Abstract

Fundo

A matriz extracelular (ECM) remodelação é predominantemente mediada por fibroblastos utilizando intracelulares e extracelulares vias . Embora seja bem conhecido que a degradação extracelular da ECM por proteases derivadas de células cancerosas facilita a invasão celular, a degradação intracelular dos componentes da matriz extracelular por células cancerosas não foi clarificado. O objetivo deste estudo foi caracterizar a internalização de colágeno, que é a etapa inicial da via de degradação intracelular em células de câncer de pâncreas, à luz da transição epitelial-mesenquimal (EMT).

Metodologia /Apreciação Principais

Foram analisadas a função da internalização de colágeno em duas linhas celulares de cancro do pâncreas, as células estreladas pancreáticas (PSCs) SUIT-2 e KP-2, e usando Oregon verde 488-gelatina. PSCs teve uma forte capacidade de absorção de colágeno, e as células de câncer de pâncreas também internalizado colágeno, embora de forma menos eficiente. As capacidades de colagénio internalização de SUIT-2 e células KP-2 foram promovidas por EMT induzida por β1 do factor de crescimento transformante humano recombinante (

P

0,05). Expressão de Endo180, um receptor de absorção de colagénio, foi elevada em linhas celulares de cancro pancreático mesenquimais, como determinado por expressão de EMT marcador (

P

0,01). RT-PCR quantitativa e análises de Western blot mostraram que a expressão Endo180 também foi aumentada por indução EMT no terno-2 e células KP-2. Endo180 knockdown por interferência de RNA atenuou a absorção de colágeno (

P Art 0,01) e habilidades invasivos (

P Art 0,05). Da SUIT-2 e células KP-2

Conclusões /Significado

pancreáticas células cancerosas são capazes de internalização de colágeno, que é reforçada por EMT. Este sistema de apuramento ECM pode ser um novo mecanismo para invasão celular e um potencial alvo terapêutico no cancro pancreático

Citation:. Ikenaga N, Ohuchida K, Mizumoto K, Akagawa S, Fujiwara K, Eguchi D, et al. (2012) As células do cancro do pâncreas aumentar a capacidade do colágeno Internalização durante a transição epitelial-mesenquimal. PLoS ONE 7 (7): e40434. doi: 10.1371 /journal.pone.0040434

editor: Fazlul H. Sarkar, Wayne Escola de Medicina da Universidade de Estado, Estados Unidos da América

Recebido: 16 de fevereiro de 2012; Aceito: 06 de junho de 2012; Publicação: 05 de julho de 2012

Direitos de autor: © 2012 Ikenaga et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O estudo foi apoiado por uma bolsa do Ministério da Educação, Cultura, Desporto, Ciência e Tecnologia do Japão, a Fundação Memorial Uehara e da Fundação Fukuoka para a Saúde Sound. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de pâncreas é um dos cânceres mais letais, e sua taxa de sobrevida em 5 anos é de apenas 5% [1]. É caracterizada pela excessiva desmoplasia com abundantes de matriz extracelular (ECM), que desempenha um papel crucial no seu comportamento agressivo [2], [3]. O ECM dentro de tumores pancreáticos é produzido principalmente pelo fenótipo activado de células estreladas pancreáticas (PSCs), e a remodelação de ECM por unidades e as células cancerígenas pancreáticas é um dos passos cruciais durante a progressão do cancro [2], [4], [5]. Até à data, uma série de proteases extracelulares derivadas de células de cancro têm sido identificados como contribuintes para a invasão e progressão do cancro, incluindo as metaloproteinases de matriz (MMPs), uma desintegrina e metaloproteinases (Adams) e activador de plasminogénio de uroquinase [6].

colagénios são os componentes de ECM mais abundantes no organismo e submetidos a síntese e a degradação contínua, sob condições fisiológicas e patológicas. fibroblastos estromais, que são as principais células para manter a homeostase ECM, degradam fibrilas de colagénio intracelularmente para além da degradação extracelular mediada por várias proteases de [7], [8]. O passo inicial de absorção de colagénio é a ligação do colagénio aos receptores de membrana, tais como α

