Abstract

tecnologias

ultra-som permeiam a área médica: como uma modalidade de imagem há muito estabelecida em diagnósticos clínicos; e, com o surgimento de elevada intensidade focado alvo de ultra-sons, como um meio de ablação de tumores termicamente. Em paralelo, o potencial do intermediário de ultra-sons de intensidade [não-térmico] como uma terapia minimamente invasiva é também a ser rigorosamente avaliada. Aqui, a indução de apoptose em células cancerosas tem sido observado, apesar de a identificação definitiva do mecanismo subjacente, até agora permanecido elusivos. Um processo candidato provável tem sido sugerido que envolvem actividade sonoquímica, onde as espécies reactivas de oxigénio (ROS) medeiam a geração de ADN de quebras de cadeia simples. Aqui no entanto, nós fornecemos nova evidência convincente de que apoia fortemente um mecanismo puramente mecânico. Além disso, por uma combinação de ensaios específicos (cauda de cometa neutro e de coloração para a formação de focos γH2AX) demonstramos pela primeira vez que os EUA exposição no mesmo intensidades moderadas apresenta potencial genotóxico, através de sua facilidade para gerar danos no DNA em várias linhas de câncer. Notavelmente, os ensaios de co-localização destacar que a radiação ionizante e ultra-som têm distintamente diferentes assinaturas para seus respectivos padrões de formação de focos γH2AX, provavelmente refletindo as diferentes distribuições de estresse que iniciaram a formação de danos. Além disso, paralelamente immunoblotting sugere que o DNA-PKcs têm um papel preferencial na reparação de danos induzidos por ultra-som

Citation:. Furusawa Y, Fujiwara Y, Campbell P, Zhao QL, Ogawa R, Ali Hassan M , et ai. (2012) Breaks DNA dupla vertente Induzidas por cavitational efeitos mecânicos do ultrassom em linhas celulares de cancro. PLoS ONE 7 (1): e29012. doi: 10.1371 /journal.pone.0029012

editor: Martin G. Marinus, University of Massachusetts Medical School, Estados Unidos da América

Recebido: 26 Setembro, 2011; Aceito: 18 de novembro de 2011; Publicação: 03 de janeiro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Furusawa et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O apoio financeiro para este estudo foi fornecido por um Grant-in-Aid para a Investigação científica (B) (22.390.229), Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o ultra-som (US) é indispensável na maioria das áreas médicas: (i) US em intensidades muito baixas ( 0,1 MPa de pressão acústica) muito abaixo dos limiares para posar efeitos adversos térmicas e /ou cavitacionais é usado para médicos diagnóstico; (Ii) uma elevada intensidade focado EUA (HIFU, 10 MPa de pressão acústica) é utilizada para a ablação térmica de tumores; e (iii) não térmico de baixa intensidade US (0,1-1,5 MPa pressão acústica entre os dois acima) como um candidato potencial para a terapia do câncer está atualmente sob investigação [1]. Os tecidos expostos à energia dos EUA pode induzir um espectro de resposta biológica, cada um com um potencial terapêutico distinto [1] – [6], incluindo a absorção de moléculas exógenas [7] – [14], necrose e apoptose [1], [3] [6], [15], [16]. Os modos biofísicos de US são divididos em três classes, térmica, cavitational e efeitos não-cavitacionais não térmicos. Cavitação conduz a uma variedade de agressões mecânicas, tais como a tensão de corte, por ondas de choque, de alta pressão, e de stress químico, devido à formação de radicais livres, ambos os quais têm sido inferido a actuar simultaneamente em todos os materiais biológicos [15] – [17]. Evidências acumuladas indicam que intensa EUA, bem como de baixa intensidade US excluindo efeito térmico induz espécies reactivas de oxigénio (ROS) produção, a fluidez da membrana, as quebras de DNA único fio (SSB) e vários estudos anteriores implícita a importância de SSBs decorrentes de ROS sonochemically produzido como danos no DNA iniciando induzida por US morte celular /morte [2] – [4], [6], [15]. No entanto, este ponto de vista é questionável, porque numerosas BAAs induzida, por exemplo, pela gama mmol /L de H

