Abstract

Temos desenvolvido anteriormente modelos Paciente-Derivado do rato de HER-2 câncer cervical -positivo. Os tumores em ratinhos nus tinham estruturas histológicas semelhantes ao tumor original e foram coradas por anti-HER-2 anticorpo no mesmo padrão como o cancro do doente. Também desenvolvemos anteriormente

-alvo tumor Salmonella typhimurium

A1-R e demonstraram sua eficácia contra mouse modelos de tumores de pacientes, tanto isoladamente e em combinação. No presente estudo, determinou-se a eficácia de

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typhimurium

A1-R em combinação com trastuzumab em um modelo nu-rato-paciente de câncer de HER-2 positivo cancro cervical. Os murganhos foram distribuídos aleatoriamente em 5 grupos e tratado como se segue: (1) nenhum tratamento; (2) carboplatina (30 mg /kg, ip, semanais, 5 semanas); (3) o trastuzumab (20 mg /kg, ip, semanalmente, 5 semanas); (4)

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A1-R (5 × 10

7 UFC /corpo, ip, semanal, 5 semanas); (5)

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A1-R (5 × 10

7 CFU /corpo, IP, semanalmente, 5 semanas) + trastuzumab (20 mg /kg, ip, semanalmente, 5 semanas). Todos os regimes em que a eficácia significativa em comparação com os ratos não tratados. O volume relativo do tumor do

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typhimurium

A1-R + camundongos tratados com trastuzumab foi menor em comparação com somente trastuzumab (p = 0,007) e

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A1-R sozinho (p = 0,039). Sem perda de peso corporal significativa foi encontrada em comparação com o grupo sem tratamento, excepto para os ratinhos tratados com carboplatina (p = 0,021). Ao exame histológico, as células tumorais viáveis ​​não foram detectadas, e substituídas por células do estroma nos tumores tratados com

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A1-R + trastuzumab. Os resultados do presente estudo sugerem que

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A1-R e trastuzumab em combinação são altamente eficazes contra HER-2 expressando câncer cervical

Citation:. Hiroshima Y, Zhang Y, Zhao M, Zhang N, Murakami T, Maawy Um, et ai. (2015) Tumor-Segmentação

Salmonella typhimurium

A1-R em associação com trastuzumab Erradica células HER-2 positivo câncer cervical em paciente Derivado de modelos de ratos. PLoS ONE 10 (6): e0120358. doi: 10.1371 /journal.pone.0120358

Editor do Academic: Juri G. Gelovani, Wayne State University, Estados Unidos

Recebido: 26 Setembro, 2014; Aceito: 20 de janeiro de 2015; Publicação: 05 de junho de 2015

Direitos de autor: © 2015 Hiroshima et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Dados Disponibilidade: Todos os dados subjacentes os achados deste estudo estão disponíveis gratuitamente no papel. Quaisquer dúvidas podem ser encaminhadas para os autores ([email protected])

Financiamento:. Este estudo foi apoiado em parte pelo Instituto Nacional do Câncer CA132971 números de subvenção CA e os números de concessão CA142669 e JSPS KAKENHI 26.830.081 para YH, 26.462.070 para IE e 24592009 para KT. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Yong Zhang, Ming Zhao e Nan Zhang são funcionários da AntiCancer Inc. Yukihiko Hiroshima, Takashi Murakami, Mako Yamamoto, Shinji Miwa, Shuya Yano, e Robert M. Hoffman são afiliadas não pagas de AntiCancer Inc. Sumiyuki Mii, Fuminari Uehara, Masashi Momiyama e Takashi Chishima foram ex-filiais da AntiCancer Inc. Robert M. Hoffman é um PLOS ONE Membro do Conselho Editorial. AntiCancer Inc. comercializa modelos animais de câncer. Não há outros interesses concorrentes. Não há patentes, produtos em desenvolvimento ou produtos comercializados a declarar. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

O câncer cervical é o segundo câncer mais comum em mulheres [1]. Havia 454.000 casos e 200.000 mortes em 2010 em todo o mundo e 11.000 novos casos e 3.870 mortes por carcinoma do colo do útero em os EUA [2, 3]. O paclitaxel, carboplatina, cisplatina, bleomicina, mitomicina-C, vincristina e o irinotecano são utilizados para o cancro do colo do útero [4]. No entanto, não há nenhum tratamento padrão para o cancro do colo do útero.

