Sumário

Muitos medicamentos contra o câncer são destinadas a matar as células cancerosas através da indução de apoptose. No entanto, os ensaios de potência utilizado para medir a bioactividade destes produtos são geralmente os ensaios de viabilidade de células que não distinguem entre a morte celular e inibição do crescimento. Descrevemos aqui um biossensor de transferência de energia de ressonância de fluorescência com base em células (FRET) concebido para medir a bioactividade da apoptose induzindo medicamentos contra o câncer. O biosensor contém proteína fluorescente ciano (PCP) ligado através de caspase 3 e caspase 8 sequências de reconhecimento específico de clivagem para a proteína fluorescente amarela (YFP). Após a activação de caspase, como no caso de indução de apoptose, o ligante é clivado que suprime o sinal de FRET celular. Este ensaio reflecte estreitamente o mecanismo de acção de medicamentos contra o cancro, para matar células cancerosas e, por conseguinte, pode funcionar como um teste de potência para diferentes medicamentos contra o câncer. Nós rigorosamente demonstrar isso através da caracterização de uma classe de proteínas que se dirigem aos receptores de morte. O ensaio de uma etapa parece ser superior a outros ensaios baseados em apoptose devido à sua simplicidade, conveniência e robustez

Citation:. Bozza WP, Di X, Takeda K, Rivera Rosado LA, Pariser S, Zhang B (2014) o uso de um FRET Biosensor estavelmente expressa para determinação da potência de câncer de drogas. PLoS ONE 9 (9): e107010. doi: 10.1371 /journal.pone.0107010

editor: Xu Wei, da Universidade de Wisconsin – Madison, Estados Unidos da América

Recebido: 28 Abril de 2014; Aceito: 10 de agosto de 2014; Publicação: 04 de setembro de 2014

Este é um artigo de acesso aberto, livre de todos os direitos autorais e pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita. O trabalho é feito disponível sob a dedicação de domínio público da Creative Commons CC0

Data Availability:. Os autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados são incluídos dentro do papel

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pela Food and Drug Administration, Centro de Avaliação e Pesquisa de Drogas, a Critical Path fundo de iniciativa; ea Food and Drug Administration, Centro de Avaliação e Pesquisa de Drogas, fundo de Iniciativa Countermeasure Medical. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a potência é uma medida da actividade de uma droga em termos de concentração ou a quantidade necessária para produzir um efeito biológico definido [1]. Por conseguinte, um ensaio de potência deve ser concebido de modo a reflectir, tanto quanto possível, os mecanismos de acção de um fármaco. Para drogas oncogénicos, que se destinam a matar as células cancerígenas, um ensaio de potência seria uma medida da citotoxicidade da droga nas células cancerosas. Historicamente, muitos agentes quimioterapêuticos foram identificados por rastreio de alto rendimento de bibliotecas de compostos, utilizando ensaios de viabilidade celular com MTT (brometo de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio) ou outros corantes relacionados, [2], [3]. Este formato de ensaio tem sido amplamente adoptada como um teste de potência no desenvolvimento de medicamentos contra o câncer. No entanto, ensaios de viabilidade celular não pode distinguir entre a morte celular e efeitos paragem do crescimento, deixando uma ressalva na avaliação da verdadeira bioactividade de um medicamento para o câncer. Como o objectivo da terapia do cancro é o de matar as células cancerígenas, que é fundamental para avaliar a capacidade de um fármaco para induzir a morte de células de cancro. A forma de morte celular mais comumente associado com o tratamento do câncer, tanto

in vivo

e

in vitro

é a apoptose, ou morte celular programada.

Uma característica da apoptose é a a activação de caspases de proteases, o que resulta na clivagem de proteínas estruturais e a formação de corpos apoptóticos [4]. Existem duas vias distintas, a saber, intrínsecas e extrínsecas, que levam à activação da caspase em resposta a um tratamento medicamentoso. quimioterapias clássicas, tais como etoposido, compactina, fluorouracilo (5-FU), taxol, camptotecina e induzir a activação de caspase 3 de um modo dependente da p53 [5] – [7], que envolve frequentemente alterações mitocondriais. Por outro lado, uma nova classe de proteínas que se dirigem aos receptores de morte expressas na superfície da célula estão em desenvolvimento [8] – [11]. Estas proteínas incluem o factor de necrose de tumor humano recombinante (TNF) variantes, o ligando relacionado com TNF indutores de apoptose (TRAIL) e anticorpos agonistas de receptores de morte. TRAIL se liga ao receptor de morte 4 e /ou 5 (DR4 /5) e, subsequentemente, induz a montagem de uma proteína proteína adaptadora contendo complexo de sinalização (DISCO) indução da morte por Fas associada à morte de domínio (FADD) e pró-caspase 8. Dentro a DISC, caspase-8 Pro torna-se activado por auto-clivagem e é libertada para o citosol onde activa da caspase 3. Em alguns tipos de células, a sinalização apoptótica é adicionalmente amplificado

