Abstract

Fundo

O campo de rápido crescimento da terapia tumor alvejado frequentemente utiliza um anticorpo, por vezes marcado com um material de ablação tumoral tais como radioisótopos, dirigido contra uma molécula específica.

Metodologia /Principais achados

Este relatório descreve a descoberta de nove novos decap�tidos que podem ser marcados radioactivamente, se ligam a, e entregar

32 P a células de cancro do cólon. Os decapéptidos variar um do outro por um a três aminoácidos e demonstrar capacidades de ligação vastamente diferentes. O decapéptido mais avidamente ligação pode entregar permanentemente níveis muito elevados de radioisótopo para as linhas de células de adenocarcinoma com uma eficiência de 35 a 150 vezes maior do que para uma variedade de outros tipos de células, incluindo linhas celulares derivadas de outros tipos de cancro, ou a partir de tecido normal.

Conclusões /Significado

Esta abordagem experimental representa um novo exemplo de uma estratégia, denominada terapia de ligação de péptidos, para o tratamento potencial de colorectal e outros adenocarcinomas

Citation:. Abraham JM, Sato M, Cheng Y, B Paun, Kan t, Olaru A, et al. (2007) Novos decap�tidos que ligam avidamente and Deliver radioisótopos a células de cancro do cólon. PLoS ONE 2 (10): e964. doi: 10.1371 /journal.pone.0000964

Editor do Academic: Mikhail Blagosklonny, Instituto de Pesquisa Ordway, Estados Unidos da América

Recebido: 11 de julho de 2007; Aceito: 12 de setembro de 2007; Publicação: 03 de outubro de 2007

Direitos de autor: © 2007 Abraham et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações 2RO1CA095323-14, 2RO1CA077057-09, 1R01CA001808-05 e 7R21 /R33CA106763 do Instituto Nacional do Câncer

competir interesses:.. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

introdução

Doença e morte devido à colorretal e câncer de esôfago constitui um desafio de saúde monumental nos Estados Unidos e em todo o mundo [1], [2]. Os tratamentos actuais incluem radioterapia, a cirurgia, e quimioterapia. Há um número de imunoterapias aprovados para utilização no tratamento de vários tipos de cancros (

por exemplo, Herceptin

, Rituxin, Avastin, e outros). [3] – [6]. Todas estas imunoterapias utilizar um anticorpo monoclonal dirigido contra uma molécula celular específica [7], [8]. acção destrutiva contra células tumorais é pensado para envolver ADCC (citotoxicidade celular dependente de anticorpo), a lise celular através da via do complemento, ou a indução da apoptose [9], [10]. Avastin é um anticorpo monoclonal dirigido contra o VEGF (factor de crescimento endotelial vascular) e está aprovada para o tratamento de cancro colo-rectal [11] – [13].

Além disso, linfoma não-Hodgkin (NHL) é actualmente tratada com dois regimes radioimmunotherapeutic aprovados: Bexxar e Zevalin. Ambos utilizam um anticorpo monoclonal dirigido contra o CD20 marcador de células B e pode entregar ou

131I (Bexxar) ou

90Y (Zevalin) isótopos para direcionar células de linfoma [14], [15]. Os beta-partículas (elétrons) gerados por estes isótopos pode penetrar profundamente células e danificam o DNA, conduzindo à morte celular. No entanto, não existem actualmente radioimmunotherapies aprovados para o tratamento de pacientes com câncer colorretal.

Os decap�tidos aqui descritos ligam-se e transferência de isótopos (

32 P) para linhas celulares derivadas de vários carcinomas colo-rectais. Sob condições experimentais idênticas, muito pouco (

viz.,

Menos de 1% de taxa de linhas celulares de cancro do cólon ‘) dos mais eficientes decapéptidos

32P-etiquetados ligam-se a linhas de células estabelecidas a partir de uma variedade de outros tipos de câncer ou de cólon normal, rim, ou células do esôfago.

resultados

Nós identificamos nove decap�tidos, diferindo um do outro por apenas alguns aminoácidos, que, quando marcada com

32P pode ligar-se a uma série de linhas celulares de carcinoma colorrectal. Todos os decapéptidos contêm uma proteína cinase A sequência de substrato e são designados como (Adjuvante de modificação) MAS. A Figura 1 é uma representação esquemática da produção de péptidos

32P-marcado e o design experimental de ensaios para medir a ligação de péptidos a linhas celulares.