2β

1-integrina [7], [9] e Endo180 [10], seguido por endocitose subsequente, o transporte para os lisossomas e degradação por cathepsins cisteína lisossomais [11]. Endo180 é um membro da família do receptor de manose de macrófagos sujeitos a internalização constitutiva e reciclagem [12] e é essencial para a absorção celular de colagénio em fibroblastos [10]. Recentemente, Endo180 foi encontrado para ser expresso não só em fibroblastos, mas também um subconjunto das neoplasias, incluindo glioblastomas [13] e-basais como tumores da mama [14].

epitelial-mesenquimal transição (EMT) é um processo de desenvolvimento em que as células epiteliais polarizadas mudar para um fenótipo mesenquimal altamente móveis para sofrer várias alterações bioquímicas [15]. No cancro epitelial, indução EMT é um processo central na progressão do cancro, e proporciona células cancerosas com capacidade invasiva e metastática. redução da expressão de E-caderina, um dos marcadores epiteliais, indica mesenquimal de células cancerosas epiteliais, e está envolvido na mau prognóstico de cancro pancreático [16]. Também se espera que as moléculas relacionadas com o EMT ser alvos terapêuticos.

Com base nestas linhas de evidência que os fibroblastos têm uma forte capacidade para degradar o colagénio e que o fenótipo mesenquimal está associado com a invasão do cancro, a hipótese de que as células cancerígenas pancreáticas também internalizar colágeno, semelhante a fibroblastos, e reforçar a sua capacidade invasiva por sofrer EMT. Até à data, a degradação extracelular regulada por proteases extracelulares, incluindo MMPs, derivadas de células de cancro do pâncreas tem sido bem estabelecida. No entanto, a degradação intracelular de colagénio por células de cancro do pâncreas não foi documentada. Nós investigamos se as células de câncer de pâncreas tem a capacidade de internalizar colágeno em um

in vitro

estudo e avaliou o impacto da internalização de colágeno na invasão do cancro do pâncreas à luz da EMT.

Resultados

Não só os PSCs, mas também as células de câncer de pâncreas tem a capacidade de internalizar colágeno

Nós estabelecemos

in vitro

PSCs de cancros pancreáticos ressecados examinar se PSCs têm a função de absorção de colágeno, similar para fibroblastos. A identidade das unidades activadas foi confirmada por coloração imuno-histoquímica para vimentina e actina de músculo liso-α (α-SMA) tal como descrito anteriormente [17]. Oregon Verde 488-gelatina (OG-gelatina), uma forma desnaturada do colagénio, foi visualizado no citoplasma das unidades após incubação durante 2 horas (Figura 1A), e citometria de fluxo análises demonstraram que mais de 95% de unidades tinham internalizado colagénio ( A Figura 1B). As linhas de células do cancro do pâncreas SUIT-2 e KP-2 também foram capazes de internalizar nativa colagénio I, embora de forma menos eficiente (Figura 1B). A análise de microscopia confocal confirmou a localização intracelular do OG-gelatina em células de cancro do pâncreas (Figura 1C). Em particular, as células cancerosas em forma de fuso com uma morfologia mesenquimal parecia internalizar colagénio fortemente. As células incubadas com f luoresceina conjugado com albumina de soro bovino (BSA-fluoresceína) como um controle não continha sinais em ambas as microfotografias de fluorescência e citometria de fluxo (dados não apresentados).

(A) microfotografia representativas da coloração por imunofluorescência de α- SMA em PSCs. As unidades têm uma morfologia estrelada semelhante ou em forma de fuso, e expressar α-SMA (vermelho). Os PSCs internalizaram muitas moléculas de colágeno (verde). Barra de escala: 100? m. Ampliação original: × 200. (B) as análises de citometria de fluxo de unidades, as células SUIT-2 e células de KP-2, após incubação com OG-gelatina durante 2 h. Cada amostra foi analisada em triplicado, e as percentagens de células-colagénio internalizados são apresentados como médias ± DP nas figuras representativas. (C) microscopia confocal imagens de colágeno no citoplasma da SUIT-2 e células KP-2. As células foram incubadas com OG-gelatina (verde), fixadas e coradas com Alexa Fluor 647 conjugado com faloidina (vermelho) para visualizar a célula descreve. seções ortogonais nos planos XY, XZ e YZ são mostrados. Os eixos Y e Z ilustram a localização do colagénio internalizado mais claramente (pontas de seta). Em particular, as células cancerosas em forma de fuso com uma morfologia mesenquimal contêm muitas moléculas de colagénio (setas). Barras de escala: 100 mm. ampliação original:. × 400