2O

2 dêem origem a nenhuma ou poucas quebras de cadeias duplas (DSB), as lesões mais citotóxicos do ADN [18]. Até à data, no entanto, não há evidência directa na indução de LAP e se a activação subsequente de resposta a danos no ADN (DDR) vias pode ocorrer depois de exposição a US. Em contraste evidente, os dados sobre a resposta celular à radiação ionizante (IR), incluindo a indução de LAP e de ADN a jusante resposta a danos (DDR) foram mais extensivamente relatados [19]. Aqui, nós abordar este ponto avaliar o potencial genotóxico de baixa intensidade EUA. Em nosso estudo, foram avaliados vários pontos finais definitivos associados à formação e transformação de danos no DNA, incluindo LAP, após a exposição, para US com um conjunto de experimento realizado em paralelo com Sering irradiação IR como controlos positivos.

Resultados e Discussão

Neutral ensaio cauda de cometa (NCTA) foi utilizado para detectar DNA LAP ocorrendo em quatro linhas de leucemia diferentes (U937, Molt-4, Jurkat e HL-60), que haviam sido submetidos ou a IR ( 10 Gy, salvo indicação em contrário), ou US (como exposições usando intensidades de 0,3 ou 0,4 W /cm

2 com duração de 1 minuto). Os resultados positivos, em termos de caudas de cometa prolongados em comparação com os controlos não irradiados, foram observadas em todas as linhas celulares medidos no período imediatamente a seguir à exposição (t = 0) (Figura 1A). comparação quantitativa, em termos do momento relativa média cauda de cometa (RCTM) resultante (Figura 1B) produziu a seguinte evolução em todas as linhas de células: RCTM

0.4US RCTM

IR RCTM

0.3US, que ressalta a comparabilidade das respectivas doses dos Estados Unidos e IR escolhidas para esta investigação, em termos de suas instalações para induzir níveis similares de danos no DNA. Curiosamente no entanto, percebemos que IR produzida RCTMs média predominantemente no intervalo 1,1-3, enquanto exposições nos dar origem a uma ampla gama de RCTM resultante, a distribuição para o qual foi também uma função da intensidade dos EUA (Figura 1C e Figura S1).

(A) SYBR verde manchada de caudas de cometas neutros imediatamente após a exposição de U937 (

U

), Jurkat (

J

), Molt-4 (

M

) e células para nós (0,3 ou 0,4 W HL-60 (

H

) /cm

2) ou IV (10 Gy). (B) em relação momentos da cauda (

n

= 100 células, significa ± SD), normalizadas para os respectivos controles não tratados (= 1,0). (C) distribuição heterogênea para 3.0, 1.1~3.0 e 1 (= nível de controle) significa momentos cauda relativos depois de nós, mas uma distribuição uniforme de 1,1-3 momento da cauda relativa após 10 Gy em ~ 90% de células U937 (

n

= 100 células). Veja Fig. S1 para as outras linhas celulares. (D) imagens Green-fluorescentγH2AX em U937, Jurkat, Molt-4 e células HL-60 30 min após a 0,3 W /cm

2 norte-americanos (imagens de células de controle não foram mostrados devido à ausência de células γH2AX +). (E) indução de células γH2AX + como uma função da intensidade dos EUA para além de um limite de 0,1-0,2 W /cm

2 (

N

= 3, média ± D.P.). as imagens das células (F) γH2AX + e (G) de histogramas FCM γH2AX + células U937 30 min após a 0,3 W /cm

2 e 10 Gy IR. Perfis pretos, verdes e vermelhos são para o controle, EUA, e IR, com as IMFs de células γH2AX + (5-100 log γH2AX)). (H) Indução /declínio de γH2AX + células U937 (FCM) com o tempo após 0,3, 0,4 W /cm

2 (I) e 10 Gy IV (II). (I) redução em momentos cauda durante 3 h pós-0,3 W /cm

2 EUA (i) ou 10 Gy IV (II). zVAD-fmk a 50 umol /L foi usado para eliminar LAP apoptóticas.

Considerando NCTA análises são considerados como LAP, a presença de focos γH2AX distinta pode também representar uma assinatura definitiva para LAP [20]. Observou-se coloração tais γH2AX em todas as células expostas a 10 Gy (Figura 1F), e mais importante, em todas as linhas celulares expostas a US (Figura 1D) acima de um limiar de intensidade de cerca de 0,1-0,2 W /cm

