Abstract

Fundo

A falta de biomarcadores preditivos confiáveis ​​é uma pedra de tropeço no tratamento do câncer de próstata (CAP). antígeno específico da próstata (PSA) amplamente utilizado em clínicas tem várias advertências como um biomarcador PAC. pacientes com PAC afro-americanos têm pior prognóstico do que os brancos, e, nomeadamente, o soro-PSA não funciona bem neste grupo. Além disso, alguns homens com baixos níveis séricos-PSA passar desapercebido para o tampão até que eles desenvolvem a doença. Assim, existe uma necessidade de identificar um biomarcador de diagnóstico e preditivo de confiança de PAC. Aqui, mostramos que a proteína de células-tronco BMI1 é secretora e poderiam ser exploradas para o uso de biomarcadores em pacientes com PAC.

Metodologia /Principais Achados

análise

Semi-quantitativa de BMI1 foi realizado em tecidos prostáticos de TRAMP (autóctone rato transgénico modelo), pacientes com PAC humanos e em modelos baseados em células que representam fenótipos normais e diferentes PAC em homens afro-americanos e caucasianos, através do emprego de imuno-histoquímica, immunoblotting e slot-blotting. A análise quantitativa de BMI1 e PSA foram realizadas em cultura de sangue e dos meios das células transfectadas com ARNsi e não-transfectadas, utilizando ELISA. BMI1 proteína é (i) secretado por células PAC, (ii) aumento na região apical das células epiteliais e do estroma região em tumores prostáticos, e (iii) detectada no sangue humano. BMI1 é detectável no sangue de pacientes com PAC em uma ordem crescente de estágio do tumor, exibem uma correlação positiva com soro-PSA e mais importante, é detectável em pacientes que apresentam baixos níveis séricos-PSA. O significado clínico BMI1 como um biomarcador pode ser determinado a partir da observação de que PAC células secretam esta proteína em níveis mais elevados do que as células representante da hiperplasia prostática benigna (BPH).

Conclusões /Significado

BMI1 poderia ser desenvolvido como um bio-marcador dupla (soro e biópsia) para o diagnóstico e prognóstico da PAC em caucasianos e homens afro-americanos. Embora convincente esses dados merecer investigação mais profunda em uma coorte de pacientes afro-americanos

Citation:. Siddique HR, PArray A, Zhong W, Karnes RJ, Bergstralh EJ, Koochekpour S, et al. (2013) BMI1, factor de células estaminais Agindo como Novel Serum-biomarcador para caucasianos e cancro da próstata Africano-Americano. PLoS ONE 8 (1): e52993. doi: 10.1371 /journal.pone.0052993

Edição: Natasha Kyprianou, da Universidade de Kentucky College of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 23 de outubro de 2012; Aceito: 27 de novembro de 2012; Publicação: 07 de janeiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Siddique et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi em parte financiado pelo Departamento de Defesa CDMRP conceder W81XWH-08-1-0605 ao autor correspondente. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

de acordo com a American cancer Society, 241.740 serão diagnosticados com cancro da próstata (PAC) e 28,170 pacientes com PAC foram projetados para morrer no ano de 2012 nos EUA sozinho [1]. O resultado insatisfatório de gestão global (estratégias de tratamento e acompanhamento prognóstico) para a doença CaP pode estar associada à falta de um prognóstico de soro-biomarcador confiável. Embora amplamente utilizados, muitos cuidados importantes têm sido relatados em soro-PSA como marcador de prognóstico [2]. Por exemplo, em alguns casos, o tampão, soro de PSA é (a) detectada pouca, se alguma, (b) não tem a sensibilidade adequada, e (c) não discrimina cancros potencialmente significativas de insignificantes [2] – [4]. O PSA não reflectir biologia do cancro e um elevado risco de resultados errados [5] – [6]. Além disso, discrepâncias no PSA como marcador de diagnóstico entre os diferentes grupos raciais, como caucasianos e Africano-Americano ter confundido a gestão deste tipo de câncer [6] – [7]. Portanto, uma grande necessidade persiste para o desenvolvimento de melhores marcadores sorológicos em Cap, que é confiável para prognóstico e diagnóstico em pacientes caucasianos e afro-americanos.