Um sistema de expressão bacteriana recombinante produzido vários glutationa-S- proteínas de fusão transferase decapéptido que foram ligados a glutationa e marcadas com

32P utilizando proteína quinase A. após lavagem, os decapéptidos marcadas foram recuperados após a digestão da trombina e incubadas a várias vezes com várias linhas celulares diferentes.

Figura 2 apresenta o número de

32P contagens por minuto (cpm) restante ligado a dezoito diferentes linhas celulares e poços em branco depois de uma incubação de duas horas com MA5, o decapéptido de ligação mais eficiente (ver abaixo). A linha celular de adenocarcinoma do cólon de Caco-2 manteve o maior número de contagens radioactivas depois de uma incubação de duas horas e lavagens subsequentes com meio completo, o valor médio de cavidades em triplicado igualando 298.639 cpm por 10000 células. células de adenocarcinoma do cólon HCT116 retido um valor médio de 131.998 cpm por 10.000 células. poços em branco e linhas celulares não obrigatórios apresentaram valores médios inferiores a 550 cpm; barras representando estes valores não são visíveis à escala utilizada na Figura 2. Por exemplo, HeLa S3 células de cancro do colo do útero mantido apenas uma média de 534 cpm por 10000, as células de fibrossarcoma HT1080 mantidas 367 cpm, e a linha celular de rim embrionário humano 429 293H retida cpm por 10000 células.

O

32P rotulados decapéptido MA5 foi incubada durante duas horas com 10.000 células, lavou-se três vezes, e as contagens radioactivas das células foi determinada por contagem de cintilação. Sete linhas celulares demonstrou ávido ligação de MA5 e são mostrados como gráficos de barras da média e um desvio padrão em poços em triplicado. As linhas celulares onze restantes, juntamente com um poço em branco em média apenas 365 cpm. Estes valores são tão pequenas que não sejam visíveis à escala utilizada na presente figura. Mais informações sobre as linhas de células individuais é fornecido nas informações suplementares.

Sete das linhas celulares dezoito demonstrou muito forte retenção de radioactividade quando incubadas com MA5 (Modificado peptídeo radioactivo adjuvante) com cinco deles sendo linhas celulares de adenocarcinoma do cólon (Caco-2, HCT15, HCT116, LoVo, HT29), sendo um deles uma linha de células de adenocarcinoma esofágico (SEG1), e sendo uma linha celular de um esófago de Barrett (QHTRT). Em contraste, os onze linhas celulares não ligantes eram linhas celulares principalmente escamosas derivadas de carcinomas do colo do útero (HeLa S3), do cólon (RKO), pulmão (1271, A549), o esófago (KYSE-70), um fibrosacroma (HT1080) ou cultura de células de rim normal (293H), cólon (1459), e esôfago (HEEpiC). As linhas celulares não ligantes incluídos T84, derivada de um adenocarcinoma metastático do cólon de pulmão, e SK-BR-3, isolado a partir de um adenocarcinoma da mama. A proporção de cpm retidos por células Caco-2 (298,639) para a média dos onze linhas celulares não ligantes (365) foi 818:1. células Caco-2 retida cerca de 18% do total de contagens radioactivas presentes na incubação bem depois de duas horas de incubação.

nove variantes MA foram ensaiadas quanto à aderência a células Caco-2 após a incubação de duas horas. A composição de aminoácido e nível de ligação relativa de cada variante de MA é apresentado na Figura 3A. Alteração de apenas um a três aminoácidos dentro do peptídeo resultou em diferenças de retenção tão grande quanto 70 vezes,

por exemplo,

na variante MA2

vs.

Variante MA5.

(a) Nove

32P-marcado diferentes decapéptidos, variando de um outro apenas por um a três aminoácidos, foram incubadas com Caco 2-células durante duas horas, as células foram lavadas três vezes, e as contagens restante ligado às células está mostrada como uma percentagem da quantidade total de contagens para cada decapéptido utilizado. As substituições de aminoácidos para cada variante (em relação aos MA1) estão sublinhadas e em negrito. (B) As variantes, MA1, ma4, e MA5 foram incubadas com células Caco-2 para a intervalos que variam de cinco minutos a duas horas, lavadas, as células aderentes dissolvidas em tampão de carregamento de gel e uma alíquota de execução em um 10% -20% gradiente em gel de poliacrilamida-SDS. As três pistas marcadas “24h” (faixas 5, 10 e 15) foram incubadas com os respectivos decapéptidos marcados (MA1, ma4, MA5) durante duas horas, lavadas, e as células foram incubadas com meio completo durante 24 horas. As células foram tratadas como descrito para as outras faixas desta figura.