através

as mitocôndrias, como resultado do translocação de caspase 8 de clivagem mediada de Bid (BH3 proteína interagindo-domain). Assim, a potência de uma droga de cancro pode ser avaliada por medição da magnitude da actividade da caspase em células tratadas. Uma abordagem para medir a actividade da caspase tem sido a utilização de sondas fluorescentes que contêm os substratos de caspases, que indica as alterações na intensidade de fluorescência após a activação da caspase [12] – [16]. Alternativamente, as caspases activas podem ser detectados por análise de imunotransf erência usando anticorpos específicos para a forma clivada da enzima indivíduo [14], [17] – [19]. No entanto, estes ensaios podem ser associados, com grande variabilidade devido a procedimentos de operação complexa. No presente estudo, nós desenvolvemos um ensaio de FRET base de células para testar a potência dos produtos de cancro. A sonda FRET contém sequências de reconhecimento para tanto de caspase 3 e caspase 8 e verificou-se ser sensíveis em relação à droga de cancro que actuam por meio de vias intrínseca ou extrínseca. Notavelmente com a sonda FRET expressa estavelmente, a resposta induzida por drogas é monitorizada directamente sobre as células tratadas sem passos adicionais de processamento. Além disso, o ensaio FRET detecta células em apoptose com acentuada sensibilidade e simplicidade experimental, tornando-se um ensaio de potência promissora para a avaliação de medicamentos contra o câncer.

Materiais e Métodos

As linhas celulares e reagentes

linha de células de cancro da mama humano MDA-MB-231 foi adquirido da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Um plasmídeo pCMV6-AC para a expressão de uma proteína de fusão (552 aminoácidos) contendo de comprimento completo da proteína ciano fluorescente (PCP) e amarelo proteína fluorescente (YFP), ligado através de uma sequência de reconhecimento de caspase foi comprado de OriGene (Rockville, MD). O ligante entre PCP e YFP contém dezasseis aminoácidos, GSGDEVDGGIETDGSG, que podem ser clivados por caspase 3 em L activada ↓ DEVD ou caspase 8 em G ↓ IETD, onde ↓ indica local de corte de protease. A sequência de cDNA codificadora (1656 pares de bases) para a proteína de fusão PCP-ligante-YFP foi clonado no vector pCMV6-AC em Sgf I e Mlu I locais de restrição, e a construção correcta foi verificada por sequenciação de nucleótidos. O plasmídeo foi transfectado em células MB231 utilizando Lipofectamina reagente de 2000 por instruções do fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA). As células transfectadas foram seleccionadas contra a neomicina (G418) a 1 mg /ml (Corning Cellgro, Manassas, VA). Os clones resistentes a G418 foram colhidos utilizando cilindros de clonagem (Millipore, Temecula, CA) e testados para os níveis de intensidade de fluorescência e de expressão de proteínas. O clone estável com os níveis mais altos da sonda PCP-ligante-YFP, referido como MB231_CFP-YFP expressão, foi utilizada nos ensaios seguintes. As células foram mantidas em meio DMEM /F-12 50/50 meios suplementados com FBS a 5%, 4 mM de L-glutamina, piruvato de sódio 1 mM e 0,4 mg /ml de sulfato de G418. células parentais MB231 foram cultivadas no mesmo meio sem a adição de sulfato de G418. Ambos TRAIL humano recombinante (rhTRAIL, Cat # 375-TEC) e um anticorpo monoclonal (Cat # MAB631) agonista específico para o receptor de morte 5 foram adquiridos a partir de R D systems (Minneapolis, MN). O rhTRAIL existe como um homotrímero, em que cada monómero consiste nos aminoácidos 114-281 do domínio extracelular de TRAIL humano nativo. Estaurosporina foi comprado de ApexBio (Boston, MA). A camptotecina e etoposido foram adquiridos a Sigma (St. Louis, MO). 5-FU foi comprado de Enzo Life Sciences (Farmingdale, NY). Compactina foi adquirido de Santa Cruz (Dallas, Texas). O taxol foi adquirido de Calbiochem (La Jolla, CA).