Há cada vez mais evidências de que grupos Polycomb proteínas (PCG) desempenham um papel crucial papel no desenvolvimento do câncer e doenças recorrência [8]. -B-célula específica local de integração de Moloney vírus da leucemia murina 1 (BMI1) é um marcador bem conhecido usado na biologia das células estaminais [8] – [9]. BMI1 que tem um padrão de expressão ubíqua de em quase todos os tecidos é frequentemente sobre-regulada em diversos tipos de cancros humanos [8] – [10]. Nós recentemente revisto significado da BMI1 no surgimento de chemoresistance em vários tipos de cancros, incluindo o PAC [8]. O presente estudo é a primeira evidência clínica mostrando que BMI1 é uma proteína secretora que tem um enorme potencial a ser desenvolvido como um soro-biomarcador para PAC e seu prognóstico da população tanto caucasianos e Africano-Americano. Sugerimos que o soro-BMI1 como um biomarcador seria melhor desempenho do que a PSA. Além disso, BMI1 poderia ser utilizado como um biomarcador dupla no soro, bem como a biópsia.

Materiais e Métodos

tecidos da próstata e de soro a partir de amostras de pacientes com PAC humanos

tecidos prostáticos cirurgicamente colhido de pacientes com PAC humanos e correspondentes blocos de parafina foram adquiridos a partir de tecido humano Cooperativa Rede Divisão do Meio-Oeste, The Ohio State University (Columbus, OH). As amostras de soro de pacientes com PAC humanos foram adquiridos a partir de banco de soro (BioServe, Beltsville, MD). secções embebidas em parafina adicionais de tecidos da próstata humanos de 70 pacientes com adenocarcinoma normal e foram obtidos a partir da ISU Abxis Co. Ltd., (Seul, Coreia do Sul).

Linhas Celulares

As linhas celulares originado de ambas as mans americanos caucasianos e africanos foram usados ​​em nosso estudo. linha de células epiteliais da próstata normal e imortalizado (RWPE1), linhas celulares tampa (LNCaP, C42b, PC3, DU145, VCaP e PCA-2b), miofibroblastos estromais prostáticas (WPMY1), cólon células normais epiteliais (FHC) e linhas celulares de cancro do cólon ( SW480, HCT116 e HT29) e linhas de células de carcinoma pancreático humano e PANC1 AsPC1 foram obtidas de ATCC (Manassas, VA). células epiteliais do ducto pancreático normal, pré-malignas Kras mutante células mutantes Kras malignas E6E7-Kras-st E6E7-Ras e foram obtidos a partir de D. Paul M. Campbell (H. Lee Moffitt Cancer Center, Tampa, FL) [11]. células BPH-1 foram adquiridos a partir de Dr. Simon Hayward (Universidade Vanderbilt, Nashville, TN) que os desenvolvidos como descrito [12]. Estabelecimento e caracterização de células RC77N /E, RC77T /E e E006 foi descrito anteriormente [13] – [14]. As células foram cultivadas em meio adequado suplementado com FBS a 10% (ATCC, Manassas, VA) e 1% de Penicilina-estreptomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA) sob condições de cultura celular padrão de 5% de CO

2 em uma incubadora a 37 ° C.

Seleção celular

(a) células caucasianos: RWPE1 (normal), (hiperplasia não maligno) BPH-1 e, LNCaP, C4-2B, PC-3, DU145 e VCaP representando o câncer de próstata caucasiana. Foram também utilizados WPMYI1 fibroblastos estromais. (B) As células afro-americanos:. RC77N /E (normal), e RC77T /E, PCA-2B, E006 representando o câncer de próstata Africano americano

Antibody, plasmídeos e siRNA

Monoclonal anti- anticorpo BMI1 foi obtido a partir de Millipore (Temecula, CA). pBABE-BMI1 plasmídeo (BMI1-superexpressão) foi uma simpática oferta do Dr. Chi Dang V. (The John Hopkins University, Baltimore, MD). . BMI1-ARNsi foram adquiridos comercialmente da Dharmacon (Lafayette, CO):

A imuno-histoquímica

coloração imuno-histoquímica foi realizada como descrito anteriormente [15] – [16]. Resumidamente, secções de parafina (a ser avaliados para BMI1) foram pré-tratados com tampão citrato (pH 6) durante 10 minutos em um forno de microondas para a recuperação de antigénio. As secções foram incubadas com anticorpo primário (anti-BMI1) a uma diluição de 1:50 durante 12 h a 4 ° C. As lâminas foram então incubadas durante 2 h à temperatura ambiente com anticorpo secundário conjugado com HRP apropriados. As lâminas foram desenvolvidas em 3, 3′-diaminobenzidene (DAB kit, Invitrogen, Carlsbad, CA) e contra-coradas com hematoxilina. As lâminas coradas foram desidratadas e montadas em Permount solução sob lamelas