Para investigar a rapidez

32P isótopo poderia ser transferido a partir das variantes peptídicas e incorporado em proteínas celulares, os três mais avidamente vinculativo MAS (ver Figura 3A) foram adicionadas a cavidades replicadas contendo células Caco-2, então lavados a intervalos variáveis ​​de tempo e as células e o sobrenadante do doseamento. Tal como mostrado na Figura 3B, as percentagens substanciais destes

32P-marcado decapéptidos variantes ligadas a células dentro de apenas alguns minutos, com grandes quantidades de proteínas celulares marcados radioactivamente que aparecem em duas horas após a exposição das células aos péptidos marcados. células Notavelmente, uma experiência paralela em que as condições descritas na Figura 3 foram duplicadas, mas lavadas foram incubadas

durante a noite

em meio completo (dados não mostrados), ainda revelou níveis semelhantes de libertação

32P-decapéptido e retenção para todos os nove áreas metropolitanas, como descrito para a Figura 2. MA5

O péptido de ligação, lavagem e ensaio de experimento descrito para a Figura 2 foi então repetido em sete linhas de células de maior avidez de ligação utilizando MA5, excepto que após três lavagens de forma, 200 ul de meio completo foi adicionado a cada poço e as células foram incubadas

durante a noite

a 37 ° C. A Figura 4A mostra a cpm retidos por células ou libertada para o meio após esta incubação durante a noite. Aproximadamente 88% dos Ma5 contagens radioactivas inicialmente retidas pelas linhas celulares de cancro de cólon foi lançado para o meio, enquanto que cerca de 12% do inicialmente retido contagens radioactivas foram retidos por células. As duas linhas de células esofágicas que inicialmente retidos grandes quantidades de contagens radioactivas, QH-TRT e SEG1, retido 39% e 37% das suas contagens original, respectivamente, após incubação durante a noite. células Caco-2 manteve o maior número de contagens, uma média de 58.305 cpm em poços em triplicado contendo 10.000 células cada um. Este valor representa cerca de 5,8 cpm, ou 348 contagens por hora, por célula (

ou seja,

quando extrapolada para um potencial período de exposição de 2 semanas, o equivalente a mais de 87.000 contagens por célula).

(A) O decapeptídeo

32P-marcado MA5 foi incubada durante duas horas com sete linhas de células diferentes, as células foram lavadas, e foi adicionado meio completo. Após uma incubação de 24 horas, o número de contagens por minuto libertada para o meio (R), bem como o número de contagens permanecendo ligado às células (B) foram determinados. Cada barra mostra a média e um desvio padrão de triplicados poços. (B) Curso de tempo para a liberação e retenção do decapéptido

32 P-rotulados MA5. MA5 foi incubada durante duas horas com células Caco-2, as células foram lavadas, e os cpm libertados (linha a tracejado), bem como remanescente (linha a cheio) ligada às células determinados para intervalos de tempo de pós-lavagem. Cada ponto mostra a média mais /menos um desvio padrão de determinações em triplicado. C) conteúdos dos poços radioactivos descritos como ligado (linha a cheio) na Figura 4B foram corridos num gel de poliacrilamida-SDS a 16,5% e expostos a película. Imediatamente após a lavagem (

i.,

Às 0 horas), a maioria das contagens foram visualizados como

32P-péptido. Durante os próximos 48 horas, o péptido contagens grandemente diminuída, com a maioria da radioactividade ligada incorporada em proteínas celulares. (D) se aliquotas de meio contendo a (linha a tracejado) libertado

32P-péptido MA5 foram testados em intervalos de tempo após a lavagem, tal como descrito na Figura 4B. Com o passar do tempo, mais do