A incidência de HER-2 positivo no cancro do colo do útero foi relatado a partir de 1% a 21% [5], e a sobre-expressão de HER-2 tem sido associada com mais estágios avançados e um pior prognóstico [6, 7]. modelos de rato

Nós anteriormente desenvolvidos de HER-2 positivo cancro cervical do paciente [8]. Nosso laboratório também desenvolveu anteriormente uma cepa de bactérias geneticamente modificadas,

Salmonella typhimurium

A1-R, selecionado para tumor-alvo in vivo.

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A1-R é auxotróficas para leu e arg [9]. As metas de tensão e cresce em tumores. Em contraste, o tecido normal é apagada destas bactérias, mesmo em camundongos atímicos imunodeficientes.

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A1-R é eficaz contra câncer de próstata [10], o cancro da mama [11, 12], câncer pancreático [13-16], glioma [17, 18], câncer de pulmão [19], fibrossarcoma [ ,,,0],20, 21], osteossarcoma [22] e do ovário [23].

no presente estudo, demonstramos a eficácia de

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A1-R em combinação com trastuzumab em modelos de ratos com câncer cervical paciente expressando HER-2.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

Todos estudos com animais foram realizados com uma Comissão AntiCancer Institutional animal Care e Uso (IACUC) -protocol aprovado especificamente para este estudo e de acordo com os princípios e procedimentos descritos no Instituto Nacional de Saúde Guia para o Cuidado e Uso de Animais sob Assurance Número A3873 -1. A fim de minimizar o sofrimento dos animais foram utilizados a utilização de anestesia e analgésicos para todas as experiências cirúrgicos. Os animais foram anestesiados por injecção intramuscular de uma solução de 20 mg /kg de cetamina, 15,2 mg /kg de xilazina, e 0,48 mg /kg de acepromazina maleato de 0,02 ml. A resposta dos animais durante a cirurgia foi monitorizada para assegurar adequada profundidade da anestesia. Ibuprofeno (7,5 mg /kg por via oral na água de beber a cada 24 horas, durante 7 dias pós-cirurgia) foi utilizado a fim de proporcionar analgesia pós-operatório nos animais tratados cirurgicamente. Os animais foram observados diariamente e humanamente sacrificados por CO

2 inalação quando se encontraram os seguintes critérios endpoint humanas: prostração, lesões de pele, perda significativa de peso corporal, dificuldade respiratória, epistaxe, movimento de rotação e queda de temperatura corporal. A utilização de animais foi necessário entender a eficácia in vivo, em especial a eficácia, anti-metastático dos agentes testados. Os animais foram alojados com não mais do que 5 por gaiola. Os animais foram alojados em uma instalação de barreira em um ar de alta eficiência (HEPA) cremalheira filtrado por sob condições padrão de 12 horas ciclo claro /escuro. Os animais foram alimentados com uma dieta de laboratório roedores autoclavada (Supl. Informações S1).