Análise Western blot

Imunotransferência análise foi realizada como descrito anteriormente [16] -. [17]. Em resumo, os lisados ​​celulares foram preparados em tampão de lise frio [(0,05 mmol /L de Tris-HCl, 0,15 mmol /L de NaCl, 1 mole /L de EGTA, 1 mol /L de EDTA, 20 mmol /L, NaF, 100 mmol /L de Na

3VO4, 0,5% de NP-40, 1% de Triton X-100, 1 mol /L de fluoreto de fenil metilsulfonilo (pH 7,4)] com o cocktail inibidor de protease (Roche, Indianapolis, IN). O ligado foi recolhido e armazenado a -80 ° C. o teor de proteína nos lisados ​​foi medida pelo ensaio de proteína BCA (Pierce, Rockford, IL), de acordo com o protocolo do fornecedor. Para a análise de Western blot, 40 ug de proteína foi resolvido em géis de 10% SDS-PAGE, transferidas para PVDF membranas (Millipore, Bedford, MA) e subsequentemente incubadas em tampão de bloqueio (5% de leite em pó magro /1% de Tween 20; em 20 mmol /L de TBS, pH 7,6). durante 2 horas As membranas foram incubadas com anticorpo primário BMI1, lavada e incubadas com anticorpo secundário conjugado com HRP (Sigma, St Louise, MO). as manchas foram detectadas com quimioluminescência (kit ECL, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). carregamento igual de proteína foi confirmada por fraccionamento dos borrões e re-sondagem com β-actina (Sigma, St. Louis, MO). Foram realizadas medições de densitometria das bandas digitalizados como descrito anteriormente [16].

detecção de proteína em cultura de células media

As células foram deixadas crescer até 80% de confluência em meio completo. Ao nível de 80% confluentes, o meio foi descartado e as células foram lavadas duas vezes com PBS. Após lavagem, as células foram adicionados com meio isento de soro. As células foram cultivadas em meios isentos de soro durante 24 h. Após 24 h, o meio foi recolhido e analisado para a proteína secretora BMI1 usando ensaio de imuno-slot-blot. O ensaio de slot-blot foi realizada conforme o protocolo do fabricante (Whatman, Florham Park, NJ). Resumidamente, o aparelho slot-blot foi montado utilizando papel de filtro Whatman e uma membrana de nitrocelulose pré-humedecido. Em seguida, o aparelho foi ligado a uma bomba de vácuo. Slots foram preenchidos com amostras (media /soro) e, em seguida, puxados por vácuo (slots não utilizados foram preenchidos com PBS). As membranas foram em seguida bloqueadas durante 2 h em tampão de bloqueio (5% de leite em pó magro). As membranas foram incubadas com anticorpo primário BMI1, lavadas e incubadas com anticorpo secundário conjugado com HRP (Sigma, St Louise, MO). As manchas foram detectadas com quimioluminescência (kit ECL, Amersham Biosciences).

A remoção de albumina a partir de amostras de soro

A albumina foi removido a partir de amostras de soro humano, utilizando albumina Removal Kit (Pierce, Rockford, IL ) de acordo com o protocolo do fornecedor. As amostras contendo 1000 ug de proteína total foram carregadas num disco de remoção único, em que cada disco é relatado como tendo uma capacidade de ligação de . 2 mg de albumina

estimativa dos níveis de proteína de PSA por meio de ELISA

Este foi realizada utilizando ELISA humana (Anogen, Ontário, Canadá) conforme o protocolo do fornecedor.

a quantificação de proteína secretora na cultura BMI1 meios

Isto foi realizado usando um PSA-específica -específica BMI1 ELISA (Anticorpos-on-line Inc., Atlanta, GA). proteína BMI1 recombinante foi usado para servir como padrão para este ensaio.

BMI1-siRNA e pBABE-BMI1 (BMI1 expressando plasmídeo) transfecção para validar que BMI1 é realmente secretada por células CaP

Transfec�es foram realizados usando Lipofectamina (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acordo com o protocolo do fornecedor. Por esta razão, em primeiro lugar BMI1 intracelular de Caucasiano tampa (LNCaP e DU145) e Cap americano Africano (E006) foi determinada células epiteliais.