EMT em células de câncer de pâncreas aumenta a sua colágeno internalização

Nós investigamos se EMT em células de câncer de pâncreas é associado com a função de interiorização colágeno, pois PSCs, que têm um fenótipo mesenquimal, têm uma forte capacidade para a internalização de colágeno. Para a indução de EMT em células cancerosas, foi utilizado factor de crescimento transformante -β1 (TGF), o que é um factor importante durante EMT com muitos papéis contributivo [15]. células de cancro do pâncreas tratados com TGF-β1 mostrou uma morfologia fibroblástica e espalhamento de células em forma de fuso em comparação com as células cancerosas não tratadas (Figura 2A). As análises de transferência de Western mostrou que a expressão de E-caderina foi reduzida e vimentina expressão foi aumentado no terno-2 e KP-2 de células após o tratamento com TGF-β1 (Figura 2B). Estas descobertas indicam que as células de cancro do pâncreas alterado para um fenótipo mesenquimal, o que significa que EMT foi induzida por TGF-β1. As habilidades de colágeno internalização de células SUIT-2 e KP-2 foram promovidos por indução EMT com o tratamento TGF-β1 durante 72 h (

P Art 0,05; Figura 2C, 2D).

células SUIT-2 e KP-2 (a) são transformadas para uma morfologia após o tratamento em forma de fuso com TGF-β1 durante 72 h. Barras de escala: 100 mm. Ampliação original: × 200. (B) Análise de Western blot mostrando que a expressão da caderina-E é reduzida e expressão de vimentina é aumentada em SUIT-2 e KP-2 células por tratamento TGF-β1. As diferenças de dobragem nos imunoblots representativos quantificados por densitometria são mostrados abaixo das respectivas faixas. unt: não tratado. (C) As células SUIT-2 e KP-2 foram cultivadas com ou sem TGF-β1 durante 72 h, seguido de incubação com OG-gelatina (verde) durante 2 h. As células foram fixadas e coradas com Alexa Fluor 647 conjugado com faloidina (vermelho) para visualizar os contornos celulares. A microscopia de fluorescência revelou que o colágeno internalizado por SUIT-2 e células KP-2 é aumentada após o tratamento com TGF-β1. Barras de escala: 100 mm. Ampliação original: × 400. (D) Os dados quantitativos para internalização de colágeno por SUIT-2 e células KP-2 determinada por citometria de fluxo revela diferenças significativas na capacidade absorção de colágeno entre as células cancerosas tratadas com TGF-β1 não tratada e. Cada linha celular foi analisada em triplicado e as percentagens de células internalizado-colágeno são expressos como médias ± DP. Comparações entre as células não tratadas e TGF-p1-tratados foram realizadas utilizando Student

t

-test. Todos os experimentos foram realizados mais de três vezes e imagens representativas são mostrados.

Endo180 expressão está associada com o fenótipo mesenquimal de células de câncer de pâncreas

Em seguida, foram analisados ​​os níveis de EMT expressão marcadores, incluindo e-caderina e vimentina, o principal receptor de colágeno α2β1 integrina e o receptor de captação de colágeno Endo180 nas linhas celulares de cancro do pâncreas para esclarecer a relação entre EMT e internalização de colágeno. As linhas de células de cancro do pâncreas expresso vários níveis dos marcadores EMT, α2β1-integrina e Endo180 (Figura 3A). Em primeiro lugar, utilizou-se a proporção de E-caderina para vimentina para classificar as células epiteliais ou como fenótipo mesenquimal, e depois compara os níveis de α2-integrina, β1-integrina e expressão Endo180 entre as células classificadas nos dois fenótipos. Endo180 foi mais altamente expresso em linhas celulares de cancro pancreático mesenquimais do que nas linhas de células do cancro do pâncreas epiteliais, enquanto a expressão de β1-integrina e α2-integrina não estava correlacionada com o fenótipo de células (

P

0,01 A Figura 3B). A expressão de ARNm Endo180 em células SUIT-2 e KP-2 foi regulada por indução EMT com o tratamento de TGF-β1, em conjunto com o aumento da expressão na superfície celular de Endo180 de 9,3 ± 0,1% para 19,9 ± 2,4% em células SUIT-2 e de 19,1 ± 1,0% para 24,8 ± 1,5% em células KP-2 (

P

0,01, Figura 3C).