2 (Figura 1E e Figura S2, S3), que indica, pela primeira vez, que a exposição dos EUA pode induzir LAP e, assim, apresentar um risco genotóxico tangível.

de observação pós-exposição em células expostas a IV são favoravelmente comparados com relatórios anteriores [21 ] em que os focos discretos γH2AX + células exibiram distribuídos entre o núcleo (Figura 1F), e também que o perfil temporal, subsequente da população γH2AX + exibiram atingindo um máximo de 30 minutos pós-exposição, seguido pela deterioração gradual (Figura S4). Notavelmente, esta última redução no total de populações γH2AX + computados qualitativamente com tendências também observada utilizando NCTA (Figuras 1H (ii) e 1I (ii)), apoiando a reparação de LAP-induzidos IR.

Em US-exposta ( insonadas) células, a fracção relativa de γH2AX + era mais pronunciada, tal como confirmado por citometria de fluxo, onde os níveis de γH2AX + foram cerca de três vezes maior em comparação com as células expostas IR (Figura 1G). células afetadas também exibiu um γH2AX pan-nuclear + distribuição, com focos ocasional, mas distintos sobrepostos (Figura 1F). Curiosamente, a população γH2AX + atingiu um pico aos 60 minutos pós-exposição em relação a ambos a 0,3 e 0,4 W /cm

2 casos US empregues, seguido por um período de recuperação que estabilizou após 6 h (Figura 1H (I) e a Figura S4).

As diferenças óbvias em coberturas típicas γH2AX + resultantes para células IR e US expostas, juntamente com suas distribuições distintas em relação cometa momento da cauda (Figura 1C), e significativamente diferentes γH2AX + vezes repicam, sugere que o respectivo DDR vias de sinalização são de natureza diferente. Além disso, nos casos em que EU foi aplicada a exposição, o emprego do inibidor da pan-caspase z-VAD-fmk para suprimir a apoptose parece ter efeito negligenciável (Figura 1I (I) e a Figura S5), ao passo que TRAIL-induzida γH2AX (caspase-mediada γH2AX), por exemplo, poderia ser abolido (Figura S5):. evidência persuasiva de que a indução e pós-pico observado perda de γH2AX em todos os casos é provável associada a danos no DNA e reparação

para investigar, realizamos co- manchas de localização de γH2AX com dois grandes cinases responsáveis ​​pela fosforilação H2AX, ataxia-telangiectasia mutada (ATM), e a DNA-PKcs [22]. As Figs. 2A-B mostram que a maior parte da fosfo-NBS1 e-atm focos colocalized para γH2AX focos depois que ambos

exposições IR US

e, sugerindo um recrutamento geral e coordenada de NBS1 e ATM ao estresse induzido por LAP [23] , [24]. A coloração nuclear de pan-γH2AX que ocorre apenas após a exposição dos EUA pode surgir através da activação ATM global, talvez através da cromatina remodelação [25], em resposta à natureza da tensão dos EUA.

(A) co-localização de NBS1 distinta pS343 focos de focos γH2AX distinta; (B) co-localização de ATM pS1981 focos de γH2AX focos; (C) DNA-PKcs pT2609 focos largamente independente da γH2AX focos. (D) e US-IR induzida por ADN-PKcs e pS2056 γH2AX focos. US induzida high-fluorescente focos DNA-PKcs pS2056 peri-nuclear (

direito

) ou eram pan-nuclear com focos discretos

(à esquerda)

, enquanto que ambos os focos após IR eram distintos e colocalized. imagens fluorescentes foram adquiridas 30 minutos após 0,3 W /cm