Menos de 1

abordagem st.

BMI1 foi batido baixo por shRNA em células americanos caucasianos e africanos. 12 h após a transfecção, as células foram cultivadas em meio completo durante 12 h. Após 24 h pós-transfecção, o meio foi rejeitado e as células foram cultivadas em meios isentos de soro durante 24 h. Após 24 h, meios livres de soro de células BMI1-knockdown foi recolhido e secretadas-BMI1 níveis foram medidos por ELISA.

Sob 2

nd abordagem.

células cancerosas da próstata representam Caucasiano e doenças Africano americano foram transfectadas com plasmídeo BMI1-sobre-expressam. 12 h após a transfecção, as células foram cultivadas em meio completo durante 12 h. Após 24 h pós-transfecção, o meio foi rejeitado e as células foram cultivadas em meios isentos de soro durante 24 h. Após 24 h, meios livres de soro de células BMI1-sobre-expressam foi recolhido e secretadas-BMI1 níveis foram medidos por ELISA.

tratamento de andrógeno de células

Por esta razão, Europeu e Africano da próstata Americana As células epiteliais foram tratadas com um análogo de androgénio (R1881) durante 12 h. Após 12 h, o meio foi descartado e as células foram cultivadas em mais 12 h. Após 24 h, as células foram recolhidas para serem avaliados para expressão BMI1 intracelular por análise de western blot.

Análise estatística

resumos gráfica da distribuição da intensidade de coloração foram feitas usando gráficos de dispersão e gráficos de caixas. Simples métodos egresso e de correlação linear foram utilizados para avaliar a associação entre BMI1, PSA e Cap rank (1 = normal, 2 = Estágio II, 3 = Fase III, 4 = Stage IV). Para corrigir a obliquidade, BMI1 e PSA foram analisados ​​numa escala logarítmica (base2). Um valor de p 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

Os níveis de proteína Bmi1 nos tecidos da próstata aumenta com estágios progressivos de doença em modelos de camundongos transgênicos TRAMP

Glinsky et ai. [18] mostraram anteriormente que a proteína Bmi1 é elevada nos tecidos prostáticos de ratinhos TRAMP, um modelo de murganho de desenvolvimento autóctone PAC, nós investigamos se um aumento progressivo nos níveis de Bmi1 em tecidos prostáticos poderia ser detectado durante a idade progressiva da tampa. Para isso, usaram amostras de tecido prostático coletadas em diferentes idades de ratos transgénicos TRAMP. Como mostrado na Fig 1A; Observou proteína Bmi1 ser detectável em todas as idades de ratinhos TRAMP. Em geral, a coloração foi mais forte em células epiteliais da próstata de ratos mais velhos do que em células epiteliais da próstata de ratos mais jovens. As células musculares lisas tem coloração muito mais forte do que as células de fibroblasto. O padrão de coloração das proteínas foi comparada Bmi1 idade em espécimes da próstata 17 semanas a 45 semanas de idade (Fig. 1A). Estes dados mostram o aumento dos níveis de proteína Bmi1 expressão na próstata de ratos envelhecidos mais velhos (Fig. 1A). Houve uma coloração intensa na região apical das células epiteliais. regiões do estroma foram observados para ter uma coloração positiva (Fig. 1A).

As fotomicrografias (a) representar imunocoramento BMI1 nos tecidos da próstata de ratinhos TRAMP transgênicos. As setas indicam a coloração para BMI1. Ampliação × 40. (Bi) fotomicrografias mostram regiões neoplásicas e não-neoplásicas BMI1-positivos de espécimes da próstata de pacientes com PAC como avaliado por imunocoloração. As setas indicam a coloração para BMI1. Ampliação × 40. (Bii) Os diagramas de caixa para a proteína BMI1 com base na pontuação referem-se a imunocoloração padrão em amostras normais e boné na região do estroma *, P . 0,05; barra preta na caixa, valores medianos.

