Abstract

Este estudo descreve o mecanismo de sensibilização ao estresse térmico por inibidores de histona deacetilase (HDACIs) em células de cancro do pulmão e Ku70 mostra que, com base no seu estado de acetilação, medeia a protecção de cancro do pulmão de hipertermia (42,5 ° C, 1-6 horas). Ku70 regula a apoptose sequestrando pró-apoptótica Bax. No entanto, o seu papel na tensão térmica não é totalmente compreendido. Os resultados mostraram que as células de câncer de pulmão pré-tratamento com HDACIs, nicotinamida (NM) ou Trichostatin A (TSA) ou ambos apoptose Bax dependente induzida por hipertermia significativamente reforçada no PC-10 células. Descobrimos que a hipertermia induz SIRT-1, Sirtuin, regulação positiva, mas não HDAC6 ou SIRT-3, portanto, transfecção com negativo dominante SIRT-1 (Y /H) também eliminou a proteção e resultou em mais morte celular por hipertermia, na H1299 células através activação Bax. Hipertermia sozinho preparado cancro do pulmão células à apoptose sem morte proeminente. Depois de hipertermia Bax foi regulada positivamente, a Bcl-2 foi regulada negativamente, o rácio de Bax /Bcl-2 foi invertido e Bax /Bcl-2 foi heterodímero dissociado. Embora hipertermia não afectou o nível total de expressão de Ku70, Ku70 estimulou desacetilação, que por sua vez poderia ligar-se mais Bax nas células PC-10. Estes achados sugerem um mecanismo de fuga de activação Bax induzida por hipertermia. Para verificar o papel da Ku70 neste mecanismo de proteção, Ku70 foi silenciado por siRNA. Ku70 silenciamento sensibilizado significativamente as células de câncer de pulmão a hipertermia. As células Ku70 KD foram submetidos a paragem em G1 e dependente de caspase da apoptose citotóxico quando em comparação com os transfectantes mexidos, que apresentou apenas G2 /paragem citostático H nas linhas celulares investigadas, sugerindo um adicional de célula dependente do ciclo, romance, papel de Ku70 em protecção de hipertermia. Tomados em conjunto, os nossos dados mostram um mecanismo de proteção Ku70 dependente de hipertermia. Segmentação Ku70 e /ou a sua acetilação durante a hipertermia pode representar uma abordagem terapêutica promissora para o câncer de pulmão

Citation:. Hassan MK, Watari H, Salah-Eldin A-e, Sultan AS, Mohamed Z, Fujioka Y, et al. (2014) As células histona Deacetilase Câncer Sensibilizar Lung à hipertermia: Envolvimento de Ku70 /SIRT-1 em Thermo-Protection. PLoS ONE 9 (4): e94213. doi: 10.1371 /journal.pone.0094213

editor: Sue Cotterill St. Georges, University of London, Reino Unido

Recebido: 30 de agosto de 2013; Aceito: 14 de março de 2014; Publicação: 11 de abril de 2014

Direitos de autor: © 2014 Hassan et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado em parte por uma ajuda não reembolsável em-HW de Pesquisa científica (C 22.591.844 e 20.659.255) do Ministério da Educação, Cultura, Desporto, Ciência e Tecnologia do Japão. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a investigação interesse de longa data tem sido alvo os mecanismos específicos responsáveis ​​pelo desenvolvimento de resistência de células cancerosas a diferentes terapias. Segmentação estes mecanismos podem aumentar a destruição específica de células cancerosas. A hipertermia é uma modalidade utilizada na prática clínica, para o tratamento de muitos cancros; que é normalmente utilizado em combinação com radioterapia e /ou quimioterapia [1], [2]. No entanto, um obstáculo significativo para a eficácia de hipertermia é o desenvolvimento da resistência celular, que bloqueia a sinalização apoptótica e aumenta a sobrevivência celular [3], [4]. Isto faz com que a resistência de limitação de apoptose depois de hipertermia [5], [6]. Assim, a identificação dos mecanismos responsáveis ​​pelo desenvolvimento de termo-resistência em células de cancro, pode ajudar a melhorar o direccionamento específico para aumentar a sensibilidade celular para os resultados do tratamento de hipertermia. A resistência a apoptose é uma característica comum das células cancerosas [3], [7]. A apoptose é induzida por, vias extrínseca e intrínseca [8]. A ligação de ligandos a um receptor de morte activa a via extrínseca; a via intrínseca é activada por stress celular, tais como danos no ADN. A família de proteínas Bcl-2 regula a via intrínseca; ela influencia a permeabilidade da membrana exterior mitocondrial [9]. Os membros da família Bcl-2 são divididos em proteínas pró-apoptóticas, tais como Bax, Bak, e Bok, e proteínas anti-apoptóticas, incluindo Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w, e Mcl-1 [10] – [13].