32 P-peptídeo foi lançado, atingindo um patamar de 24 horas após a lavagem.

Figura 4B mostra a evolução no tempo da libertação de MA5 do Caco-2 a linha celular de adenocarcinoma ao longo de um período de tempo de 48 horas. A maioria do total de contagens libertadas durante o período de tempo de 48 horas estão libertados por nove horas de incubação. As Figuras 4C e 4D consistem de dois autorradiogramas mostrando as localizações das moléculas radioactivas descritos na Figura 4B em géis de poliacrilamida-SDS. Os tamanhos das proteínas celulares radioactivos nas células são mostradas na Figura 4C;

32 P-rotulados MA5 libertada para o meio é mostrado na Figura 4D. Há aparente acordo sobre os níveis globais de radioatividade distribuição e na comparação Figura 4B e Figuras 4C e 4D. Assim como duas horas após a introdução do péptido radioactivo, uma porção substancial do isótopo parece ter sido transferido para as proteínas de maior peso molecular.

Discussão

Este relatório descreve a descoberta de decapéptidos que pode ser marcado com uma elevada energia (1,7 MeV) emissor beta (

32P) e podem ligar-se avidamente a várias linhas de células de adenocarcinoma diferentes, de forma eficiente entrega deste material de potencial de ablação do tumor para as células. Os decap�tidos, denominado MA para Adjuvante de modificação, são substratos da proteína quinase. Anteriormente, nunca tinha sido mostrado ou suspeita que este substrato, quando marcado com um material de ablação do tumor, tais como o

32P, pode ligar-se a transferir o radioisótopo e a uma linha de células após uma a duas horas de incubação. Além disso, mostrámos pela primeira vez que a transferência de isótopo a partir destes decapéptidos é restrito para tipos de células derivadas de cólon primário e adenocarcinomas esofágicas. Por exemplo, a exposição de certas linhas de células de cancro do cólon in

(por exemplo

. Caco-2) para o péptido marcado mais avidamente ligação, MA5, por um período de duas horas resultou na transferência de uma dose radioactiva de mais de 29 contagens por minuto por celular após uma incubação de duas horas, lavar, e determinação imediata do radioactividade retida.

a incubação do decapéptido

32P-marcado com certas linhas celulares resultou em grandes quantidades de péptido a ser retidos depois uma incubação de duas horas, mas uma proporção substancial deste péptido ligado foi libertado depois de uma incubação de um dia para o outro. Por exemplo, após a incubação da MA5 variante marcada com células Caco2 durante duas horas, três passos de lavagem e incubação durante a noite, em meio de 88% do originalmente retida

32P isótopo foi libertado. No entanto, os 12% que foi retido por células ainda representada 5,8 cpm por célula, extrapolando-se para mais de 8300 contagens por célula por dia. Além disso, a radioactividade que ainda estava retido por células após incubação durante a noite meio foi permanentemente incorporados numa variedade de proteínas celulares, como demonstrado por electroforese em gel de poliacrilamida dos lisados ​​celulares pós-exposição

Entre 18 linhas de células ensaiadas quanto à sua capacidade para ligar os decap�tidos, sete demonstrado muito elevada retenção de isótopos depois de duas horas de incubação. Embora todos os sete destas linhas libertado a partir de 63% a 88% de radioactividade após esta uma incubação de um dia para o outro, a quantidade de isótopo que foi mantida durante a noite foi ainda substancial. Destas sete linhas celulares, cinco foram derivadas de adenocarcinomas colorrectais, um a partir de um adenocarcinoma do esófago, e uma amostra a partir de um metaplasia de Barrett. As 11 linhas de células que não se ligam a decapéptido marcado radioactivamente MA5 foram derivados a partir de uma variedade de origens de tecidos. Estes carcinomas de células escamosas do colo do útero incluídas, do pulmão, da mama, e um fibrossarcoma, assim como rim normal, cólon, e os tecidos esofágicos.

