C, após coloração MitoTracker e antes da coloração do ADN usando TO-PRO 3. A seta indica a difusão de citocromo C no citoplasma.

P. freudenreichii

leite fermentado ativa caspases

Para confirmar os mecanismos apoptóticos induzidas por ultrafiltrado leite fermentado em células HGT-1, o processamento de caspases 3, 8 e 9 foi analisada por transferência Western e correspondente monitorização atividades enzimáticas no HGT -1 extractos celulares (Fig. 5). O leite ultrafiltrado não fermentada não induziu activação de caspase em células HGT-1: apenas os proformas de caspase-3 e -9 foram detectados no western blot (Fig. 5A) e nenhuma actividade de caspase foi medida (Fig 5B.). O sobrenadante de leite ultrafiltrado fermentado, bem como a camptotecina ou a mistura de propionato de metilo e de etilo em uma razão molar [2: 1], induziu a clivagem de pró-caspase 3 e a geração de formas activas da caspase-3, as subunidades p17 e p12 (Fig. 5A). A activação de caspase-3, que é uma caspase efectora, confirmou a indução de apoptose. Além disso, leite ultrafiltrado fermentado induzida clivagem do pro-caspase-9, que conduz às 35 e 37 kDa, formas processadas. A caspase-8 não foi detectada em células HGT-1 não tratadas de controlo. No entanto, o tratamento com sobrenadantes propionibacterial ou mistura /C3 C2 levou a uma clara detecção da proforma 54 kDa, seguida por sua clivagem após 48 h de tratamento.

Processamento de effector caspase 3 e iniciador caspases 8 e 9 foi seguido por transferência de western e monitorização actividades enzimáticas específicas em células HGT-1. (A) As subunidades proformas e clivados da caspase 3, 8, e 9 foram detectados por Western blotting de lisados ​​de células em HGT-1 tratadas com

P. freudenreichii

leite fermentado ultrafiltrado sobrenadante ½. leite não fermentado ultrafiltrado (UF ½, 48 h), uma mistura de acetato e propionato de etilo (C2 /C3, 15/30 mM, 48 h) e camptotecina (4 ^ M, 48 h) foram utilizados como controlos. Os anticorpos dirigidos contra HSC-70 foram usadas como um controlo de carga. (B) caspases actividades específicas de lisados ​​de células tratadas como acima descrito, foram estudadas utilizando os péptidos indicados e calculada tal como descrito em materiais e métodos. Os resultados são valores médios de três experiências ± desvio padrão. *

P Art 0,05, **

P

. 0,01, tratados em relação ao controlo (0 h)

A quantificação da caspase-3, actividades enzimáticas -8 e -9 confirmado a activação de caspase por ambos os metabolitos e propionibacterial por camptotecina. Na verdade, caspases-9 e -3 foram ativados nas fases iniciais do tratamento, enquanto a caspase-8 parecia ativado posteriormente (Fig. 5B). A camptotecina e a mistura de SCFA activado todos os três caspases estudados. Estes dados confirmaram a activação da via intrínseca da apoptose por meio de tratamento de leite ultrafiltrado fermentado, com uma activação precoce de caspase-9 e, em seguida, da caspase-3 e -8.

P. leite fermentado freudenreichii

aumenta a citotoxicidade camptotecina

Campthotecin é um alcalóide citotóxico quinolina que inibe a enzima topoisomerase I de ADN (topo I) e é largamente utilizado no tratamento quimioterapêutico de GC. Mostrámos anteriormente que os metabolitos propionibacterial induzir a apoptose em células HGT-1 através da via de morte mitocondrial. A seguir, estudaram a apoptose induzida pela combinação de ambos camptotecina e leite ultrafiltrado fermentado em células HGT-1. As concentrações aumentadas de camptotecina (0, 0,25, 0,5, 1, 2 mM) em combinação com concentrações aumentadas de leite ultrafiltrado fermentado (0,, ⅛, ¼) foram testados sobre a viabilidade celular HGT-1 e tanto a perda induzida de HGT-1 viabilidade , de um modo dependente da dose (Fig. 6). Além disso, a adição de leite ultrafiltrado fermentado aumentou significativamente a citotoxicidade de camptotecina em células de HGT-1 (Fig. 6). Por exemplo, 0,25 uM e camptotecina leite ultrafiltrado fermentado diluído para ⅛ levou a uma perda de viabilidade de 8,6% e 18,6%, respectivamente. A combinação destes dois compostos conduziu a uma perda de viabilidade celular de 29,8% (Fig. 6), sugerindo um efeito de citotoxicidade quando adicionado a camptotecina foi combinada com leite ultrafiltrado fermentado em células HGT-1. Por conseguinte, o índice de combinação (IC), calculada como anteriormente [28], tem um valor de 1, indicando um efeito aditivo de camptotecina e tratamentos leite ultrafiltrado fermentado.

Viabilidade de HGT-1 cancro gástrico humano tratado durante 24 h foi avaliada por ensaio de azul de metileno. células HGT-1 foram tratadas com diferentes concentrações de camptotecina (0 a 2 uM) em conjunto com diferentes diluições de

P. freudenreichii

leite fermentado ultrafiltrado sobrenadante (UF). A percentagem de viabilidade foi calculada através da seguinte fórmula: 100 (valores de densidade óptica de células /valores de densidade óptica tratados de células não-tratadas) ×. Os resultados são valores médios de três experiências ± desvio padrão. *

P Art 0,05, **

P

. 0,01, as células tratadas contra controles (mesma concentração camptotecina sem fermentado sobrenadante leite ultrafiltrado e mesma diluição do leite ultrafiltrado sobrenadante fermentado sem camptotecina)

Discussão

Um novo leite fermentado, contendo

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como uma única bactéria, foi desenvolvido a fim de investigar o potencial probiótico desta preparação de produtos lácteos Propionibacteria (revisto em [29]). Neste estudo, que relatam que a fase aquosa deste leite fermentado mata cólon humano e células de cancro gástrico através metabolitos, incluindo o propionato de etilo, e libertados por esta bactéria. Esta noção é baseada nos efeitos citotóxicos observados de

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fermentado sobrenadantes de leite em células de câncer HGT-1 HT-29 culta e. Este efeito foi obtido com sobrenadantes de ultracentrifugação, isto é, a fase aquosa de leite fermentado, desprovidas de caseínas e de bactérias, que mostra que os compostos activos são secretadas, tal como anteriormente descrito para a Propionibacteria [19]. Por esta razão, a maior parte das experiências no presente trabalho foram realizadas com leite ultrafiltrado fermentado (Fig. 1). Nós demonstramos pela primeira vez que

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fermentado apoptose induzida por sobrenadante de células leite HGT-1 de uma forma tempo e dose-dependente com o aparecimento de características morfológicas e bioquímicas clássicos de apoptose (condensado e fragmentado chromation, escada de ADN e a acumulação de células no ciclo celular subG1 fase).

Nós olhamos em seguida, se os mecanismos celulares envolvidos na HGT-1 via de morte celular foram semelhantes aos da via de morte mitocondrial desencadeada em Caco-2 e HT-29 células cancerígenas do cólon humano por

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DMEMc sobrenadantes de cultura [19], [20]. Os eventos sub-celulares e bioquímicas observadas em células tratadas HGT-1 com leite ultrafiltrado fermentado foram semelhantes e incluídos, pelo menos, perda ΔΨm mitocondrial, ROS (O

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-) geração, as caspases processamento e activação, citocromo c deslocalização no citoplasma (Fig. 3, 4, 5). sobrenadante de leite fermentado induzida processamento e activação da caspase-8, além de caspases -3 e -9.