Acumulação de Bcl-2 e Bcl-xL, pode proteger as células da apoptose, promover a sobrevivência celular e acelerar o crescimento do tumor por sequestrantes pró-apoptótica Bax. Ku70 é outra molécula anti-apoptótica; ele naturalmente se liga Bax, sequestrando-a ativação ou a translocação mitocondrial em células átonas [14], [15]. Ku70 é um dos componentes do heterodímero Ku70 /Ku80 que está envolvido na reparação de danos no ADN [16]. A acetilação de duas lisinas críticos, no terminal carboxilo de Ku70, regula a ligação /dissociação para Bax e isto afecta a sensibilidade subsequente da célula a estímulos apoptóticos [14]. Apenas desacetilada Ku70 pode vincular a Bax. Alta expressão de Ku70 em células cancerosas que melhoram a capacidade de reparo do DNA e reduzir a apoptose Bax mediada; Portanto, Ku70 pode desempenhar um papel na resistência ao tratamento. A actividade relacionada com a apoptose de Ku70 é independente do seu papel na reparação do ADN [17]. O ciclo de acetilação /Ku70 desacetilação é regulada por transferases de acetilo e histona desacetilases das histonas (HDACs). Ku70 é um alvo de alguns membros da classe I /II HDAC e classe III HDAC [18], [19]. A família de proteínas de HDAC é dividido em duas categorias: as enzimas dependentes de zinco (HDAC1-11), subdividido em classe I e classe II, que são inibidos pela tricostatina A (TSA) e NAD

+ – Enzimas dependentes (classe III; SIRT1-7) que é inibida por nicotinimide (NAM). Mais precisamente, SIRT-1, um membro das HDACs de classe III, desempenha um papel crucial em Ku70 desacetilação, o que melhora a protecção de células de Bax durante a restrição calórica [19]. A maioria das células de cancro sobre-expressar SirT1 [20]. Assim, tendo como alvo a protecção Ku70-dependente da apoptose, por inibidores de HDAC que inibem SIRT-1, pode ser uma estratégia eficaz para sensibilização de células cancerosas para diferentes terapias. Neste estudo, o nosso modelo é que as células de cancro do pulmão são significativamente mortos por hipertermia, quando pré-tratadas com HDACIs em comparação com apenas hipertermia. SIRT-1 e seu alvo, Ku70, são fundamentais para o mecanismo pelo qual as células de câncer de pulmão pode escapar da morte induzida por térmico. As alterações na actividade da Bax, Ku70 acetilação e o ciclo celular foram estudados durante a exposição à hipertermia. Além disso, a eficiência da sequência de direccionamento específico de Ku70, utilizando siARN, também foram estudados no que diz respeito a sensibilização de células de cancro do pulmão para hipertermia. Ku70 parece desempenhar um papel crucial na proteção de células de hipertermia, provavelmente, sequestrando-regulada Bax.

Materiais e Métodos

As linhas celulares

Dois humana, não linhas de pulmão de células pequenas células de carcinoma: PC-10 [21], e H1299, foram adquiridos (American Type Culture Collection, ATCC) e cultivadas em meio RPMI 1640 (Gibco, Grand Island, NY, EUA) contendo 10% de soro fetal de bovino ( Sigma, St. Louis, MO, EUA) (meio completo) numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2 a 37 ° C. O meio de cultura foi substituído por meio completo fresco de três em três dias.

Anticorpos e reagentes

anti-humano policlonal de coelho Bax anticorpo (PAB) e o anticorpo monoclonal de ratinho anti-Ku70 humano (mAb) foram adquiridos a BD Bioscience (Erembodegem, Bélgica); um outro mAb anti-humano de rato Ku70 para imunoprecipitação, HDAC-6 anti-humano e anti-humano de coelho SIRT-3 (PAB) foram adquiridos a Abcam (Cambridge, Reino Unido); mAb de rato anti-Ku80 humana a partir da transdução do sinal (EUA), anti SIRT-1 humana e anti-pan K (lisina acetilado) da Upstate (Upstate Biotechnology, Lake Placid, Nova Iorque, EUA); mAb anti-humano de Bcl-2 de ratinho foi adquirido de DAKO (Glostrup, Dinamarca). Detecção por imunotransferência foi realizada com anticorpos anti-ratinho ou anti-coelho secundário conjugado com HRP (Dako) diluído de 1: 2000. imunofluorescência foi realizada utilizando anti-coelho anticorpos secundários conjugados com FITC (Dako) diluído em 1:. 50. inibidores da histona deacetilase (HDACIs), nicotinamida (NAM) e Trichostatin (TSA) foram adquiridos de Wako Chemicals, Japão