(a), os níveis de expressão relativa da e-caderina, vimentina , Endo180, β1-integrina e α2-integrina em 10 linhas de células de cancro do pâncreas e quatro culturas PSC. Os níveis de expressão de todos os genes foram normalizados pelos níveis de expressão correspondentes de β-actina. Cada amostra foi analisada em triplicado, e os dados estão expressos como médias ± DP. Um quinto dos níveis adquiridos para E-caderina e Endo180 são mostrados no gráfico, para facilidade de referência. (B) As linhas celulares de cancro pancreático foram divididos em dois grupos que mostram um fenótipo epitelial (SW1990, Hs766T, BxPC-3, CAPAN-1 e AsPC-1) e um fenótipo mesenquimal (SUIT-2, CFPAC-1, Mia PaCa- 2, Panc-1 e KP-2) na base da razão de expressão de e-caderina para a vimentina. Endo180 é mais altamente expresso em linhas celulares com o fenótipo mesenquimal do que naqueles com o fenótipo epitelial, enquanto que as expressões de β1-integrina e α2-integrina não estão correlacionados com os fenótipos celulares. As análises estatísticas foram realizadas utilizando o teste de Mann-Whitney

U

-teste. (C) A SUIT-2 e células KP-2 foram incubadas com ou sem TGF-β1 durante 72 h, e os níveis de expressão Endo180, β1-integrina e α2-integrina foram determinados por RT-PCR quantitativo (painel superior). Os níveis de expressão de todos os genes foram normalizados pelos níveis de expressão correspondentes do rRNA 18S. As alterações de dobragem foram calculadas como os níveis de ARNm em células TGF-p1-tratados divididos pelos níveis em células não tratadas. expressão de mRNA Endo180 no terno-2 e células KP-2 é mais altamente aumentada por indução EMT de β1-integrina e expressão de mRNA α2-integrina. O aumento da expressão na superfície celular de Endo180 em EMT-induzida SUIT-2 e KP-2 células (linhas vermelhas), em comparação com a SUIT-2 não tratadas e células KP-2 (linhas azuis), respectivamente, foi confirmada por citometria de fluxo de análise (

P

0,01 para cada; painéis inferiores). Cada amostra foi analisada em triplicado, e as comparações entre as células não tratadas e TGF-tratados-p1 foram realizadas utilizando Student

t

-teste.

Knockdown de Endo180 em células de câncer de pâncreas atenua sua absorção de colágeno e habilidades invasivos

Para investigar se a expressão Endo180 está associada com a captação de colágeno pelas células de câncer de pâncreas, nós derrubado mRNA Endo180 no terno-2 e células KP-2 usando a tecnologia de interferência de RNA. transfecção transiente de siEndo180-1 e siEndo180-2 diminuição da expressão Endo180 tanto o ARNm e os níveis de proteína (Figura 4A). As morfologias celulares de SUIT-2 e células KP-2 não se alterou após Endo180 knockdown. As habilidades de colágeno internalização de SUIT-2 e células KP-2 sob tratamento com TGF-β1 foram drasticamente atenuado pela supressão da expressão Endo180 (

P Art 0,01; Figura 4B). Além disso, os ensaios de matriz de colagénio 3D mostrou que as células de cancro induzido por EMT apresentaram um fenótipo menos invasiva, quando Endo180 expressão foi suprimida com siARN. TGF-β1 ainda reforçada invasão de células cancerosas na presença de ARNsi de controlo (Figura 5A, 5B). Por outro lado, a expressão Endo180 não estava envolvida na proliferação celular e migração de SUIT-2 e células KP-2 (dados não mostrados).