2 EUA e 3 Gy IR em células U937.

Além disso, as investigações de coloração dos dois grupos principais de fosforilação (T2609 e S2056) disponíveis para DNA-PKcs (para-processamento final de DSB através extremidade não-homóloga de união (NHEJ) [26] – [29]) revelou (Figura 2C), que os focos de ADN-PKcs-pT2609 eram em grande parte independente da γH2AX após exposições IR EUA e , apoiando sugestões anteriores que NHEJ ocorre separadamente da recombinação homóloga RH [30], [31]. Por outro lado, todas as células expostas IR-exibido discreta, a DNA-PKcs-pS2056 co-localizada /γH2AX + focos nucleares (Figura 2D), confirmando relatórios anteriores de que a DNA-PKcs complementa H2AX em resposta a RI [22]. γH2AX + populações Curiosamente, observações sobre US induzidas também exibiu regiões sobrepostas de co-localização com a DNA-PKcs, mas além disso, um assinatura distinta de não-co-localizada peri-nuclear ADN-PKcs-pS2056 (Figura 2D). Assim, a fosforilação preferencial de DNA-PKcs-pS2056 pode mediar tanto reparo NHEJ no LAP induzidas pelos EUA em massa de armas nucleares, mas também sinalizar à presença γH2AX em torno da periferia nuclear (ver também Figura S6). O mecanismo pelo qual o DNA-PKcs S2056 é distribuído à volta da periferia do núcleo permanece pouco clara, no entanto, esta padrões de localização do ADN-PKcs S2056 pode ser uma das respostas celulares característicos para LAP induzidos pelos Estados Unidos.

Nós ainda avaliados os papéis bioquímicos de ATM e DNA-PK, aplicando os respectivos inibidores da quinase farmacológico KU55993 (KU) e NU7026 (NU). Imuno-blots revelou que a radiação ionizante induziu uma maior fosforilação ATM do que EUA (Figura 3A), um tanto mais cedo que reflecte a nossa observação NCTA (Figura 1A). Nomeadamente no entanto, descobrimos que a KU, mas não NU, selectivamente reduzido os níveis de fosfo-ATM, depois dos Estados Unidos e IR (Figura 3A). Aqui, fosforilação de ADN PKcs-S2056 (pS2056) foi maior após EUA do que IR. Como previsto, NU inibida S2056 fosforilação significativamente, enquanto KU reduzida fosforilação T2609 ATM-dependente [26], depois de EUA e IR. Além disso, KU parcialmente reduzida induzidas US-DNA-PKcs-pS2056 em ambos immunoblotting e imuno-coloração (Figura 3B, D), o que sugere a diafonia entre a ATM e ADN-PKcs-S2056, em resposta a exposição dos EUA.

(A) imuno de células U937 extrai 30 min, depois dos Estados Unidos ou IR e os efeitos da KU e NU sobre ATM pS1981 e DNA-PKcs pS2056 /pT2609. (B) maior supressão da γH2AX induzida por US pelo NU de KU até 6 horas após a US em células U937 em análise de WB. (C) Efeitos da KU e /ou NU: a maior supressão da induzidos por US γH2AX + células por NU que KU e Abrogation por KU-plus-NU na análise FCM. (

n

= 3, a média ± DP). *,

P Art 0,05; **,

P Art 0,01; ***,

P Art 0,001. As células foram tratadas com Ku e /ou NU (10 umol /L) durante 1 h antes e depois da exposição a 0,3 W /cm

2 EUA (i) ou 10 Gy IV (II). (D) DNA-PK precedida ATM para a indução γH2AX por US: um papel preferencial de DNA-PK na indução γH2AX foi determinada por imunocoloração. As células foram tratadas como mostra a fig. 4C. PS1981 ATM (AT), a DNA-PKcs pS2056 (PK), e células γH2AX (H2) positivas /negativas foram contadas pelo menos 100 células em cada experiência. Os dados mostram as médias de 2 experiências independentes.

Uma vez que US aparece para ativar DNA-PK, de preferência a ATM, talvez não seja surpreendente que NU foi mais eficaz na redução da proteína γH2AX induzida por US níveis do que foi KU (conforme ilustrado para o caso de células U937 (Figura 3B), e nas outras linhas de células testadas (Figura S7)) -an observação que foi ainda reforçada por citometria de fluxo complementar medições (Figura 3C e Figura S8), que também demonstrou a inibição completa quando se utiliza uma combinação KU /NU (Figura 3C (i)). Tais inibições farmacológicas também foram confirmados por imuno-coloração e reproduzido em todas as células (S7 Figue 3D e Figuras, S9). A dependência de ADN-PKcs sobre a fosforilação induzida por H2AX EUA também foi confirmada comparando os EUA-resposta de linhas de células de glioblastoma defeituosos DNA-PKcs (M059J) com que as suas linhas celulares parentais (M059K) (Figura S10). Em resumo, estes resultados suportam fortemente um papel preferencial para DNA-PKcs sobre ATM, possivelmente sem envolvimento de ATR, na sinalização precoce da LAP induzidas pelos EUA para γH2AX, mas com o sentido diretamente oposto de sinalização de LAP-induzidos IR (Figura 3A, C), como tem sido mostrado previamente [22].