HDACi

Cada HDACi utilizado foi pesquisada quanto a sua dose sub-letal de uma experiência piloto. A viabilidade celular foi avaliada utilizando o ensaio de MTT, com ou sem unicamente DMSO, e a adição de diferentes doses de cada um dos HDACIs; 300 nM de TSA e 20 mM de NAM foram escolhidas como as doses não-tóxicas e mais utilizada nas experiências subsequentes.

Tratamento térmico

As células ligadas à parte inferior das placas de cultura, eram pré-cultura durante 48 h, e foram então incubadas numa atmosfera humidif içada de 5% de CO

2 em cada 37,0 ° C (controlo) ou 42,5 ° C durante 1-9 h.

a citometria de fluxo, a análise do ciclo celular e anexina V coloração

Após a exposição à hipertermia, as células foram re-incubadas a 37 ° C durante 0 h, 24 h, ou 48 h. Em seguida, foram analisadas as fases do ciclo celular. Resumidamente, as células foram fixadas com 70% de etanol a 4 ° C durante a noite. Após a lavagem com Ca

2 + Mg

2 + livre de PBS de Dulbecco, as células foram tratadas com 0,1 mg /ml de ARNase (tipo IA; Sigma, St Louis, MO, EUA) e, em seguida, coradas com 100 ug /mL de iodeto de propídio (PI; Sigma), no escuro, à temperatura ambiente durante 20 min. Depois de passar através de uma malha de nylon de 40 nm, as amostras foram mantidas em gelo até serem medidas. Os dados obtidos, usando o calibrador de SCAF, foram utilizados para analisar as proporções de fase do ciclo celular com o software ModFit. Uma fracção de célula de ADN, abaixo da sub-G0 /G1 pico, indicado células apoptóticas; histogramas de ADN foram utilizados para a respectiva estimativa.

Para a coloração de anexina V, as células foram coradas directamente com PI e Anexina V-Flous (Roche) durante 10 min e, em seguida, lavou-se com tampão de incubação. As células foram identificados com um calibrador de FACS após definir a tensão usando células não tratadas de controlo manchado. As células foram analisados ​​usando o software celular busca e classificados em quatro fases distintas: células vivas sem mácula, células em apoptose tenra idade manchado apenas com anexina-V, células em apoptose meia idade duplamente manchados, e apoptóticos idade tardia e células necróticas coradas com PI única

a imunoprecipitação

As células (5 × 10

6 /prato) foram lavadas com PBS frio, lisadas em gelo em tampão de lise RIPA (50 mM de Tris, pH 7, NaCl 150 mM, 0,5% de desoxicolato de sódio e 0,1% de NP-40) (NP-40; Nacalai Teque, Quioto, Japão) ou CHAPS tampão de lise (NaCl 150 mM, HEPES 10 mM, pH 7,4, 1% CHAPS) [22], suplementado com um cocktail inibidor de protease (Sigma) durante 1 h, e depois centrifugada a 15000 rpm durante 10 min. O sobrenadante foi misturado com proteína A-Sepharose ‘(para PAB) ou proteína G-Sepharose (para o mAb) (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, EUA), pré-inchada em PBS e pré-revestidas com o anticorpo desejado contra Bax, Ku70, acetilado ou lisina sIRT-1 por agitando suavemente durante 1 h a 4 ° C e centrifugou-se durante 1 min a 3000 rpm. Após a lavagem com tampão de lise, o imunocomplexo foi fraccionada por SDS-PAGE (10-12% de gel) e, em seguida, foram submetidos a análise de Western blot.