A viabilidade celular ensaio

A viabilidade celular foi determinada utilizando um grupo 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5 -diphenyltetrazolium brometo (MTT) ensaio colorimétrico tal como previamente descrito [20]. Resumidamente, 1,0-2,0 × 10

4 células foram semeadas em cada poço de microplacas de 96 cavidades. As células foram em seguida tratadas com o agente citotóxico. Após tratamento medicamentoso, o meio de cultura celular foi aspirado e MTT (brometo de 2 mg /ml em tampão PBS) foi em seguida adicionado a cada poço e foi incubado durante 2 h a 37 ° C. O sobrenadante foi depois aspirado e o produto de formazano insolúvel foi dissolvido em DMSO. Absorvância para a coloração de formazano foi medida a 562 nm utilizando um SpectraMax 384 Além disso leitor de microplacas (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Relativa OD

562 para cada poço foi representada graficamente contra o valor log da concentração do agente citotóxico no molar. CE

50 valores foram determinados através do ajuste da curva de dose-resposta para a equação 1, Y = Fundo + (Topo-Fundo) /(1 + 10∧ ((LogEc

50-X) * hillslope)), usando o o software GraphPad Prism. O símbolo X representa o logaritmo da concentração do agente citotóxico no molar e o símbolo Y representa o valor de absorção medidos. Cada ponto de dados foi repetida em triplicado.

A citometria de fluxo

3,0 × 10

5 células foram cultivadas em cada poço de placas de 6 cavidades. As células foram tratadas com TRAIL ou anticorpo anti-DR5. As células foram então colhidas, coradas com anexina-V-APC (eBioscience, San Diego, CA) e iodeto de propídio (PI, St Louis, MO), e analisadas utilizando um fluxo BD Accuri C6 citómetro (BD, Franklin Lakes, NJ) [ ,,,0],21].

a análise de imunotransferência

análise de Western blot foi realizada tal como anteriormente descrito [19]. Resumidamente, as células foram lisadas utilizando um tampão RIPA [Tris-HCl 0,5 M (pH 7,4), NaCl 1,5 M, ácido 2,5% desoxicólico, 10% de NP-40, EDTA 10 mM, e um cocktail de inibidor de protease] (Merck, Darmstadt, Alemanha ). Os detritos celulares foram removidos por centrifugação e a quantidade total de proteína foi determinado pelo ensaio BCA (Pierce, Rockford, IL). quantidade igual de proteína (30 ug) foi resolvido por SDS-PAGE utilizando NuPAGE 4-12% de gradiente de gel de Bis-Tris (Invitrogen, Carlsbad, CA) e transferidas para membranas de PVDF. Os anticorpos específicos para PCP e YFP foram de Covance (Gaithersburg, MD), os anticorpos específicos para a caspase 8 e caspase 3 foram de Cell Signaling (Danvers, MA), e os anticorpos específicos para actina foram de Santa Cruz (Dallas, TX). anti-ratinho conjugado com peroxidase, anti-coelho, ou IgG anti-cabra, foram utilizados como anticorpos secundários. detecção de immunoblot foi visualizada por Immobilon Ocidental Quimioluminescentes HRP Substrato (Millipore, Billerica, MA) e um sistema de câmera CCD LAS-4000 (Fujifilm, Edison, NJ).

baseada em celular FRET ensaio de citotoxicidade

×

4 sup células MB231_CFP-YFP foram cultivadas em cada poço de uma microplaca preta 96 bem. Depois as células foram cultivadas durante a noite, o meio de cultura celular foi aspirado e tampão de PBS contendo agente citotóxico (TRAIL, anticorpo anti-DR5, ou estaurosporina) foram adicionados a células aderidas para pontos de tempo indicados. Devido à exigência de um período de incubação mais longo para tratamento camptotecina, as células foram tratadas com meio DMEM contendo a droga citotóxica durante 48 h antes da substituição do meio com tampão PBS e permitindo a incubação prosseguir durante mais 24 horas. Este procedimento foi igualmente executado para etoposido, compactina, 5-FU, e o taxol. Após o tratamento o medicamento FRET sinal de cada amostra foi determinada utilizando um leitor de placas de fluorescência FluoDia T70 (PTI, Edison, NJ). As células tratadas foram animado usando um filtro de excitação de 425 ± 10 nm. Para a determinação FRET, após a subtracção de fundo, foram calculados índices de emissão de YFP (530 ± 5 filtro nm) e PCP (486 ± 5 filtro nm). Os valores foram normalizados FRET e representados graficamente contra o valor log da concentração do agente citotóxico no molar utilizando o software GraphPad Prism. CE