Finalmente, quisemos explorar o mecanismo físico-químico em bio-US efeitos induzidos por meio de testes ainda mais a hipótese de que Sonochemistry desempenha um papel dominante. Aqui, nós avaliamos a relação entre induzidas pelos EUA OH • radicais e indução DSB. Descobrimos que US induzida OH • níveis (DMPO-OH adutos) na solução DMPO aeróbia aumentou em um intensity- e tempo- exposição, forma dependente (Figura 4A), onde as taxas de indução de 1 e 2 DMPO-OH adutos per 0,3 e 0,4 W /cm

2 /min, respectivamente, foram de uma ordem de grandeza mais pequena do que os aductos de 30 por 10 Gy (Figura 4A) observada para o caso de exposição ao IV. Assim, o extracelular OH • nível de pós-US foi inferior a 10% do que ocorre pós-IR, embora doses comparáveis ​​foram aplicados (em termos de seu potencial de gerar danos no DNA (

viz

Figura 1A). além disso, a adição dos varredores de radicais DMSO e NAC em concentrações, respectivamente, altas ou baixas a solução DMPO, seja abolida, ou parcialmente reduzidas induzidas pelos EUA OH • níveis (Figura 4A, ver legenda e Métodos para mais detalhes). em seguida, determinamos os intracelulares OH • níveis imediatamente depois dos EUA utilizando um fluoresceína hidroxifenil (HPF) ensaio [32]. Aqui, a intensidade de fluorescência média (IFM) a partir de um fluxo deslocado citometria histograma era de 1,57 ± 0,07, imediatamente após a exposição a 0,3 W /cm

2 (Figura 4B), Deste modo, os baixos níveis de ambos extra- e intra-celular OH • resultante em resposta a US não pode inteiramente responsável pela indução dos EUA de LAP. Além disso, nenhum dos captadores de radicais foi eficaz na supressão induzida por US γH2AX (Figura 4C). Pelo contrário, N

2O gás, que é conhecida por suprimir a cavitação inercial de US [3], anulou completamente a indução de DMPO-OH aductos, γH2AX + células, e morte celular (Figura 4D-F ). Estas observações feitas na totalidade obrigam-nos à conclusão de que US mediada por estresse mecânico, ao invés de qualquer atividade radical sonochemically gerado, gera LAP genômicos.

(A) de detecção de EPR da US- ou IR-induzida e extracomunitárias os níveis intracelulares de OH • como adutos DMPO-OH (ver Métodos); Aumento de OH • níveis em solução DMPO (10 mmol /L), como uma função do tempo insonação em 0.3 (

esquerda) e 0,4 (

meio

) W /cm

2 US ou na dose IR de 5-20 Gy (

direita, fechado círculo

). Indução de DMPO-OH adutos de 0,3 ou 0,4 W /cm

2 foram reduzidas parcialmente em 50 mmol /L DMSO (

para cima triângulo

) ou 5 mmol /L NAC (

triângulo para baixo

) e anulado por um 10 vezes maiores concentrações: 50 mmol L NAC /ou 500 mmol /L DMSO (

fechou

diamante para ambos). As inserções mostram amplitudes dos sinais EPR de DMPO-OH. (B) Ensaio HPF-base FCM para intracelulares OH • níveis imediatamente após 0,3 W /cm

2 dos EUA em células U937. A mudança em direção histograma alta HPF-fluorescência por OH • oxidação era pequeno e, portanto, um aumento na intensidade de fluorescência média (MFI) foi de 1,57 ± 0,07 vezes o controle (

n

= 3, a média ± sd), com a protecção parcial por pré-tratamento com 5 mmol /L NAC durante 3 h antes de sonicação. (C) Sem efeitos protectores de 5 mmol /L de DMSO ou 5 mmol L NAC /(scavengers) adicionado a culturas imediatamente antes de 0,3 e 0,4 W /cm