Western Blot Analysis

Depois de SDS-PAGE, as proteínas foram transferidas para uma membrana de PVDF (Amersham, Buckinghamshire, Reino Unido). A membrana foi bloqueada, a 4 ° C durante a noite com tampão de bloqueio. A membrana foi incubada durante 1 h à temperatura ambiente com o Ab desejado. Depois de se lavar três vezes com TPBS, as membranas foram incubadas durante 1 h com Ab secundário, à temperatura ambiente, seguido de três lavagens com TPBS. A membrana foi desenvolvida utilizando reagentes ECL (Amersham). A quimiluminescência foi visualizado com uma câmera de polaroid (Amersham Pharmacia) e quantificadas por meio da densitometria.

projeto siRNA e transfecção

oligômeros siRNA contra mRNA Ku70 (Ku70-siRNA) e uma sequência de controlo que não o fizeram corresponde a qualquer sequência do gene (Cont siRNA) ou foram adquiridos como um validado (Ambion, EUA; Ku70 siRNA-2 e cont siRNA-2, respectivamente) ou concebidos pelos investigadores e, em seguida sintetizado pela Ambion de acordo com a seguinte sequência : Ku-siRNA, 5_UUCUCUUGGUAACUUUCCCdTdT_3 (Ku70 siRNA-1) e 3_dTdTAAGAGAACCAUUGAAAGGG_5; Cont-siRNA, 5_GCG CGC UUU GUA GGA UUC GdTdT_3 e 3_dTdTCGCGCG AAA CAU CCU AAG C_5 (cont-siRNA-1). Esta sequência de segmentação foi validado [23]. oligómeros de ARNsi contra ARNm Bax (Bax-Si) foi adquirido a partir de Qiagene (Cat No. SI04948202). O Bax-si, o Ku70-siRNAs ou CONT-siRNAs foram transfectados em células de câncer de pulmão (10

5 células /60 mm prato) usando SiPORT

Neofex

(Ambion; EUA) para uma final concentração de 200 nM, duas vezes. Um dia após a última transfecção, as células foram tripsinizadas e plaqueadas em placas de 60 mm (50.000 células por prato) em triplicado. Após a ligação de células, as células foram expostas a hipertermia nos intervalos de tempo indicados de acordo com o desenho experimental. Cada experimento foi repetido pelo menos três vezes independentes de reprodutibilidade e cálculo estatístico.

A avaliação estatística

As análises estatísticas foram realizadas utilizando Minitab Release (Ver.12). Os dados são expressos como a média ± S.E.M. Uma análise de variância (ANOVA) foi utilizada para avaliar a significância estatística entre as médias. As diferenças entre as médias foram consideradas significativas para valores de p inferior a 0,05.

Resultados

HDACIs morte celular significativamente facilitada com hipertermia

Como um fato, SIRT-1, um ser humano deacetilase, foi especificamente visada por pequenas moléculas conhecidas como HDACIs, por exemplo NAM. Além disso, Ku70 desacetilação foi inibida por inibidores de moléculas que têm como alvo a classe I /II de HDAC; por exemplo TSA. O primeiro pré-tratadas as células PC-10 com diferentes HDACIs, NAM (20 mM), TSA (300 nM) ou de ambos, durante 4 h antes da exposição à direita hipertermia. Este tratamento combinado aumentou significativamente a apoptose, mais do que duas dobras, em comparação com o tratamento de hipertermia por si só, como observado por microscopia de contraste de fase (Figura. 1A) e anexina V coloração (Figura. 1B). O padrão de expressão do Bax foi analisada em lisados ​​de células inteiras a partir de células PC-10 tratadas e não tratadas. expressão do Bax (21 kDa) foi aumentada por hipertermia. Curiosamente, HDACIs (NAM) e TSA aumentou a produção de 18 kDa Bax, que é conhecido por ser uma forma de N-terminal truncado de Bax. Dado que a activação do Bax induzida quer pela exposição N-terminal por alteração conformacional (mudança reversível) ou truncagem N-terminal (mudança irreversível), estes resultados sugerem que a apoptose aumentada sustentável com hipertermia e HDACIs é Bax-dependente e esta apoptose pode depender na supra-regulação de Bax ou a libertação de proteína anti-apoptótica de Bax (s) para promover a apoptose (Figura. 1C). Mais importante, o tratamento de células de cancro do pulmão com HDACIs, apenas com doses seleccionadas, não tinha nenhum efeito tóxico apreciável. Efeitos similares foram observados de HDACIs nas células H1299 (Figura. S1 e S2). Inesperadamente, a combinação tripla de NAM, TSA e hipertermia foi menos eficaz na H1299 de combinação dupla. Embora o mecanismo molecular exacto deste fenómeno continua a ser obscura, uma razão possível é que a combinação tripla pode aumentar a divisão das células sobreviventes escaparam ao desafio de tratamento triplo, o que pode originar a produção de novas células filhas dentro das 48 horas pós tratamento ( antes da detecção de coloração de anexina V) e fazer com que a redução da percentagem de coloração de anexina V, finalmente. Para verificar que o Bax desempenha um papel importante na apoptose induzida por hipertermia após a segmentação Ku70 desacetilação, Bax foi alvo de siRNA específica em células PC-10 (ver materiais e métodos). Bax foi passível de siRNA transfecção (Bax-Si), quando comparado com o controlo scrambled oligo siRNA (CONT-Si), como detectado por Western blot análise (Figura 1D;. Painel superior). Mais uma vez, quando Bax-derrubado células PC-10 foram tratadas com hipertermia durante 6 h na presença de HDACIs, a morte celular induzida por hipertermia foi inibida significativamente (Figura 1D;. Painel inferior). Por outro lado, a morte celular não foi completamente bloqueado pelo tratamento de hipertermia sozinho (Figura 1D;. O painel inferior e Figura S3.). Este resultado pode indicar o envolvimento de outras moléculas pró-apoptóticos na morte celular induzida limitada por hipertermia.