expressão da proteína BMI1 em amostras de tecido prostático de Cap pacientes

Em particular, algumas células epiteliais de células epiteliais rato transgénico da próstata mostraram coloração apical densa sugerindo que Bmi1 poderia ser uma proteína de secreção. A seguir, identificou a expressão de BMI1 em amostras de CaP humanos por análise imuno-histoquímica e determinou seus níveis de expressão em regiões do estroma de 70 espécimes de correspondência par de Cap normal e que representam todas as fases do tumor. A intensidade da coloração de imunoperoxidase para BMI1 foi pontuada como 0 (negativa), 1 (fraca), 2 (moderado) e 3 (forte). Immunostains apresentaram coloração em ambos estroma não-neoplásicas e neoplásicas. Em geral, a coloração era mais forte do que no estroma neoplásico no estroma não neoplásico. As células epiteliais também apresentou coloração positiva para o anticorpo (Fig. 1bi). As células musculares lisas tem coloração muito mais forte (3) do que as células de fibroblasto (0-1 +). O padrão de coloração da proteína BMI1 foi comparado na fase II-IV exemplares tampa (Fig. 1bi). Esses dados apresentaram níveis aumentados de proteína BMI1 expressão no tumor de alto grau em Cap humano (Fig. 1bi). Os diagramas de caixa dos dados para a expressão da proteína BMI1 no estroma exibiu uma grande variação inter-espécime em amostras de cancro, em comparação com tecidos normais e revelou uma diferença significativa no nível de proteína entre os tecidos normais e CAP (p . 0,05, Fig 1Bii ). A pontuação média para a intensidade de coloração do BMI1 no estroma dos tecidos normais foi de 0,81 ± 0,07 (n = 70), e foi significativamente mais baixa do que a fase de alto grau II (1,8 ± 0,08; n = 36), a fase III (2,26 ± 0,10 n = 28) e a fase IV (2,8 ± 0,11; n = 6) amostras de cancro (Fig 1Bii;. p 0,05). Um padrão semelhante de coloração em amostras de CaP de correspondência par foi observada no epitélio dos espécimes da próstata. Tomados em conjunto, estes dados mostram que a expressão de BMI1 aumenta com o aumento etapa do PAC.

expressão BMI1 em células prostáticas normais e neoplásicas representando doença CaP em homens caucasianos

Como uma tentativa para identificar a expressão de BMI1 na progressão CaP, primeiro mediram os níveis de expressão de proteína por análise de immunoblot em diversas linhas humanos caucasiano PAC, LNCaP, DU145 e PC3 e comparou-os a NHPE (células epiteliais da próstata primário normal) e RWPE1 (representando células epiteliais prostáticas imortalizadas normais) , respectivamente. Entre as linhas de células CaP utilizados, LNCaP é andrógeno-dependentes enquanto DU145 e PC3 são andrógeno-independentes. A escolha destas células foi baseado no facto de que 80% dos pacientes com CaP presentes doenças dependentes de androgénio no momento do diagnóstico, o qual mais tarde se transforma em doença mais agressiva, independente de androgénios [19]. Como mostrado na Figura 2 (Ai-II), todas as linhas celulares de CaP exibiu uma expressão mais elevada de proteína BMI1 do que em células epiteliais de próstata normais. Quando a expressão da proteína de BMI1 foi comparada, baseada na análise densitométrica das imunomanchas, as células PC3 e DU145 altamente agressivos exibiu maior do que a expressão em células LNCaP (Fig. 2Aii). Curiosamente, também detectada expressão BMI1 nas células estromais da próstata (WPMY1) (Fig. 2ai-II). Curiosamente, a expressão BMI1 verificou-se ser muito baixa em células epiteliais da próstata representativos condição hiperplasia prostática (BPH) benigna (dados não mostrados).

(Ia) A Figura representa o nível de proteína BMI1 em células normais e de CaP origem caucasiana como avaliado por análise de imunotransferência. O carregamento igual de proteína foi confirmada por imunotransferência de reprobing β-actina. O blot aqui mostrados são representativos de três amostras. (Ali) Histograma mostrando a análise de densitometria de imunomarcações de BMI1. *, P 0,05; barra preta na caixa cinzenta, valores medianos. (Bi) Figura representa o nível de proteína BMI1 em células normais e Cap de origem americana Africano como avaliado por análise de imunotransferência. O carregamento igual de proteína foi confirmada por imunotransferência de reprobing β-actina. As membranas aqui mostrados são representativos de três amostras. (Bii) Histograma mostrando a análise de densitometria de imunomarcações de BMI1. *, P 0,05; barra preta na caixa cinzenta, valores medianos. (C) A Figura representa a detecção de BMI1 em meio de cultura condicionado de células diferentes como avaliado por análise de Slot-Blot. Os borrões dados aqui apresentados são representativos de três amostras. (D) A detecção da proteína BMI1 secretada em meio de cultura condicionado das células. Cada barra no histograma representa significam ± SE de 3 experimentos independentes, * representa P . 0,05