2 dos Estados Unidos, ou outra 3H-pré-tratamento com 5 mmol /L NAC (NAC-pre) contra a indução de γH2AX + U937 células 30 min pós-americanos. (

n

= 3, significam ± DP

ns

meios

não significativa

). (D-F) Saturada N

2O gás causou a revogação de eventos induzidos pelos Estados Unidos como segue: (D) A US exposição em tempo de indução dependente de OH • em solução DMPO /L 10 mmol de 0,3 e 0,4 W /cm

2 (

n

= 3, a média ± sd). (E) A indução de células γH2AX + U937 30 min após 0,3 e 0,4 W /cm

2 (

N

= 3, média ± D.P.). : (F) 20% de células não viáveis ​​(corante azul de teste de exclusão de tripano) e perda de 30% na contagem de células em relação ao controlo células U937 6 h após 0,3 ou 0,4 W /cm

2 US (

n

= 3, a média ± sd).

Aqui, nós demonstramos pela primeira vez que a ação mecânica de US utilizando intensidades de nível intermediário podem induzir LAP, que são anunciadas pela presença de cauda de cometa neutra e γH2AX focos entre um cobertor γH2AX pan-nuclear com peri-nuclear DNA-PKcs S2056. Além disso, os presentes intensidades dos EUA de 0,3 e 0,4 W /cm

2, que deu origem a 0,132 e 0,144 MPa picos de pressão acústica, respectivamente [16], estão além do alcance US diagnóstico ( 0,1 MPa) [1 ] e nós confirmou que US de 0,1 W /cm

2 (0,082 MPa) não poderia induzir LAP (Fig. 1E). Esses resultados reforçam a segurança do diagnóstico dos Estados Unidos, especialmente se os seguintes três pontos são levados em consideração: (i) pulsos muito curtos (um par de microssegundos) utilizados no diagnóstico, (ii) as ondas estacionárias são improváveis ​​de ocorrer em

em vivo

exposições, e (iii) a atenuação de ondas acústicas no corpo humano. Em conclusão, esperamos que estas observações novas e atraentes irá proporcionar não só uma base biofísica e bioquímica firme para a compreensão do potencial genotóxico dos EUA, mas também orientar a tradução futuro em termos de limites de segurança.

Materiais e Métodos

produtos químicos e células

O NU7026 inibidor da DNA-PK e ATM inibidor KU55933 foram adquiridos de Calbiochem (Cambridge, UK). linhas celulares de leucemia humana U937, Molt-4, e de Jurkat-T foram obtidos comercialmente (Colecção japonesa de Bioresources investigação (JCRB) Cell Bank [32]. HL-60 também foi obtido a partir de JCRB Cell Bank (IFO50022). As células foram cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com soro de bovino fetal a 10% TRAIL recombinante /Apo2L foi de PeproTech (Londres, Reino Unido);. um inibidor da pan-caspase zVal-Ala-DL-Asp-fluorometil cetona (zVAD-fmk) foi de Peptide Institute (Osaka, Japão);

N

-acetil-L-cisteína (NAC) e iodeto de propídio (PI) a partir de Wako foram químico puro (Tóquio, Japão); 4 ‘, 6-diamino-2-fenilindole (DAPI) e 5,5-desmetil-1-pyrroline-

N-óxido

(DMPO) eram de Dojindo (Kumamoto, Japão).

ultra-sons e irradiação

Low-intensity- US pulsado com 100 Hz de frequência de repetição de pulso fixa e factor de serviço de 10% (posteriormente designada como US) foi gerada usando uma configuração de 1.0 MHz acústica [16], [33]. Em experimentos de insonação, um mL-alíquota de 2 a uma densidade fixa de 1 × 10

6 células /ml num prato de cultura de polietileno de 35 mm (Corning, Nova Iorque) foi sonicada a 0,1-0,4 W /cm

2 (intensidades conceber-indicados) durante 1 min. Estes quatro intensidades correspondeu a 0,061, 0,105, 0,132 e 0,144 MPa pressões acústicas de pico, respectivamente [16]. Um aumento da temperatura do meio durante a insonação era inferior a 1 ° C [16]. Para o tratamento de IV, as células foram irradiadas com 3 Gy (para produzir IRIFs discretas) ou 10 Gy (uma dose quase isoeffect para caudas de cometa neutros induzida por 0,3 e 0,4 W /cm

2) a uma taxa de dose de 5 Gy /min usando uma unidade Modelo MBR-1520R-3 raios-X (Medico Tecnologia Hitachi, Kashiwa, Japão).