A

. fotografias de contraste de fase de células PC-10, dois dias após o tratamento com hipertermia HDACIs então- durante 6 h. A imagem mostrou número limitado de células recuperadas, assim como as células apoptóticas e arredondadas flutuantes nas colónias pré-tratados com HDACIs então hipertermia.

B

. Pré-tratamento de células PC-10 com HDACIs aumentou significativamente a apoptose induzida por hipertermia. citogramas comparativos mostram a coloração de anexina V depois de hipertermia em células PC-10 pré-tratada com nictotinamide (20 mM), tricostatina A (300 nM) ou ambos (painel superior). Resumo dos resultados médios anexina V é concluído (painel inferior).

C

. níveis de Bax expressão, por análise de Western, no PC-10 células após a hipertermia (6 h) pré-tratados com diferentes HDACIs. banda inferior (18 kDa) indica truncada, Ativo, Bax só aumentou quando as células tratadas com a combinação de HDACIs e hipertermia.

D

. Um western blot representativo mostra a alteração de Bax para o siRNA específico usado. PC-10 As células foram transfectadas quer com Bax-Si-Si ou cont duas vezes. imunotransferência actina foi utilizado como um controlo de carga (painel superior). redução significativa de coloração de anexina V depois de hipertermia e HDACIs em células Bax KD em comparação com o controle (s), indicando que Bax é o jogador pr�apopt�ica chave na apoptose induzida por tratamento duplo (painel inferior). Cada ponto de dados representa a média de três experiências; barras denotam SD; ** Indica diferença do transfectante controle em P 0,01

Efeito da hipertermia na expressão de proteínas relacionados à apoptose no PC-10 células

Para investigar o efeito da hipertermia em Bax e. as suas principais moléculas de ligação, algumas das proteínas relacionadas com a apoptose (Bax, Bcl-2, Ku70 e Ku80) foram estudados por análise de western blot em uma linha de células representativa, PC-10. Uma vez que a maioria dos genes de manutenção são responsivos a hipertermia, assim Ponceau S a coloração foi utilizado para mostrar o controlo de carga. Hipertermia (42,5 ° C) por 1-9 h induziu alterações quantitativas em Bax e Bcl-2 expressão, sem alterações observáveis ​​em Bcl-xL, Ku70 e Ku80 (Figura. 2A) expressão Bax foi ligeiramente regulada para cima, enquanto Bcl-2 expressão foi regulada em células PC-10. O rácio de Bax /Bcl-2 aumentou gradualmente após tratamento de hipertermia (Figura. 2B, painel superior). A análise de Western blot de Bax e Bcl-2, com diferentes quantidades de carga de proteína (20 ug, 40 ug e 60 ug /pista), após 0 h e 6 tratamento h hipertermia confirmou uma taxa de Bax /BC-L2 aumentada (fig. 2B , painel inferior) como verificado denstimetrically (usando Scion software de imagem). Observações semelhantes foram também obtidos em células H1299 (Figura. S4). Por isso, tivemos muito interesse para responder à pergunta por que as células cancerosas, com o tipo selvagem Bax, que foi regulada, não mostraram apoptose proeminente após a hipertermia, a menos DHACIs são adicionados. Visivelmente, por imunocitoquímica, Bax e Bcl-2 mostrou localização principalmente citosólico em linhas celulares estudadas (Figura. S5). Por isso, mudou-se para estudar Bax dimerização.