expressão BMI1 em células prostáticas normais e neoplásicas representando doença PAC em África-Americana homens

dados ajustadas por idade do estudo SEER mostrou que os homens afro-americanos têm uma incidência 60% maior e as taxas de mortalidade de 125% mais elevados de Cap do que homens caucasianos [1], [13]. Raça e história familiar são os dois fatores de risco mais amplamente aceite para esta doença [1]. A compreensão dos mecanismos biológicos subjacentes responsáveis ​​pela progressão CaP acabará por levar ao desenvolvimento de estratégias terapêuticas mais eficazes. Determinou-se os níveis de expressão BMI1 em um modelo in vitro representando diferentes fenótipos da doença CaP em homens afro-americanos à base de células. Estes incluem RC77N /E (representando células epiteliais prostáticas normais em homens afro-americanos), RC77T /E (representando células epiteliais prostáticas tumorigênicos andrógeno-dependentes), E006 (representando células epiteliais prostáticas não tumorigénicas andrógeno-dependentes) e PCA-2b ( representando fenótipo CRPC; no entanto reter a capacidade de resposta de androgénio) [13] – [14]. Como mostrado na Figura 2 (bi-II), todas as linhas celulares de CaP RC77T /E, PCa2b E006 e exibiu uma expressão mais elevada de proteína BMI1 do que em células normais RC77N /E. Estes dados (fig. 2A-B) sugerem a possibilidade que a expressão da proteína BMI1 intracelular pode ser correlacionada com os níveis de secreção BMI1 em tecidos humanos e podem desempenhar um papel na agressividade de CaP humano.

BMI1 é um secretora proteína: Detecção em meios isentos de soro a partir de culturas de células CaP

a presença de BMI1 na região apical das células epiteliais da próstata e região do estroma nos levou à hipótese de que poderia ser uma proteína secretora na natureza. Para testar a hipótese de que se pediu BMI1 é segregado pelas células de tumor, sob condições de cultura. A fim de detectar a proteína BMI1 em meios de cultura de células PAC, nós empregamos a técnica Slot-blot. As células a um nível de confluência de 80% foram deixadas crescer em meio isento de soro fresco durante 24 h. Como é evidente a partir da Fig. 2C, meio livre de soro (colhidas de Cap cultura de células) testou positivo para a proteína BMI1. Notavelmente, meios recolhidos a partir de culturas de células epiteliais representante da condição normal e BPH exibiu muito baixa proteína BMI1 (Fig. 2C).

Quantificação de BMI1 secretora em meios de cultura de células que representam PAC em caucasianos e homens afro-americanos

ao empregar uma técnica BMI1-ELISA específica humana, fomos capazes de detectar e quantificar proteína BMI1 secretada por células que representam PAC em caucasianos e homens afro-americanos (Fig. 2D). Nós determinamos secretado níveis BMI1protein (a) no meio de cultura de BPH1 normal, e (b) no meio de cultura de células tumorais representam vários tipos de câncer. BMI1 foi detectado no meio de cultura de células da próstata normais (RWPE1; 0,45 ng /ml de meios) e curiosamente os níveis de BMI1 não estavam elevados em células BPH1 (Fig. 2D). Em comparação com células normais RWPE1, células CaP exibiram aumento dos níveis de proteína BMI1 secretoras em meios (Fig. 2D). LNCaP, C42b, PC3 e DU145 foram observadas células para segregar proteínas BMI1 numa gama de 1.3-3.4 ng /ml de meio (Fig. 2D). É digno de nota que BMI1 segregada de proteína foi observada no meio de cultura isento de soro de todos os tipos de linhas de células de CaP representativas de RWPE1 normal LNCaP menos agressivo para o cancro da próstata (CRPC) células resistente à castração C42b através de células DU145 e PC3 altamente agressivos. Este achado corrobora com os dados obtidos pacientes com PAC que representam estágios progressivos de doença que foram analisadas para níveis de proteína de soro-BMI1. Notavelmente, meios recolhido a partir das culturas de células epiteliais E006 (derivado de CaP americana Africano paciente) exibiram significativamente alta proteína BMI1 (Fig. 2D). Pelo contrário, o meio de cultura de células estromais da próstata (WPMY1), as células normais epiteliais do cólon (FHC) e células epiteliais do ducto pancreático normais (PDE) não exibiram quaisquer níveis BMI1 segregados (dados não mostrados). Curiosamente, níveis BMI1 secretadas não deviam ser observados em todos os tipos de pâncreas (KRAS mutante de PDE, E6E7-Ras e E6E7-Ras-ST) e linhas de células de carcinoma do cólon (SW480, HCT116), mas apenas em linhas de células pancreáticas altamente agressivos AsPC1 (em níveis muito baixos; dados não mostrados) e de células do cólon HT29 (dados não mostrados). Os dados ELISA de BMI1 secretora está de acordo com nossas observações em análise immunhistochemical de amostras de tecido PAC onde o observamos aumento da coloração do estroma para a proteína BMI1. Este seria o primeiro relatório mostrando BMI1 como uma proteína de secreção a partir de células tumorais.