células SUIT-2 e KP-2 (A) foram transfectadas com siEndo180-1 ou siEndo180-2, e knockdown de expressão Endo180 em comparação com células transfectadas com ARNsi de controlo foi confirmada por RT-PCR quantitativo (painel superior) e análise de transferência de western (painel inferior) durante pelo menos 3 dias. (B) Após a indução de EMT com 10 ng /ml de TGF-β1, SUIT-2 e KP-2 As células foram incubadas com OG-gelatina durante 2 h. As percentagens de células OG-gelatina-internalizados foram avaliados por citometria de fluxo. Os gráficos de pontos mostram fluxo representante citometria de dados para SUIT-2 não tratada e as células KP-2 e células transfectadas com controle de siRNA, siEndo180-1 ou siEndo180-2 (painéis superiores). As pontuações de colagénio internalização representam as proporções relativas de células-colagénio internalizado entre as células transfectadas com ARNsi de controlo, siEndo180-1 siEndo180-2 ou para aqueles em células não tratadas. As habilidades de colágeno internalização aprimorados no terno-2 e células KP-2 após o tratamento TGF-β são drasticamente reduzidos em knockdown de expressão Endo180 (painel inferior). Cada amostra foi analisada em triplicado, e as comparações entre as células TGF-p1-tratada transfectadas com ARNsi de controlo e outras células foram realizadas usando Student

t

-test. *

P Art 0,01; **

P

. 0,001

SUIT-2 e células KP-2 (4 × 10

4 células /poço) seccionado com siRNAs foram suspensas em 50 ug de 3D tipo I matriz de colagénio, e semearam-se nas câmaras superiores com ou sem TGF-β1. Após a formação do gel por incubação a 37 ° C durante 30 min, as câmaras superiores foram colocadas nos poços de uma placa de cultura de 24 poços contendo 750 ul de 10% de FBS /DMEM. As células que invadiram para a superfície inferior de cada membrana câmara superior através da matriz de colagénio que foram fixadas, coradas com hematoxilina e eosina, e contadas. (A) fotomicrografias representativas de invadir SUIT-2 e KP-2 transfectadas com controle de siRNA, siEndo180-1 ou siEndo180-2. As barras de escala, de 100? M. ampliação original, × 200. (B) As capacidades invasivas de SUIT-2 e células KP-2 são aumentados por indução EMT, mas atenuado por knockdown de expressão Endo180. Cada amostra foi analisada em triplicado, e as comparações entre dois grupos foram realizadas usando Estudante de

t

-teste. *

P Art 0,05; **

P Art 0,01; ***

P Art 0,001. escores de internalização (C) de colágeno no terno-2 e células KP-2 após co-cultura com PSCs para 72 h. As habilidades de colágeno internalização são ligeiramente reforçada em células SUIT-2 e KP-2 por meio de interações câncer estroma. Os experimentos foram realizados em triplicado, e as comparações entre os dados foram realizados utilizando Estudante de

t

-teste. *

P Art 0,05; **

P

. 0,01

PSCs melhorar a internalização de colágeno pelas células de câncer pancreático

Finalmente, investigamos se PSCs teve um impacto sobre a internalização de colágeno por células de cancro do pâncreas, uma vez que PSCs são conhecidos para promover a progressão e EMT de câncer pancreático através de interações câncer estroma [18], [19]. As habilidades de colágeno internalização de SUIT-2 e células KP-2 co-cultivadas com PSCs foram ligeiramente mais forte em comparação com os das células cancerosas monocultured (

P Art 0,05 e

P Art 0,01, respectivamente; Figura 5C). Estes resultados sugerem que as interações câncer estroma também promover a absorção de colágeno pelas células de câncer pancreático.