A

extratos de células .Whole foram preparados a períodos indicados após a 42,5 ° C hipertermia e Bax, Ku70, Ku80 e Bcl-2 foram analisados ​​por immunoblotting . Ligeiro aumento Bax somente após 6 e 9 h hipertermia e activação Bax limitado após 9 h são observáveis. A hipertermia reduzida Bcl-2, enquanto a Bcl-xL e Ku70 não tinha sido claramente afectada. Anaysis foi realizada na mesma mancha de modo que cada proteína funcionou como um controlo de carga para o outro. A coloração de Ponceau S representante da membrana foi mostrado para verificar a normalização, pois a maioria dos genes de manutenção de casas de base (por exemplo: de actina e tubulina) estão a responder à hipertermia.

B

. análise quantitativa da expressão da proteína Bcl-2 e Bax durante hipertermia. Cada banda foi quantificada densitimetrically. Um conjunto representativo de relação de Bax /Bcl-2 é mostrado. análise de Western com diferentes quantidade de carga de PC-10 células lisados ​​após 6 h hipertermia verifica a alteração na proporção da Bax /Bcl-2, enquanto que a expressão de Bcl-xL foi utilizado como um controlo de carga do mesmo blot.

Distúrbio do Bax heterodimerização por hipertermia

Nas células átonas, Bax heterodimerizes com muitos, moléculas parceiras, anti-apoptóticos; -lo homodimerizes sob estresse de induzir a apoptose. Para estudar o efeito da hipertermia em Bax dimerização, Bax foi imunoprecipitada a partir do lisado de células PC-10 depois de 6 h de exposição à hipertermia. Figure.3A, mostra diminuição Bax /Bcl-2 formação de heterodímeros; o heterodímero Bax /Bcl-xL não foi afectada por hipertermia, de acordo com os resultados da análise de Western blot. De nota, foi que a quantidade de Ku70 obrigado a Bax aumentou com o aumento do tempo de exposição à hipertermia. A imunoprecipitação Ku70 confirmados reforçada Bax /Ku70 vinculativo após 6 h de exposição à hipertermia, enquanto Ku70 /Ku80 ligação não mostrou nenhuma mudança (Figura. 3B). Observação semelhante foi detectada quando tampão CHAPS foi utilizado para os experimentos de imunoprecipitação (Figura. S6)

A

. PC-10 As células foram incubadas a 42,5 ° C durante 0, 1, 3 e 6 h. Bax foi co-imunoprecipitado a partir da proteína total de 2 mg e Bcl-xL, Bcl-2 e Ku70 foram detectados no imunoprecipitado por análise de Western. Hipertermia induz Bax up-regulação e Bax dissociação Bcl2 e aumenta a associação entre Bax e Ku70, enquanto nenhum efeito sobre a associação Bax /Bcl-xL. Em contraste, Ku70 foi co-imunoprecipitado a partir de lisados ​​de células semelhantes. Bax e Ku80 são mostrados no imunoprecipitado.

B

. Depois de hipertermia, os níveis totais de Ku70 não mostraram alterações, mas associação entre Ku70 e Bax foi reforçada.

Hipertermia reduzida Ku70 acetilação nos PC-10 células

A acetilação de qualquer K539 ou k542 no ligante Ku70 C-terminal é suficiente para bloquear completamente a supressão de apoptose Bax Ku70 mediada por [14]. Os efeitos da hipertermia no estado de acetilação Ku70 foram, por conseguinte, investigado por sondar a mancha de Ku70 imunoprecipitado com lisina antiacetylated AB (Figura 4A.); os resultados mostram uma redução significativa no Ku70 acetilação após 6 h de exposição para a hipertermia em células PC-10. Além disso, a quantidade de Ku70 detectado, no imunoprecipitado proteína acetilado, diminuiu de uma forma dependente do tempo (Figura. 4B).

Um

. Ku70 foi imunoprecipitada a partir de quantidades iguais de proteína (3 mg) de lysat de células PC-10 após a hipertermia no tempo indicado. Ku70 e acetil lisina foram detectados no imunoprecipitado. Total de Ku70 não mostrou nenhuma mudança após 6 h hipertermia (na venda), mas acetilado Ku70 foi diminuída.