Neutral ensaio cometa

Neutral caudas dos cometas (LAP) foram avaliadas em US-expostos células utilizando um kit de ensaio da unidade de electroforese e cometa (Trevigen) de acordo com as instruções do fabricante. Pelo menos 50 células por amostras foram analisadas usando um software de Ensaio Cometa IV (Leica Microsystems). O momento da cauda relativa foi dada pela razão de momentos cauda de cometa (média ± DP) de células tratadas com os dos controles (razão = 1,0).

imunodetecção

Para imagens de imunofluorescência, paraformaldehyde- controlo fixa e as células tratadas foram permeabilizadas /bloqueadas com 2% de BSA /0,05% de Triton X-100 /solução salina tamponada com Tris, e imunocoradas durante 2 h com anticorpo monoclonal primário (mAb): anti-fosfo-H2AX S139 (γH2AX, Milipore) , 1:400 ou anti-ATM pS1981, 1:250 (Upstate Biotechnology) ou anticorpo policlonal primário (pAB), anti-fosfo-H2AX S139 (γH2AX, o Active Motif), 1:500, anti-NBS1 pS343, 1:1000 (Novus Biologicals), ou anti-DNA-PKcs pT2609 ou pS2056, 1:250 ou 1:600 ​​(Abcam), respectivamente. Em seguida, as células foram coradas durante 1,5 h com o anticorpo secundário: Alexa Fluor 488 anti-rato F (ab ‘) ou IgG Alexa Fluor 555 anti-coelho de F (ab’) IgG (Cell Signaling Technology), 1:400. Finalmente, os núcleos foram contrastadas com 2 ug /ml de DAPI, e as amostras foram montadas em Antifade ™ (Molecular Probes). As imagens fluorescentes foram adquiridos utilizando um microscópio de fluorescência BX-50 (Olympus Optics).

Por citometria de fluxo (FCM), as células foram fixadas com 70% de metanol frios durante a noite, em seguida, bloqueadas com 2% de BSA /0,05% de Triton X-100 /solução salina tamponada com Tris e feito reagir com γH2AX mAb /Alexa Fluor 488 anti-IgG de ratinho (1:400) para corar γH2AX + células, seguido por incubação com 1 mg /ml de ARNase a e 50 ug /mL de PI para a atribuição γH2AX + células para cada uma das fases do ciclo celular com base em IP. As amostras foram finalmente rodar em um fluxo Epics XL citómetro (Beckman Coulter).

Para a análise de imunotransferência, foram preparados extractos de células completas em tampão de lise RIPA contendo ortovanadato de sódio e cocktail de inibidores de protease (Nacalai Tesque). moléculas de elevado peso molecular do ATM e ADN-PKcs foram separadas em 5% de gel de SDS-PAGE pré-fabricados, ao passo que outras proteínas de baixo peso molecular foram separadas em 15% de gel de SDS-PAGE pré-moldado. Após a transferência, as proteínas sobre as membranas Immobilon-P (Millipore) foram western-blotted usando os anticorpos primários: γH2AX mAb, ATM Pab (Santacruz), ATM pS1981 mAb (Epitomics), a DNA-PKcs Pab (Epitomics), a DNA-PKcs pS2056 pAB, DNA-PKcs pT2609 mAb, caspase 3 pab (sinalização celular) ou mAb GAPDH (referência carregamento, Organon Teknika), e os anti-ratinho ou anti-coelho IgG conjugado com HRP secundário (Cell Signaling). Os níveis de expressão de proteína foram visualizadas por um sistema de detecção de quimioluminescência aumentada (ECL) (Nacalai Tesque), e as imagens foram adquiridas por uma LAS-4000 analisador de imagem luminescente (Fuji Film).