A maioria dos regimes imunoterapêuticos aprovados para o cancro envolve um anticorpo dirigido contra um específico molécula celular [16]. Estes agentes podem funcionar por meio de ligação à superfície da célula e pode utilizar ADCC, activação do complemento, ou apoptose celular. Os anticorpos também podem ser acoplados a um agente de ablação do tumor, tais como toxinas ou radioisótopos [17] – [21]. A adição de isótopo a péptidos, e a sua utilização, tanto para fins de diagnóstico e terapêuticos, é uma área activa da investigação biomédica [22] – [25]. Nosso trabalho utiliza substratos de uma proteína quinase marcadas com

isótopo 32P. A energia de alta emissores beta resultados radioisótopos em um intervalo de comprimento da trajectória de electrões de até 5 mm, que permitem a penetração substancial de tumores sólidos. Devido a um efeito previsto “bystander”, uma partícula beta vai penetrar centenas ou milhares de células dentro do tumor, mesmo aqueles que não estão directamente a ligação do decapéptido. Além disso, uma vez que os pesos moleculares destas proteínas decapéptidos minúsculas são muito mais baixos do que o limite de exclusão de peso molecular dos rins de filtragem, estes péptidos devem ser rapidamente eliminada através da urina, levando a toxicidade sistémica reduzida. Assim, deverá ser viável tanto para uma dose radioactiva e radioactividade não ligada para ser eliminado facilmente e num período relativamente curto de tempo. Prevemos que os substratos adicionais enzima conhecida pode, eventualmente, ser identificados como potenciais veículos para a administração específica de agentes anti-tumorais para células cancerosas e que o cancro do potencial de regimes terapêuticos que utilizam este péptido ou outras substâncias semelhantes pode ser a mais nova estratégia para a terapia de ligação ao péptido.

Materiais e Métodos

Produção do

32 P-rotulados: oligômeros de DNA diferentes foram clonados em pGEX-4T-1 (GE Healthcare), que deu vários decap�tidos após clivagem de trombina designado MA1 através MA9 (adjuvante de modificação). As sequências de proteínas são: MA1, GSRRASVGSA; MA2, GSRGASVGGA; MA3, GSRRGSVGSA; MA4, GSRRGSVASA; MA5, GSRRASVASA; MA6, GSRRASVGSG; MA7, GSRGGSVGSA; MA8, GSRGGSVASA; MA9, GSRGGSVGSG. bactérias DH5-alfa contendo estes clones foram cultivados durante a noite em meio LB (contendo 100? g /ml de ampicilina), diluídos a 1/10 em meio LB-Amp e crescida a 37 ° C durante duas horas. Adicionou-se IPTG a 1 mM e a cultura crescida a 37 ° C durante cinco horas. Dez ml de cada cultura foram centrifugadas e o sedimento celular ressuspenso em 1 X TBS contendo 100 ug /ml de lisozima. Depois de dois ciclos de congelação-descongelação, o lisado foi centrifugado e o sobrenadante foi misturado com 100 ul de Sepharose-glutationa durante duas horas à RT. Cada sedimento foi lavado três vezes com 1 X TBS, e as proteínas de fusão recombinantes ligadas foram marcadas com

32P usando cinase de proteína A e

32P-γ-ATP de acordo com as instruções do fabricante (Sigma, St. Louis, MO .). . O sedimento foi lavado quatro vezes com 1 x PBS e decapéptido marcado foi clivado e libertado para o sobrenadante com trombina (GE Healthcare)

Ensaio da ligação de decapéptidos

32P-rotulados para linhas celulares: As linhas celulares foram crescidas em meio completo contendo 10% de soro fetal de bovino (inactivado pelo calor). Em cada poço de uma placa de 96 poços, 10.000 células de várias linhas de células foram cultivadas durante a noite em meio completo. Dez ul da-péptido marcado em 1 X PBS e 90 ul de meio completo foram adicionadas a cada poço e incubou-se a 37 ° C em vários tempos de até duas horas. O péptido-meio foi removido e uma ul adicionados a 100 ul de tampão de carga do gel e contadas por contagem de cintilação para o controlo sonda ou corrido num gel de poliacrilamida-SDS (BioRad) .As células aderentes foram brevemente e suavemente lavadas com meio completo três vezes e alguns poços foram ensaiados imediatamente por adição de 100 ul de tampão de carga do gel a cada poço e corrido num gel ou contados num contador de cintilação. Outros poços tinham 100 ul de meio completo adicionado e incubado durante um período adicional de tempo. As amostras foram seja contado num contador de cintilação líquida ou correr em géis de poliacrilamida-SDS, expostos a filme de raios-x, e o filme desenvolvido.

Reconhecimentos

Agradecemos ao Dr. Yutaka Shimada (Hyogo college of Medicine, Japão) pelo dom da linha de células KYSE-70.