Discussão

A invasão de células cancerosas, um passo crítico na progressão do cancro, consiste de degradação ECM e subsequente migração de células cancerosas para recém-formados espaços extracelulares. MMPs têm sido consideradas como as principais proteases capazes de degradar vários componentes da matriz extracelular para auxiliar a progressão do tumor, e são considerados como alvos promissores para a terapia do cancro [20], [21]. No entanto, a maioria dos ensaios clínicos de inibidores de MMPs apresentaram resultados decepcionantes com sucesso limitado [22], [23]. Neste estudo, demonstrámos que não apenas a degradação do ECM extracelular, mas também a absorção intracelular de componentes da matriz extracelular pode estar envolvido na invasão celular. Um sistema de proteólise envolvendo degradação de colagénios internalizadas por catepsinas de cisteína lisossómica também tem sido observada em várias malignidades e foi relatado para ser ligada com a invasão tumoral e metástase [24], [25], [26]. Quintanilla-Dieck et ai. [27] demonstraram que a catepsina K no melanoma regula invasão por mediar a degradação intracelular dos componentes da matriz extracelular. análises de imuno-histoquímica de tecidos com cancro pancreático, revelou que as expressões de catepsina B e catepsina L são indicadores de um prognóstico pobre [28]. Estas linhas de evidência sugerem que pode para invasão celular, que é necessário para criar um espaço para migrar para dentro por internalização e degradação componentes ECM intracelularmente para além da sua degradação pericelular. O sistema de apuramento de componentes ECM exibidas por células cancerosas é potencialmente um novo mecanismo para a invasão no câncer de pâncreas.

EMT é considerado um passo crucial para a progressão do câncer, apesar de sua importância e relevância permaneceram um assunto de debate [15]. A perda de adesão célula-célula, alterações na forma da célula e aumentando a vantagem da motilidade à invasão das células cancerígenas através da membrana basal para o tecido estromal [15], [29]. células induzida por EMT são tipicamente vistos na frente invasiva de tumores primários, e desenvolver em etapas posteriores da migração profunda para a ECM, intravasation, transporte, através da difusão e formação de micrometástases [30]. No cancro colorectal, os pequenos agregados de células de tumor que se estendem a partir da massa do tumor para dentro do estroma adjacentes têm sido mostrados como evidência morfológica de EMT nas frentes invasivos de cancro humano [31]. Rhim et ai. [32] mostraram que as células epiteliais malignos marcados invadido no estroma via EMT e misturados com células estromais usando um modelo genético do rato com câncer de pâncreas espontâneo. Descobrimos que as células cancerosas pancreáticas induzida por EMT pode promover a sua capacidade invasiva, não só aumentando a mobilidade, mas também melhorar o colágeno internalização. O colagénio internalização pode ser um dos factores que contribuem para a progressão do cancro fornecidas por EMT, e estas populações de células capazes de captação de colagénio pode ser principais células para a invasão. Em fibroblastos, α

2β

1-integrina é considerado importante para as interacções celulares com colágeno e tem sido proposto para desempenhar um papel no processo de internalização [33]. No entanto, em nosso estudo, α

2β expressão

1-integrina não estava envolvido nos fenótipos celulares de linhas celulares de cancro do pâncreas e não foi aumentada em células SUIT-2 e KP-2 induzidas por EMT. De acordo com experiências que utilizam um anticorpo anti-β

1-integrina e fibroblastos Endo180 deficientes em [8], a adesão mediada por Endo180 de fibroblastos em matrizes de colagénio é um processo de β

1-integrina-independente. Tomados em conjunto, invasão celular reforçada por EMT poderia ser atribuída a Endo180 sozinho e não para a

2β

1-integrina.

A desmoplasia no câncer de pâncreas se manifesta como bandas de estroma fibroso que cercam as células cancerosas, resultando num aumento da colagénios fibrilares. Este estroma fibroso é predominantemente composta de colágeno tipo I, que foi relatado para promover a proliferação, migração e chemoresistance em células de câncer de pâncreas [2], [34]. Por outro lado, os ratinhos tumorais propensa com fibroblastos Endo180 deficientes mostraram um aumento da acumulação de colagénio dentro dos tumores [35], e ratinhos implantados com células de cancro da mama que expressam um mutante defeituoso Endo180 internalização tinha aumentado fibrose intratumoral [14]. Estes resultados foram correlacionados com uma diminuição na internalização de colagénio e colagénio volume reduzido, o que resultou no crescimento do tumor restrito. Em nosso estudo, PSCs teve uma forte capacidade para a internalização de colágeno e células de câncer pancreático Endo180-suficientes mostrou invasão mais forte do que as células Endo180 deficientes. Portanto, o volume de ECM mediada por Endo180 pode ser crucial para a expansão do tumor e progressão do câncer.