B

. Todas as proteínas imunoprecipitadas foram acetilados, fraccionado, apagados e Ku70 foi detectada no blot. Bandas indicadas acetiladas Ku70 se tornou mais fraca com o aumento do tempo de hipertermia.

C

. Hipertermia reforçada tanto a expressão Ku70 e Ku70 /SIRT-1 vinculativo. SIRT-1 foi imunoprecipitada a partir de PC-10 após a hipertermia (0-6 h). Blot indica SIRT-1-regulação (em venda; painel inferior) e maior ligação a Ku70, no mesmo blot, foi regulada (painéis superiores).

D

. tratamento de hipertermia semelhante em H1299. Ku70 total foi precipitado. Ku70 e SIRT-1 foram detectados no imunoprecipitado por análise de Western. SIRT-1 /Ku70 ligação foi aumentada, indicando uma desacetilação Ku70 reforçada em células de câncer de pulmão por hipertermia.

SIRT-1 medeia citoproteção Ku70 dependente de hipertermia

É bem conhecido que Ku70 acetilação é especificamente revertida por sIRT-1, uma desacetilase humana, sob estresse leve (como a restrição calórica); Sob tais condições, mais Bax Ku70 sequestra e protege as células da apoptose mediada por Bax [19]. Para investigar se a inibição acetilação, com a exposição a hipertermia, foi devido à ativação de SIRT-1, analisamos a expressão SIRT-1 após a exposição a hipertermia (0-6 h). A análise por Western blot revelou que SIRT-1 expressão foi induzida por hipertermia em células PC-10 (Figura 4C).. Além disso, SIRT-1 foi imunoprecipitada a partir de lisados ​​de PC-10 células inteiras e, em seguida, submetidos a análise de transferência de Western. A quantidade de Ku70 imunoprecipitados com SIRT-1 foi aumentada pela exposição a hipertermia (Figura. 4C). Da mesma forma, a quantidade de SIRT-1 imunoprecipitado com Ku70 também foi melhorada por exposição a hipertermia (0-6 h), confirmando que Ku70 /SIRT-1 de ligação foi aumentada por hipertermia no PC-10 (células Figure.4D). Especulamos que sobre-regulada SIRT-1, sob condições de hipertermia, liga-se a Ku70 e muda de acetilada a forma desacetilada, que permite Ku70 para sequestrar mais Bax, seja libertada de Bcl-2 ou recém induzida sob hipertermia, para inibir induzido por hipertermia apoptose, finalmente. Estes resultados explicam, pelo menos em parte, por que HDACIs, como NAM, pode aumentar a apoptose por hipertermia, provavelmente, visando algumas HDACs como SIRT-1. Notavelmente, outros histona desacetilases incluindo HDAC6 e SIRT-3, não mostrou mudanças significativas no perfil de expressão após a exposição à hipertermia (Figura. S7). Para confirmar os resultados acima, as células H1299 (com uma eficiência de transfecção relativamente elevada, 50%, como determinado por transfecção Beta gal) foram transfectadas transientemente quer com o tipo selvagem SIRT-1 ou H363Y negativo dominante /SIRT-1. A apoptose induzida por hipertermia foi significativamente aumentado nas células /SIRT-1-transfectadas H363Y comparação para controlar transfectantes vetor (Figura 5A;. P 0,01). Mais importante, as células de tipo selvagem SIRT-1-transfectadas mostraram ligeira mas significativa (P 0,05) a partir de hipertermia protecção nas células testadas, indicando que o efeito anti-apoptótico da exógeno SIRT-1 é significativo mas limitado. Este era provavelmente porque o endógena SIRT-1 tinha provocado a maior parte da protecção espontânea de hyerthermia conforme indicado pelas experiências de conteúdo de DNA (Figura. 5A). Resultados semelhantes foram obtidos a partir da coloração de anexina V; H363Y /SIRT-1 transfecção para células H1299 aumentou significativamente a apoptose após a exposição a hipertermia em comparação com o transfectante de vector vazio (Figura. 5B). Notavelmente, nem de tipo selvagem SIRT-1 nem dominante H363Y negativo /SIRT-1 transfecção mostrou individualmente alterações significativas do ciclo celular.

A

. SIRT-1 está envolvida na citoprotecção de hipertermia. Western blot mostra a-over expressa SIRT-1. A análise FACS de células H1299 após transfecção transitória ou com ampla tipo SIRT-1, negativo dominante SIRT-1 ou expressão FLAG vetor. H363Y /SIRT-1 aumentou significativamente a morte celular induzida por hipertermia enquanto tipo largo SIRT-1 não teve nenhum efeito significativo (painel superior).