Animais

atímicos fêmea (

nu /nu

) ratos sem pêlo (AntiCancer, Inc., San Diego, CA), 4-6 semanas de idade, foram utilizados neste estudo. Os ratos foram mantidos em uma instalação de barreira sob a filtração HEPA. Os ratinhos foram alimentados com uma dieta de roedores autoclavada de laboratório. Todos os procedimentos cirúrgicos do rato e de imagem foram realizados com os animais anestesiados por injecção intramuscular de uma solução de 20 mg /kg de cetamina, 15,2 mg /kg de xilazina, e 0,48 mg /kg de acepromazina maleato de 0,02 ml. Todos os estudos com animais foram realizados com uma Comissão AntiCancer Institutional Animal Care e Uso (IACUC) -protocol aprovado especificamente para este estudo e de acordo com os princípios e procedimentos descritos no Instituto Nacional de Saúde Guia para o Cuidado e Uso de Animais sob Assurance Número A3873-1.

cOLETA

o paciente forneceu consentimento informado por escrito e a amostra de tumor foi obtido sob a aprovação do Conselho de revisão Institucional da Universidade da Califórnia em San Diego.

a implantação subcutânea de cancro cervical paciente

os tecidos tumorais foram obtidas a partir do paciente com cancro do colo do útero HER-2 positivo no momento da cirurgia e cortados em fragmentos de (3-mm

3) e transplantadas subcutaneamente em ratinhos nus [ ,,,0],8].

Tissue histologia

o tecido tumoral foi removido juntamente com os tecidos circundantes normais no momento da ressecção. Os tecidos foram fixados em formalina a 10% e embebidos em parafina antes de seccionamento e coloração. As secções de tecido (3? M) foram desparafinados em xileno e re-hidratadas numa série de etanol. (H E) hematoxilina e eosina foi realizada de acordo com protocolos padrão. Para imuno-histoquímica, secções (5 um) foram então tratadas durante 30 min com peróxido de hidrogénio (0,3%) para bloquear a actividade da peroxidase endógena. As secções foram depois lavadas com PBS e desmascarada em solução de antigénio-desmascaramento citrato (Mitsubishi Kagaku Iatron, Inc., Tóquio, Japão) num banho de água durante 40 min a 98 ° C. Após a incubação com soro de cabra normal a 10%, as secções foram incubadas com anti-HER-2 /ErbB2 (1: 100; Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA, EUA) a 4 ° C durante a noite. A ligação dos anticorpos primários foi detectado utilizando anticorpos secundários anti-coelho e um complexo de avidina /biotina /peroxidase de rábano (Dako Cytomation, Quioto, Japão) durante 30 min à temperatura ambiente. Os antigénios marcados foram visualizados com o kit de DAB (Dako Cytomation). Finalmente, as secções foram contrastadas com hematoxilina e examinadas com um microscópio BH-2 (Olympus, Tóquio, Japão) equipado com um INFINITY1 2.0 megapixels CMOS câmera digital (Lumenera Corporation, Ottawa, Canadá). Todas as imagens foram obtidas usando INFINITY ANALISAR software (Lumenera Corporation) sem processamento pós-aquisição.

O tratamento de câncer cervical paciente crescendo em camundongos nus

Seis semanas após a implantação, os ratos foram randomizados para 5 grupos e tratado como se segue: (1) nenhum tratamento; (2) carboplatina (Selleck Chemicals, Houston, TX, EUA, 30 mg /kg, ip, semanais, 5 semanas); (3) o trastuzumab (Genentech, Inc., South San Francisco, CA, EUA, 20 mg /kg, ip, semanalmente, 5 semanas); (4)

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A1-R (5 × 10

7 UFC /corpo, ip, semanal, 5 semanas); e (5)

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A1-R (5 × 10

7 CFU /corpo, IP, semanalmente, 5 semanas) + trastuzumab (20 mg /kg, ip, semanalmente, 5 semanas) foram co-administrados. Cada grupo de tratamento compreendia 6 ratos portadores de tumor. O tamanho do tumor foi avaliada a cada 3 ou 4 dias por medições de calibrador e o volume aproximado do tumor foi calculado utilizando a fórmula 4 /3π (d /2)

2 D /2; onde d é o eixo menor do tumor e D é o eixo maior do tumor. O peso corporal dos murganhos foi medido no equilíbrio a cada 3 ou 4 dias. o volume relativo do tumor e peso corporal, foram calculados por comparação com os valores do dia-1. Os tumores foram fotografadas com uma câmera digital Canon EOS 60D com um EF-S18-55 É lente (Canon, Tóquio, Japão) e colhidas para análise.