50 valores foram determinados por meio de curva não linear adequado para a equação 2, Y = 100 /(1 + 10∧ ((LogEc

50-X) * Colina Slope)). O símbolo X representa o logaritmo da concentração do agente citotóxico no molar e o símbolo Y representa o valor normalizado de FRET. Cada ponto de dados foi repetida em triplicado para uma única experiência e cada experiência foi repetida pelo menos duas vezes de forma independente.

A caracterização bioquímica da sonda FRET

Para caracterizar a expressão da PCP-ligante-YFP sonda , a proteína expressa foi isolado utilizando o anticorpo anti-PCP /YFP. Resumidamente, 1,2 × 10

6 células MB231_CFP-YFP foram colhidas e lisadas em 1 ml de tampão de imunoprecipitação Pierce lise. 25 ul de anticorpo anti-PCP /YFP conjugados a Sepharose (Abcam, Cambridge, MA) foi rodado com lisado celular livre de detritos durante 3 h a 4 ° C. Após lavagem com tampão de lise, sonda ligante-YFP FRET CFP- ligada foi eluída com tampão Tris 50 mM (pH 8,5) contendo NaCl 1M. Imediatamente após a eluição da proteína foi diluída com tampão Tris para se obter uma concentração final de NaCl de 300 mM. A pureza da proteína foi visualizado por SDS-PAGE e coloração com azul de Coomassie e por análise de imunotransferência utilizando anticorpos específicos para o PCP e YFP (descrito acima).

Para

In vitro

FRET ensaios, imuno-purificado PCP sonda ligante-YFP FRET foi incubada com a caspase activa 3, caspase 8, ou caspase 2 (R D systems, Minneapolis, MN) durante 3 h a 25 ° C em tampão de PBS contendo 1 mM de DTT usando negro microplacas de 96 cavidades. Como um controlo de Z-VAD também foi adicionado para algumas reacções. FRET foi medida como descrito acima.

A microscopia confocal

1,5 × 10

4 células MB231_CFP-YFP foram cultivadas em 4 sistemas de borosilicato lamela bem câmaras (Nunc, Rochester, NY) para um dias antes da experiência. As células foram tratadas com várias concentrações de TRAIL (0-25 ng /ml) durante 2,5 h antes de imagem. As células foram fotografadas com uma lente objetiva de 63x e uma Observer celular Zeiss Spinning sistema Disk Confocal Microscope (Thornwood, NY) com uma câmara ambiental Pecon. FRET eficácia foi determinada através da detecção de emissões sensibilizado [22], [23]. linhas de laser de excitação com um comprimento de onda de 458, 514, e 458 nm foram utilizados para PCP dador, aceitador de YFP, e canais de FRET, respectivamente. O filtro de emissão para o PCP foi 485/30 enquanto o filtro de emissão para YFP e FRET foi 535/30. divisor de feixe dicróico para a cabeça Yokogawa confocal de varredura foi RIFT 457/514/647 nm. Após a obtenção dos factores de correcção para PCP expressa isoladamente e YFP, imagens de células foram adquiridas células MB231_CFP-YFP através PCP, YFP, e FRET canais de uma maneira idêntica. conjuntos de dados de 9 imagens foram armazenadas como formato de Zvi para análise quantitativa futuro. software Zeiss Axiovision (Ver. 4.8.2) foi utilizada para a emissão sensibilizado medição de FRET. A eficiência de TERF foi calculada com base num sistema de três-filtro, o qual é normalizado contra intensidades de dadores e aceitadores, o que permite o cálculo de diafonia e a verificação do sinal de FRET verdadeiro [24], [25]. O valor da eficiência de FRET foi calculada segundo a fórmula de Xia [24]. Três imagens seleccionadas aleatoriamente foram obtidos para cada experimento. A partir dessas imagens foi calculada a eficiência FRET. Duas a três regiões de interesse (ROI) foram colocados para uma respectiva célula e dez a quinze ROIs foram submetidos a FRET análise.