Em conclusão, não só mesenquimais PSCs, mas também as células de câncer de pâncreas tem a capacidade de internalizar colágeno. Colágeno internalização pelas células cancerosas foi reforçada em associação com EMT. Knockdown do receptor de captação de colágeno Endo180 revogada colágeno internalização por células cancerosas e reduziu as suas capacidades invasivas. Este mecanismo invasivo anteriormente unappreciated de células de câncer de pâncreas precisa ser melhor esclarecida para identificar novos alvos terapêuticos para o cancro pancreático.

Materiais e Métodos

Células e condições de cultura

A seguir foram utilizados 10 linhas celulares de cancro do pâncreas: AsPC-1, KP-2, Panc-1, SUIT-2, (Dr. H. Iguchi, National cancer Center Shikoku, Matsuyama, Japão) BxPC-3, MIA PaCa-2 (japonês Cancro do Banco de Recursos), CAPAN-1, CFPAC-1, Hs766T e SW1990 (American Type Culture Collection). Unidades humanas foram isoladas a partir de amostras cirúrgicas frescas de cancro pancreático utilizando o método de crescimento tal como descrito anteriormente [36], [37]. As culturas primárias de unidades humanas derivadas de quatro pacientes com câncer de pâncreas invasivas foram estabelecidos em nosso laboratório com consentimento informado por escrito. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade Kyushu o e conduzida de acordo com as Diretrizes Éticas para Genoma Humano /Gene Research promulgada pelo governo japonês e da Declaração de Helsinki. A identidade das unidades de atendimento foi confirmada por imunofluorescência para α-SMA (taxa positiva: quase 100%) e vimentina (taxa positiva: quase 100%) ea morfologia (células estreladas-like ou fusiforme) [17]. Todas as células foram mantidas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Sigma) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS), estreptomicina (100 ug /ml) e penicilina (100 ug /ml) a 37 ° C numa atmosfera humidificada contendo 10% de CO

2.

colagénio ensaio internalização

As células foram semeadas em placas de 90 mm a uma densidade de 1 x 10

5 células /prato e incubou-se em 1% FBS /DMEM com ou sem 10 ng /TGF-β1 humano recombinante mL (R D Systems) durante 72 h. Em seguida, as células foram incubadas com 20 ug /ml de gelatina-OG em 1% de FBS /DMEM durante 2 h a 37 ° C. Para a têmpera de extracelular não-internalizado OG-gelatina, as células foram incubadas com 0,4% de azul de tripano (Sigma) em solução salina durante 5 minutos. Após três lavagens com PBS frio, as células foram descoladas por tripsinização, e submeteu-se a citometria de fluxo para determinar a proporção de células que tinham incorporado o colagénio. Como um controlo, 20 ug /ml de f luoresceina-BSA (Molecular Probes) foi avaliada utilizando o mesmo protocolo. Na internalização de colágeno análises para células cancerosas transfectadas com siRNAs, SUIT-2 e células KP-2 foram transfectadas com controle de siRNA, siEndo180-1 ou siEndo180-2, semeados em placas de 90 mm em 4 × 10

5 células /prato e tratadas com 10 ng de TGF-β1 /ml durante 48 h para induzir a EMT. As células foram então incubadas com 20 ug /ml OG-gelatina ou f luoresceina-BSA em 1% de FBS /DMEM durante 2 h a 37 ° C, e não interiorizado OG-gelatina ou f luoresceina-BSA foi extinta por incubação com 0,4% de tripano azul. Após lavagem com PBS frio, as células foram colhidas e analisadas por citometria de fluxo. A pontuação de colagénio internalização foi calculada como a proporção relativa de células-colagénio internalizado entre as células transfectadas com ARNsi de controlo, siEndo180-1 siEndo180-2 ou para aqueles em células não tratadas.

laser de varrimento de microscopia confocal para a coloração de imunofluorescência

As células foram colocadas em 35 mm pratos com fundo de vidro (Matsunami) a uma densidade de 2 × 10