Avaliação da resposta histopatológica

resposta histopatológica para quimioterapia foi definida de acordo com o esquema de classificação de Evans: Grau I, pouco ( 10%) ou nenhuma destruição de células tumorais é evidente; Grau II, uma destruição de 10% -50% das células tumorais; Grau II b, a destruição de 51% -90% das células tumorais; Grau III, poucos ( 10%) as células tumorais viáveis ​​que aparecem estão presentes; Grau IV, sem células tumorais viáveis ​​estão presentes [24, 25].

A análise estatística

PASW Statistics 18.0 (SPSS, Inc) foi usado para todas as análises estatísticas. volume final do tumor (no dia-36) em cada grupo de tratamento foram comparados com o controlo não tratado usando uma de Student de 2 bicaudal

t

-test. Um valor de p ≤ 0,05 foi considerado estatisticamente significativo em todas as comparações.

Resultados e Discussão

Histologia do tumor original é preservada no rato

Folha de crescimento semelhante sem formação de glândula e tecido estromal com proliferação de fibroblastos, que penetrou em ninhos de células cancerosas foi observada na H e manchado seções do tumor original (Fig 1A). Oval- às células cancerosas fusiformes com alta relação nuclear /citoplasmático foram encontrados em imagens de ampliação elevadas (Fig 1B). Nas secções imunocoloração com anti-HER-2 anticorpo, a membrana e citoplasma das células cancerosas foram fortemente coradas, mas nenhuma coloração foi encontrado no tecido do estroma (Fig 1C e 1D). Todos os tumores de pacientes cervical crescido-rato tinham estruturas histológicas semelhantes ao tumor original e foram coradas por anti-humano de HER-2 anticorpo (Fig 1E-1H), sugerindo que o modelo recapitula o comportamento biológico do tumor original [8] .

(A) H seção do tumor original paciente E-manchada. (B) Imagem de alta ampliação de (A). (C) imunocoradas secção de tumor do paciente original, utilizando anticorpo anti-HER-2. (D) Imagem de alta ampliação de (C). (E) H seção do tumor cresceu rato-E-manchada. (B) Imagem de alta ampliação de (F). secção (G) imunocoradas do tumor cresceu-rato utilizando um anticorpo anti-HER-2. (H) A imagem de alta ampliação de (L). Barras de escala: 200 mm (A, C, E e G) e 25 mm (B, D, F e H)

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typhimurium

combinação trastuzumab A1-R + é eficaz contra o cancro do colo do útero derivado do paciente crescendo em camundongos nus

Os volumes relativos de tumor no dia-36, em comparação com o dia-1, de cada grupo foram como se segue: (1) nenhum tratamento: 10,23 ± 2,91; (2) carboplatina: 1,02 ± 0,43; (3) trastuzumab: 1,23 ± 0,50; (4)

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A1-R: 0,54 ± 0,40; (5)

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A1-R + trastuzumab: 0,08 ± 0,04 (Fig 2A). Todos os regimes em que a eficácia significativa em comparação com os ratos não tratados. O volume relativo do tumor do

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A1-I + ratinhos tratados com o trastuzumab foi menor do que com o tratamento com trastuzumab sozinho (P = 0,007) ou

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A1-R sozinho tratamento (p = 0,039) (Figura 2A).

(A) curvas de crescimento do tumor subcutâneo tratada com várias drogas. Os valores são a média ± volumes do tumor em relação S.D. (barras) de cinco diferentes tumores. * P 0,05, ** p 0,01. curvas (B) do peso corporal dos ratinhos com tumores subcutâneos tratados com os fármacos indicados. Os valores são os pesos corporais relativos médios ± S.D. (barras) de cinco ratinhos diferentes

O peso corporal relativa ao dia 36, ​​em comparação com o dia-1, de cada grupo, foi o seguinte: (1) nenhum tratamento:. 1,13 ± 0,14; (2) carboplatina: 0,93 ± 0,06; (3) trastuzumab: 1,04 ± 0,22; (4)

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A1-R: 1,09 ± 0,06; (5)

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A1-R + trastuzumab: 1,00 ± 0,08. Sem perda de peso corporal significativa foi encontrada em comparação com os ratinhos não tratados, excepto para ratinhos tratados com carboplatina (p = 0,021) (Fig 2B).