Resultados

Geração de um biosensor FRET baseado em células

MB231 células de cancro da mama humanas foram transfectadas de forma estável com uma proteína de fusão PCP-ligante-YFP plasmídeo de expressão que codifica (MB231_CFP-YFP), em que o PCP funciona como um doador e YFP como um aceitador para a transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET). O ligante contém ambas as sequências caspase 3 e caspase 8 de reconhecimento, DEVD e IETD, respectivamente, que se espera que sejam sensíveis às drogas funcionando

via

tanto intrínseca ou extrínseca vias de apoptose. Após a ativação caspase seguir o tratamento medicamentoso, o ligante que liga PCP e YFP será cindido e, posteriormente, irá processar uma perda de sinal FRET celular. Esta metodologia permite a um biossensor de FRET poderoso que serve como um marcador de apoptose (Figura 1A). A linha celular MB231 foi escolhido como um substrato celular, porque foi demonstrado ser totalmente susceptível a uma variedade de agentes citotóxicos, o que implica a integridade funcional da maquinaria apoptótica [3], [18]. Uma tal plataforma celular está prevista para ser útil para analisar a potência de diferentes medicamentos contra o câncer.

(A) Representação esquemática do ensaio de FRET. A sonda FRET, CFP-ligante-YFP, é expressa como uma proteína de fusão contendo PCP e YFP ligadas através de uma sequência de péptido de 16 aminoácidos: GSGDEVDGGIETDGSG. A região ligante contém sequências de reconhecimento para a caspase 3 (DEVD) e caspase 8 (IETD), que pode ser clivado selectivamente por enzimas seus respectivos após indução de apoptose vias intrínsecas e /ou extrínsecos. (B) A análise de imunotransferência de sonda PCP-ligante-YFP FRET expressa de forma estável em células MB231. (C) As células que expressam sonda ligante-YFP FRET CFP- produzido um sinal significativo de FRET e estável, as células foram incubadas em tampão PBS, durante 0-24 h. (D) A sonda de ligante-YFP FRET CFP- foi imunopurificada a partir de lisado de células MB231_CFP-YFP e visualizadas por SDS-PAGE e coloração com Azul de Coomassie (topo) ou por análise de imunotransferência (parte inferior). (E) alterações no FRET foram monitorados quando 100 nM purificado proteína ligante-YFP CFP- foi incubado com 100 nM recombinante caspase activa 3 (C3), caspase 8 (C8), ou caspase 2 (C2) por 3 h. pvalues ​​foram determinados utilizando um teste t de Student.

Em primeiro lugar, confirmou a expressão da sonda ligador-YFP FRET CFP- por análise de imunotransferência, utilizando um anticorpo primário que reconhece PCP e YFP. Observou-se uma banda forte específico para proteína PCP-ligante-YFP intacta (peso molecular esperado de 55 kDa) no lisado de células MB231_CFP-YFP mas as células parentais não (Figura 1B). Em seguida nós determinar se as células MB231_CFP-YFP poderia fornecer um sinal FRET razoável. A fim de eliminar inferência a partir de componentes do meio, meio de cultura celular foi aspirado a partir de células MB231_CFP-YFP aderidas a microplacas de 96 cavidades. tampão PBS foi adicionado a cada sinal de poço e a FRET foi calculada tomando-se a proporção entre a emissão de aceitador de fluorescência (530 ± 5 nm) e emissão de fluorescência do dador (486 ± 5 nm) quando as amostras foram animado, a 425 ± 10 nm, utilizando um fluorescência leitor de placas. Com efeito, nestas condições, um sinal de FRET significativa foi detectada em células MB231_CFP- YFP (Figura 1C). Notavelmente, a sonda FRET verificou-se ser estável em células submersas em tampão PBS, durante até 24 horas (Figura 1C). Como um controlo, as células parentais não transfectadas MB231 Foram testadas em paralelo, que não produziram qualquer sinal de fluorescência significativa acima do ruído de fundo quando excitado a 425 ± 10 nm.