4 células /prato e incubou-se em 1% de FBS /DMEM com ou sem 10 ng /ml de TGF-β1 durante 48 h. Em seguida, as células foram incubadas com 20 ug /ml OG-gelatina ou f luoresceina-BSA em 1% de FBS /DMEM durante 2 h a 37 ° C, seguido pela fixação com paraformaldeído a 4% durante 10 min à temperatura ambiente após têmpera de fluoresceína extracelular com 0,4% de azul de tripano. células SUIT-2 e KP-2 foram depois incubadas com Alexa Fluor faloidina 647-conjugado (Molecular Probes) para corar F-actina para a visualização da célula descreve de acordo com as instruções do fabricante, enquanto unidades foram incubadas com um anticorpo de coelho anti-α- anticorpo SMA (Epitomics; 1:100 diluição) durante 2 h, seguido de incubação com IgG Alexa Fluor 647 anti-coelho conjugado (Molecular Probes) durante 1 h. ADN nuclear foi contrastado com 0,05 ug /ml de 4 ‘, 6-diamidino-2-fenilindol. Um laser de varredura confocal microscópio de fluorescência (A1R; Nikon) foi utilizado para imunofluorescência de microfotografias. As imagens foram geridos utilizando o software NIS Elements (Nikon).

Isolamento de ARN

O ARN total foi extraído a partir de células cultivadas usando um Kit de Isolamento de RNA High Pure (Roche Diagnostics) com ADNase I (Roche Diagnostics) de tratamento. O RNA extraído foi quantificado pela absorvência a 260 nm, e a sua pureza foi avaliada a partir da razão de absorvância 260/280 com um espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies).

cadeia quantitativa de transcrição reversa-polimerase reacção (RT-PCR)

quantitativa de RT-PCR foi realizada utilizando um Kit de QuantiTect SYBR Green transcrição reversa PCR (Qiagen) e um sistema de detecção por PCR em Tempo real Chromo4 (Bio-Rad Laboratories). Nós projetamos primers específicos para E-caderina e vimentina usando Primer 3 software e BLAST realizada pesquisa para garantir as especificidades de primers. Primers para Endo180, β1-integrina, α2-integrina, β-actina e 18S rRNA foram adquiridos a partir de Takara Bio Inc. As sequências dos iniciadores utilizados no presente estudo são mostrados na Tabela 1. Cada mistura de reacção foi incubada primeiro a 50 ° C C durante 30 min para permitir a transcrição reversa, em que a primeira cadeia de ADNc foi sintetizada por priming o ARN total com um iniciador específico do gene. A PCR foi iniciada por incubação a 95 ° C durante 15 minutos para activar a polimerase, seguido por 40 ciclos de 94 ° C durante 15 s, 55 ° C durante 30 s e 72 ° C durante 30 s (para E-caderina e vimentina) ou 95 ° C durante 5 s, 60 ° C durante 20 s e 72 ° C durante 30 s (para Endo180, β1-integrina, α2-integrina, β-actina e rRNA 18S). Os níveis de expressão dos genes foram calculadas com base nas curvas padrão construída com ARN total a partir de células SUIT-2. Os níveis de expressão foram normalizados pelo β-actina ou expressão 18S rRNA e expressa como a razão entre a expressão do gene alvo para a de β-actina ou de rRNA 18S. Todas as amostras foram realizadas em triplicado. Nenhum produto de PCR detectáveis ​​foram amplificados sem transcrição reversa antes. A precisão e integridade dos produtos de PCR foram confirmados com um Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies Inc.).

A citometria de fluxo

As células cultivadas foram colhidas por exposição a tripsina /EDTA para 5 min a 37 ° C, e lavou-se em 10% de FBS /DMEM. As células individuais obtidos foram suspensos em solução gelada a 1% de FBS /PBS e analisadas utilizando um citómetro de fluxo (EC800; SONY) equipado com um laser que forneceu um comprimento de onda de excitação de 488 nm. Eclipse software Análise (SONY) foi utilizado para quantificar os sinais fluorescentes e definir os parâmetros eletrônicos acopladas ao lógicos.

ensaio de invasão em um colágeno 3D Eu matriz e migração ensaio

A invasão de câncer pancreático células foi avaliada com base no número de células invasoras através transpo� câmaras (BD Biosciences) sob condições de cultura 3D em um colagénio I matriz.