Secretado BMI1 nos meios de cultura está diretamente relacionada à BMI1 intracelular de células tumorais

Desde BMI1 foi observada a secretar em os meios de cultura, procurou-se determinar se essa secreção está relacionada com BMI1 intracelular. Nós empregamos uma abordagem de duas vias onde BMI1 ou foi knocked-down ou sobre-expressos em células PAC. Depois de 24 h após a transfecção, BMI1-suprimida e células BMI1-sobre-expressos foram cultivados no meio isento de soro durante mais 24 h. A seguir, meio isento de soro a partir de culturas de células transfectadas foram colhidas e analisadas para a proteína IMC empregando um ensaio ELISA. Foram observados níveis de proteína BMI1 a ser altamente reduzidos em células BMI1-knocked-down e o aumento em células BMI1-sobre-expressos (Figura 3A-F;. p 0,05). Estes dados mostram que as células tumorais BMI1-silenciadores segregam níveis significativamente baixos de proteína BMI1 e células CaP BMI1-sobre-expressos secretadas de forma significativa níveis elevados de proteína BMI1 nos meios de cultura, os dados sugerem que o intracelular BMI1 está directamente correlacionada com os níveis de proteína BMI1 secretoras ( Figura 3A-F;. p 0,05). Especulamos que a elevação dos níveis intracelulares em células BMI1 CaP eleva-se a sua subsequente libertação de células epiteliais para o espaço extracelular e causa um aumento nos níveis de proteína BMI1 secretoras.

(A-F) A figura representa o efeito de (a-C) BMI1-silenciamento e (D-F) BM11-sobre-expressão do nível de proteína secretada BMI1 em meios condicionados de células diferentes como determinado por ensaio de ELISA. O carregamento igual de proteína foi confirmada por reprobing imunoblots para β-actina. Cada barra no histograma representa a média ± DP de 3 experiências independentes, * representa a P 0,05. (Gi) Figura representa o nível de proteína BMI1 em androgénio (R1881) tratadas e não-tratadas células tampa como avaliado por análise de imunotransferência. O carregamento igual de proteína foi confirmada por imunotransferência de reprobing β-actina. (GII) Histograma mostrando a análise de densitometria de imunotransfer�cias de BMI1. *, P 0,05; barra preta na caixa cinzenta, valores medianos.

expressão BMI1 em células que representam PAC em caucasianos e homens afro-americanos é independente da influência de andrógeno

As diferenças entre as raças em concentrações de andrógenos e sensibilidade são considerados como factores importantes para as disparidades raciais em Cap [20]. No entanto, as concentrações de andrógenos nem sempre se correlacionam com PSA em doentes com cancro e às vezes enganar o resultado [21]. A seguir, perguntado se os níveis BMI1 doença em seres humanos PAC tem uma correlação com a presença ou ausência de androgénio. Para este efeito, foram selecionados VCaP (representando fenótipo CRPC independente de andrógeno na população caucasiana), E006 (população representando células epiteliais dependentes de androgénio não tumorigénicas prostáticas de Africano-Americano) e PCA-2b (resposta andrógeno células CRPC da população Africano-Americano ). tratamento de androgénio (R1881; 1 nM) de VCaP, E006, e CaP-2b células não causou alterações significativas nos níveis de proteína BMI1 (Fig 3Gi-ii;. p 0,05), sugerindo, assim, que a expressão BMI1 é independente do estado de androgénio . Este dado é significativo porque CaP agressivo tanto em caucasianos e Africano-Americano é muitas vezes andrógeno independente [6], [19].