Imunoprecipitação da sonda PCP-ligante-YFP FRET foi realizada para confirmar a sua selectividade para a caspase 3 e caspase 8 clivagem. sonda ligante-YFP FRET CFP- foi purificado a partir de lisados ​​de células utilizando anticorpo anti-PCP /YFP conjugado com esferas de Sepharose. sonda FRET ligada foi eluída utilizando tampão Tris contendo NaCl 1M. sonda FRET isolado foi caracterizado utilizando SDS-PAGE com coloração com azul de Coomassie (Figura 1D, em cima) e análise de immunoblot (Figura 1D, em baixo). Para avaliar a especificidade caspase, a sonda FRET purificada foi incubada com formas recombinantes de caspase activa 3, caspase 8 ou caspase 2. Mudanças na FRET foram monitorados (Figura 1 E). Como clivagem esperado da sonda FRET foi específico para a caspase 3 e caspase 8, e levou a uma diminuição acentuada no sinal de FRET. Consistentemente, a clivagem da sonda FRET foi completamente abolida quando a mistura de reacção foi incubada com o inibidor da pan-caspase (Z-VAD). Por outro lado, praticamente nenhuma clivagem da sonda FRET foi detectado quando a sonda CFP- ligador-YFP FRET foi incubado com caspase 2.

Qualificação do biossensor FRET para uso em testes de potência para as terapias contra o câncer receptor de morte alvo

com a sonda FRET transfectadas de forma estável, que primeiro testada a sua adequação em medir a potência de uma classe de proteínas que induzem a apoptose por alvo os receptores de morte (DRS). Estes incluíram a apoptose recombinante humana relacionada com o TNF ligando indutor (TRAIL) e anticorpos agonistas para DR5, que estão em desenvolvimento em vários ensaios clínicos para o tratamento do câncer. Estes produtos funcionar através de DR4 e /ou DR5 expresso na superfície de células alvo. Uma vez activado, o domínio de morte intracelular facilita a montagem de pró-caspase e 8/10 uma proteína adaptadora FADD para um complexo de sinalização indutor de morte (DISC), que conduz a uma activação sequencial de caspase 8 e caspase 3. Assim, estes agentes servem excelentes sondas para testar o biossensor FRET engenharia. Como foi mostrado anteriormente para as células MB231 parental [18], as células MB231_CFP-YFP manteve uma susceptibilidade similar ao anticorpo TRAIL e anti-DR5. Isto foi demonstrado pela primeira vez por ensaios de viabilidade celular baseado em MTT quando as células foram tratadas com concentrações crescentes de TRAIL ou anticorpo anti-DR5. Uma curva de dose-resposta semelhantes e CE

50 Obteve-se o valor para ambas as células e células parental_MB231 MB231_CFP-YFP quando tratados com TRAIL ou anticorpo anti-DR5 (Figura 2A e Tabela 1). Quando analisados ​​para a indução de apoptose, ambas as linhas de células apresentaram um aumento dose-dependente semelhante em células apoptóticas após o tratamento com TRAIL ou anticorpo anti-DR5 (Figura 2B). Estes dados indicam que a transfecção de FRET biossensor não teve efeito sobre a resposta celular para terapias DR-direcionados. A linha celular estável MB231_CFP-YFP pareceu reter maquinaria apoptótica intactas, suportando, assim, a sua utilização como um substrato celular para testar a citotoxicidade de medicamentos contra o câncer.

(A) Parental MB231 (preenchido preto) e MB231_CFP-YFP ( abrir células claras) foram tratadas com TRAIL (0-100 ng /ml) durante 2,5 h ou anticorpo anti-DR5 (0-200 ug /ml) durante 20 h, às concentrações indicadas. A viabilidade celular foi determinada pelo ensaio de MTT. (B) As células foram tratadas como em A e analisado para a apoptose por citometria de fluxo, após coloração com anexina-V-APC e iodeto de propídio (PI). p-valores foram determinados utilizando um teste t de Student. CE

50 valores foram determinados utilizando curva não linear apropriado, tal como descrito nos Materiais e Métodos. Para cada

valor de EC50, 95% intervalos de confiança que refletem a precisão estatística são apresentados na Tabela 1.

Em seguida, avaliou-se a clivagem da sonda FRET em resposta ao tratamento com TRAIL ou anticorpo anti-DR5. Para este fim, as células MB231_CFP-YFP foram tratados com TRAIL e anticorpo anti-DR5. A análise de imunotransferência revelou uma correlação entre a activação de caspase e clivagem da sonda PCP-ligante-YFP FRET em todos os níveis de dose (Figura 3A e 3B).

As células foram tratadas com (A) 0-300 ng /ml para TRAIL 2,5 horas ou (B) 0-50 ug /anticorpo anti-DR5 ml durante 20 h. As células resultantes foram analisados ​​por anticorpos blotting usando ocidentais específicas para caspase 3 (C3), caspase 8 (C8) e CFP /YFP.