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combinação trastuzumab A1-R + erradica HER-2 positivas células de câncer cervical em ratos como observado nos cortes histológicos

resposta histopatológica ao tratamento foi definida de acordo com o sistema de classificação de Evans. Em secções de tecido de ratos não tratados, as células cancerosas foram observadas numerosas (Figura 3F). Aproximadamente 30% das células cancerosas foram destruídas e substituídas por células do estroma em secções de tecidos a partir de ratinhos tratados com carboplatina (figura 3G). Setenta por cento das células cancerosas foram destruídos nas secções de tecido de ratinhos tratados com trastuzumab (Figura 3H). Sessenta por cento das células cancerosas foram destruídas nas secções de tecidos de camundongos tratados com

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A1-R (Fig 3I). Nas seções de tecido de ratinhos tratados com

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A1-I + trastuzumab, as células cancerosas foram viáveis ​​não foi detectado e foram substituídas por células do estroma (Fig 3J). O controlo não tratado foi julgado como grau I; carboplatina tratamento IIa; tratamento com trastuzumab como IIB;

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tratamento A1-R como IIb; e

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tratamento trastuzumab A1-R + como III-IV. Estes resultados sugerem a

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combinação trastuzumab A1-R + pode erradicar HER-2 positivo cancro cervical em ratos.

(A) controlo não tratados. (B) Carboplatina-ratinhos tratados. (C) ratos tratados com trastuzumab. (D)

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ratinhos tratados A1-R. (E)

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A1-R + camundongos tratados com trastuzumab. Estas imagens foram obtidas no dia-36. Barras de escala: 10 mm. resposta histopatológica ao tratamento foi definida de acordo com o sistema de classificação de Evans. Efeito do tratamento com a ausência de tratamento (F) foi julgado como grau I; carboplatina (G) como IIa; trastuzumab (H) como IIB;

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A1-R (I) tal como IIb; e

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A1-R + trastuzumab (J) como III-IV. Barras de escala:. 200 mm

Os mecanismos do forte eficácia da combinação de

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A1-R e trastuzumab continua a ser elucidado. Um fator que contribui poderia ser a capacidade de

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A1-R para estimular (engodo) o ciclo celular de células quiescentes, resistentes, que, em seguida, começar a ciclo e tornar-se sensível ao trastuzumab [26]. Tendo encontrado a forte eficácia da combinação de

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A1-R e trastuzumab em modelos subcutâneos, futuros experimentos irá utilizar modelos ortotópicos, usando a implantação ortotópica cirúrgica (SOI) Método nosso laboratório tem desenvolvido para tumores de pacientes [27-32]. O acesso de

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A1-R para tumores ortotópicos foi previamente demonstrado por nós [8-24]. O acesso à terapia de trastuzumab em modelos ortotópicos já foi demonstrado por nós também [33]. Os modelos orthothopic de uma série de HER-2 positivo e misturado HER-2 expressando o cancro do colo do útero vai permitir testes de eficácia da combinação de

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A1-R e trastuzumab contra doença primária e metastático e caracterização adicional do estroma e células cancerosas antes e após o tratamento, bem como os efeitos dos regimes de empobrecimento de leucócitos seguintes ou antes do tratamento. SOI requer cirurgia e uma vez que a cetamina pode afetar o sistema imunológico, diferentes anestésicos serão comparados para qualquer efeito sobre a resposta ao tratamento em experimentos futuros.

Reconhecimentos

Este artigo é dedicado à memória de AR Moossa , MD