Detecção de proteína BMI1 no sangue de pacientes com PAC humanos

Uma vez que, observou BMI1 proteína a ser segregada por células epiteliais da próstata humana in vitro. A seguir, perguntado se BMI1 poderia ser detectado no soro de pacientes com PAC. Com o emprego de análise de Slot-blot, foram determinados os níveis de proteína BMI1 em soros apuradas livre de albumina, preparados a partir de sangue humano (selecionados aleatoriamente de pacientes com PAC normal e). Como é evidente a partir da fig. 4A, proteína BMI1 foi detectado no soro de pacientes com PAC.

(A) A figura representa a detecção de BMI1 no soro humano tal como avaliado por análise de Slot-Blot. Os dados blot aqui mostrados são representativos de três amostras. (B) Lote de BMI1 (ng /ml, log-2) versus classificação grupo de limite (n = 58). linha horizontal é a média do grupo. (C) Lote de PSA (ng /ml, log-2) versus classificação grupo de limite (n = 58). linha horizontal é a média do grupo. Cada grupo (Fig F . G) representado como 1 = normal, 2 = Estágio II, 3 = Fase III, e 4 = Stage IV PAC. (D) A Figura representa a correlação entre os níveis séricos-PSA (ng /ml, 2-log) e soro-BMI1 (ng /ml, 2-log) (Spearman, r = 0,58, p 0,001) em 58 homens. Linha é de regressão linear simples.

Os níveis de proteína do soro-BMI1 aumentar progressivamente com o desenvolvimento da PAC em pacientes humanos

A seguir, perguntou se os níveis de proteína de soro-BMI1 ter relevância translacional como um potencial biomarcador para estadiamento e desenvolvimento da doença CaP em seres humanos. Para isso, investigou se os níveis de proteínas séricas-BMI1 exibem uma diferença significativa no que diz respeito às diferentes fases do PAC. Nós determinamos os níveis de soro-BMI1 em uma coorte de 58 sujeitos humanos que representam a condição livre de doença normais, e diferentes estágios PAC, viz., Normais (n = 10), Estágio II tampa (n = 16), Fase III tampa (n = 15 ) e Stage IV tampa (n = 17). Os níveis de proteína no soro médios-BMI1 em sujeitos humanos normais (n = 10) foram estimadas como sendo de aproximadamente 1,72 ± 0,30 ng /ml de soro (Tabela 1). O nível BMI1 soro para cada paciente é fornecida na Tabela 2. Os níveis séricos-BMI1 foram menores em sujeitos humanos normais do que em pacientes com PAC. Os níveis de proteína BMI1 em pacientes com PAC humanos foi 3,91 ± 0,60 ng /ml no tampão de fase II, 8,55 ± 1,95 ng /ml em fase III PAC e 10,84 ± 2,44 ng /ml no tampão de estágio IV (Tabela 1). Estes dados mostram que os níveis médios de proteína de soro-BMI1 foram aumentou progressivamente com o aumento da fase da doença em seres humanos CaP (r = 0,72, p 0,001, Figura 4B.). Estes dados sugerem que os níveis de proteína de soro-BMI1 possuem um potencial translacional a ser desenvolvido como um novo soro-biomarcador para a doença CaP no entanto mais estudos em um grande grupo de pacientes são necessários.

Serum níveis -BMI1protein foram correlacionados com níveis séricos de PSA

em seguida, investigaram se um aumento na BMI1 durante desenvolvimentos tampa tem uma correlação com os níveis de PSA nestes pacientes (n = 58). Neste grupo de pacientes PAC, também foi observada associação de PSA com a progressão da tampa (r = 0,57, p 0,001, Fig 4C.). O nível de PSA no soro para cada paciente é fornecida na Tabela 2. BMI1 foi modestamente correlacionados com a PSA (r = 0,58, p 0,001, Figura 4D.). BMI1 permaneceu significativamente (p 0,001). Quando o ajuste de PSA em um modelo de regressão prevendo grupo estágio do câncer

Discussão

Um biomarcador de prognóstico fornece evidências sobre eventuais resultados de um paciente de uma doença independente de uma dada terapia, ao passo que um biomarcador preditivo-estima a probabilidade de resposta /benefício para uma terapia específica num contexto específico [22].