Para a medição FRET, as células MB231_CFP-YFP foram cultivadas em 96 bem placas durante a noite em meio DMEM. meio de cultura celular foi removido e tampão de PBS contendo várias concentrações de TRAIL ou anticorpo anti-DR5 foi adicionado a células aderidas durante 2,5 h e 20 h, respectivamente. Nos tempos indicados, os sinais de FRET foram directamente medido em amostras individuais, com um ajuste de excitação de 425 ± 10 nm e configurações de emissão de 530 ± 5 nm para YFP e 486 ± 5 nm para PCP, utilizando um leitor de placas de fluorescência. Uma diminuição dependente da dose na FRET foi identificado com concentrações crescentes de TRAIL e anticorpo anti-DR5 (Figura 4A e 4B). valores FRET foram normalizados e representados graficamente contra o valor de log de TRAIL e anti-DR5 concentração de anticorpos no molar utilizando o software GraphPad Prism (Figura 4A e 4B), obtendo-CE

50 valores depois de curva não-linear apropriado para Equação 2 (Tabela 1). Notavelmente, o ensaio de FRET produzido CE

50 valores que são consistentes com os de ensaios convencionais (MTT, citometria de fluxo, e análise de imunotransferência). Colectivamente, estes dados apoiam a utilização do ensaio de FRET base de células para a análise da bioactividade de terapias DR-direcionados. A microscopia confocal foi também utilizado para avaliar a variação de FRET celular quando as células MB231_CFP-YFP foram tratadas com TRAIL (Figura 4C). Uma mudança acentuada da emissão de aceitador YFP (amarelo) para a emissão de doadores PCP (ciano) pode ser observado para células tratadas com o aumento da concentração de TRAIL com um cenário de excitação = 458 nm. Células

MB231_CFP-YFP foram tratadas com ( a) 0-300 ng ml TRAIL /durante 2,5 horas e (B) 0-100 ug ml de anticorpo /anti-DR5, durante 20 h. FRET foi calculada e é representado por meio de gráficos de barras no lado esquerdo do painel. CE

50 valores foram determinados pela curva não linear adequado para valores FRET normalizados plotados contra os valores de log de TRAIL e concentração de anticorpos anti-DR5 em molar (lado direito do painel). Imagens (C) confocal microscopia mostrando as alterações no TERF em células MB231_CFP-YFP tratados com 0-25 ng TRAIL /mL durante 2,5 h. Uma mudança pronunciada de YFP emissão aceitador (amarelo) para emissão de dador PCP (ciano) pode ser observado para células tratadas com concentrações crescentes de TRAIL, com uma configuração de excitação = 458 nm. A análise estatística foi realizada tal como na Fig. 1 e 2.

Aplicação do ensaio FRET baseado em células para avaliar a bioatividade da quimioterapia para câncer

Perguntamos se a sonda FRET engenharia poderia ser adaptado para a análise de fármacos de moléculas pequenas que funcionar através da modulação das vias de sinalização intrínsecas apoptose. Muitas drogas quimioterápicas clássicos se enquadram nesta categoria. Em primeiro lugar, testou estaurosporina e camptotecina, que ambos são conhecidos por serem potentes indutores de apoptose em diferentes tipos de células [7], [26]. Para este fim, as células MB231_CFP-YFP foram tratadas com estaurosporina ou camptotecina. Uma diminuição dependente da dose na FRET foi observada com concentrações crescentes de cada agente individual (Figura 5A). curve-linear produziu CE

50 valores que, nomeadamente, são comparáveis ​​com os obtidos por análise de MTT (Figura 5B, Tabela 1). Nós estendemos o estudo para incluir vários outros medicamentos de quimioterapia, incluindo etoposido, compactina, 5-FU e taxol. Estas drogas funcionar por stress genotóxico e do citoesqueleto e levam à inibição do crescimento subsequente e /ou a morte celular por apoptose, dependendo das condições experimentais e as células-alvo [5] – [7]. Consistentemente, foram identificadas alterações FRET sinal observável quando as células MB231_CFP-YFP foram tratados com cada agente de quimioterapia (Figura 5C). No entanto, a sua capacidade em induzir a apoptose dependente da caspase 3/8 pareceu ser muito menor do que a de TRAIL ou anticorpo anti-DR5, o que requer tanto de alta concentração (100 ug /mL) e os períodos de incubação mais longos (72 horas) em comparação com a potência de TRAIL (EC50 ~0.05-0.08 nM) e anti-DR5 (EC50 ~0.24-0.80 nM). Estes dados demonstram a capacidade da sonda FRET celular para quantificar a actividade indutora de apoptose de ambos os agentes biológicos e quimioterapêuticos. Por condições experimentais de ajuste fino, os ensaios de FRET pode ser utilizado para comparar directamente a bioactividade in vitro de diferentes medicamentos contra o câncer.