B

. Os resultados de coloração de anexina V de células H1299, de experiência similar, confirmando que a morte celular H363Y /-induzida SIRT-1 é a apoptose (painel inferior).

Segmentação Ku70 por morte celular induzida por siARN hipertermia reforçada

Para examinar se Ku70 era um mediador chave na protecção acima mencionada das células de hipertermia, o ARNm Ku70 foi alvo de sequência específica Ku70 siRNA-1, -2. Ku70 ARNm era passível de Ku7 siRNA-1 (por desenho) e em seguida, o nível de expressão da proteína foi significativamente reduzido (dose; 200 nM) em células PC-10 (Figura 6-A.). O siRNA de controle (cont-siRNA-1) transfecção não afetou a expressão Ku70. Além disso, Ku70 siRNA-2-transfecção (ver Materiais e Métodos) foi confirmada para knockdown eficiente Ku70 (Figura. 6A, painel inferior). Em seguida, tanto o knockdown Ku70 (KD) e as células de controlo foram desafiados com a exposição à hipertermia. As células PC Ku70 KD-10 mostraram melhorada morte celular após a exposição hipertermia de uma forma dependente do tempo (Figura. 6B, C) em comparação com o transfectante cont siRNA, dois dias após o tratamento, tal como indicado pela análise de FACS (utilizando Ku70- siRNA-1). Foram obtidos resultados semelhantes com a utilização de células H1299 (Ku70 utilizando siRNA-2 e cont siRNA-2 (Figura. S8)). Estes resultados sugerem que medeia Ku70 citoprotecção contra a exposição hipertermia e provavelmente desempenha um papel-chave na apoptose induzida por hipertermia.

Um

. Um western blot representativo mostra a alteração do Ku70 para ambos os siRNAs utilizados. PC-10 e células H1299 foram transfectadas por um siRNA duas vezes. O resultado mostra ocidental significativa derrubar por Ku70-siRNA-1, -2 comparando com o cont-siRNA-1, -2, respectivamente. imunotransferência actina foi utilizado como um controlo de carga. A experiência foi repetida três vezes independentes para reprodutibilidade. PC-10 As células foram transfectadas com ARNsi-Ku70-1 ou cont siRNA-1 (200 nM) duas vezes. 24 h após a última transfecção, o número de células iguais foram subcultivadas por mais 24 h, e depois tratou-se com hipertermia para intervalos de tempo indicados, e, em seguida, re-se a cultura a 37 ° C durante 24 h (B) ou 48 h (C) As células foram adquiridos pelo analisador FACS para análise do ciclo celular. Os resultados apresentados são uma um representante de, pelo menos, três experimentos independentes para cada ponto de tempo (24 e 48 horas).

D

. Ku70 é necessário para prisão citostático por hipertermia. Os histogramas mostram a acumulação diferencial de populações de células em G2 /M em fases células com ou sem Ku70, um e dois dias após 0, 1, 3 e 6 h do tratamento de hipertermia. Populações em diferentes fases do ciclo celular, G1, S e G2 /M fases, foram calculados usando o computador após o tratamento hipertermia. Os resultados mostrados são uma média de três experiências independentes.

E

. melhoria significativa da coloração de anexina V depois de hipertermia em células Ku70 KD em comparação com controle, indicando que Ku70 morte celular à base de silenciamento por hipertermia é a apoptose. Cada ponto de dados representa a média de três experiências; barras denotam SD; * Indica diferença do transfectante controle em P . 0.001

Ku70 mediada G2 induzida por hipertermia /M acumulação

experimentos de rotulagem de pulso com bromodeoxiuridina (BrdUrd; 20 um) em PC- 10 células indicaram que a exposição a hipertermia induzida prisão citostático mas não citotóxicas (dados não mostrados). A perturbação do ciclo celular induzida por hipertermia foi analisada 24 h e 48 h após 1-6 h exposições a hipertermia. G2 /M subpopulações foram aumentou significativamente 24 h após a exposição à hipertermia e, em seguida, gradualmente diminuída para sub-populações normais 48 h após a exposição a hipertermia (Figura. 6D). Ao mesmo tempo, a percentagem de fase G1 e S subpopulações diminuíram gradualmente de 24 h após a exposição à hipertermia e recuperado 48 horas após a remoção hipertermia.