células MB231_CFP-YFP (A) foram tratados com 0-100 ug /ml durante 20 estaurosporina h e 0-1,7 ug /ml camptotecina durante 72 h. alterações dependentes da dose em FRET sinais foram determinados tal como na Fig. 4. ensaio (B) MTT foi utilizado para avaliar a viabilidade celular em resposta ao tratamento de parental_MB231 (preenchido preto) e MB231_CFP-YFP (abrir clara) células com 0-25 ug /ml de estaurosporina durante 20 h e 0-7,7 ug /ml camptotecina, durante 72 h, respectivamente. células (C) MB231_CFP-YFP foram tratados com agentes de quimioterapia (100 ug /ml) durante 72 h. medição e análise de FRET foi realizado como na Fig. 4. A análise estatística foi realizada tal como na Fig. 1 e 2.

Discussão

Nós desenvolvemos um biossensor de FRET baseadas em células para medir a actividade indutora de apoptose de drogas. O nosso ensaio de FRET parece ser superior a outros ensaios de apoptose comumente utilizados dada a sua simplicidade, estabilidade, conveniência e robustez. Prevemos que, dadas estas vantagens, o expresso de forma estável sonda FRET pode ser adaptado para uso em futuros estudos de descoberta de drogas e desenvolvimento relevantes.

O objetivo da terapia do câncer é matar as células cancerosas. Por conseguinte, um ensaio de potência deve ser concebido de modo a reflectir o mecanismo de acção da droga isto é, indução de apoptose ou outras formas de morte celular. A apoptose é uma forma comum de morte celular associada ao tratamento do câncer, tanto

in vitro

e

in vivo

. Vários métodos estão disponíveis para a detecção e medição de apoptose, incluindo citometria de fluxo, microscopia, imunotransferência, e ensaios baseados em substrato de caspase [14], [27] – [29]. Estas metodologias são ferramentas de pesquisa poderoso no estudo de apoptose, mas cada método está associado com as limitações inerentes, incluindo mas não se limitando a incapacidade para optimizar de uma forma de alto rendimento, a variabilidade associada com a permeabilidade celular dos materiais necessários para um sinal de leitura, a exigência de célula lise, e elevado ruído de fundo [17]. Devido a estas limitações ainda existe uma necessidade para um ensaio de apoptose normal e robusta. Embora vários grupos relataram a expressão celular de uma proteína de fusão à base de GFP, que pode actuar como um substrato da caspase e detectar alterações na TERF celular no momento da indução da apoptose, os métodos de detecção nestes casos baseou-se principalmente na microscopia confocal e citometria de fluxo [15], [ ,,,0],30] – [33]. Enquanto fornecendo informações valiosas este procedimento operacional não é o ideal para um ensaio de potência de processamento robusto e de alta. Nomeadamente, não são exemplos relatados esparsos que utilizam um formato de placa de transferência [34], [35]. O nosso ensaio de FRET base de células permite uma detecção sem precedentes de tanto a actividade da caspase 3 e caspase 8 em um formato de microplacas utilizando um linha celular de cancro da mama humano. Esta combinação permite a caracterização da caspase de qualquer agente que pode induzir apoptose através de via intrínseca ou extrínseca, ou ambos. Também a nossa metodologia tem sido unicamente adaptados para eliminar fundo auto-fluorescência associada com meios de cultura celular; Isso ajuda a obter uma melhor relação entre o sinal e o ruído e evita elevados subtracções fundo que podem complicar cálculos FRET. Além disso nosso trabalho tem rigorosamente focado sobre a adequação do ensaio descrito no funcionando como um teste de potência de drogas proteínas complexas que têm como alvo os receptores de morte, enquanto outros trabalhos têm focado principalmente na descoberta de pequenas moléculas drogas.

Uma limitação do nosso ensaio está relacionada com a disponibilidade de alvo molecular (s) nas células MDA-MB-231 para uma molécula específica de drogas. Por exemplo, as células MDA-MB-231 são conhecidos por serem deficientes na expressão do receptor de Her2 fazendo assim o ensaio de inutilizável para avaliar os anticorpos monoclonais anti-HER2 que são aprovados para utilização no tratamento do cancro da mama.