Detecção de extra e intra-celular ROS

os níveis de US- ou OH-induzida IR • em líquidos extracelulares foram quantificados pela ressonância paramagnética eletrônica (EPR) método de captura de rotação [3], [16]. Para estes, 2-mL alíquotas de DMPO 10 mM foram dispensadas em placas de 35 mm e expostas a 0,3 e 0,4 W /cm

2 durante 1 a 5 minutos ou a doses graduadas de IV (5-20 Gy), seguido pela a detecção imediata de sinais aduto DMPO-OH utilizando um RFR-30 EPR espectrômetro (Radical Research). adutos DMPO-OH (OH •) foram expressos como quantidades relativas a uma referência interna (Mn

2 +). Para detectar intracelular • OH, foi utilizado célula-permeável hidroxifenil fluoresceína (HPF) (Sekisui Médico), que detecta principalmente OH • e marginalmente ONOO

– (~ 1/10 da quantidade OH •) [31]. As células foram carregadas com 5 nM HPF durante 15 min a 37 ° C, e expostos a 0,3 W /cm

2, seguido pela análise de FCM imediato intracelular induzida por US OH •. Intensidade de fluorescência média (MFI) da sonda oxidado foi quantificada para avaliar o seu aumento vezes sobre o controle.

Estatísticas

Os dados foram apresentados como média ± DP A significância estatística entre dois conjuntos de dados foram analisados ​​utilizando

t

-teste com o Microsoft Excel 2007.

Informações de Apoio de Student não pareado

Figura S1.

ensaio para caudas de cometa neutros em Jurkat, MOLT-4 e células HL-60 imediatamente depois de 0,4 W cm

2 EUA revelou a desigual distribuição mais ampla de 25-30, 35-50% e 10-23% de células /a intervalos de 3, 1,1-3, 1 e cauda momentos relativos, respectivamente, em comparação com uma distribuição bastante uniforme de células maioria de 80-90% para uma gama menor de 1,1-3 momentos relativos após 10 Gy IR. momento de cauda relativa de 1,0 representa há LAP induzidos como nas células de controlo. Depois de 0,3 W /cm

2, de modo semelhante, 10-25, 30-40% e ~ 50% de células efectuadas 3, 1,1-3 e 1 (sem LAP) cauda momentos relativos, respectivamente. Estes resultados recapitular os resultados em células U937 (Fig 1A, C.)

Doi:. 10.1371 /journal.pone.0029012.s001

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Figura S2. Images of fluorescência mostrou padrão γH2AX pan-nuclear células 30 min após 0,4 W /cm

2 dos EUA, mas não há γH2AX + células após 0,1 W /cm

2 em U937. As células com 10 Gy de IR foram usados ​​como controle positivo para a coloração γH2AX

doi:. 10.1371 /journal.pone.0029012.s002

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Figura S3. Images of fluorescência de γH2AX em U937, Jurkat, Molt-4 e células HL-60 sem US- ou IR-exposição. dados quantificados são mostrados na Fig. 1E

doi:. 10.1371 /journal.pone.0029012.s003

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Figura S4. histogramas

Representante FCM mostrou a indução e declínio da γH2AX + células U937 com o tempo até 6 horas após a 0,3 ou 0,4 W /cm

2 (1 min) US ou 10 Gy IR. A mudança de horário pratos em células γH2AX + depois dos Estados Unidos ou IR (Fig. 1 hora) vieram de fluorescência média dos histogramas (sombreado). Nota máximas frações γH2AX + a 0,5 ou 1 h, seguido do seu diminui mais tarde, com algumas γH2AX frações persistentes + em torno de 6 h pós-stress

doi:. 10.1371 /journal.pone.0029012.s004

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Figura S5.

Diferentes respostas H2AX para EUA e-receptor de morte ligando TRAIL em U937, Jurkat, Molt-4 e células HL-60. (A) o aumento dependente do tempo da expressão da proteína p17 γH2AX e /p19 formas activas da caspase-3 clivada, um marcador de apoptose essencial, após adição de 0,1 mg /mL de TRAIL. (B) zVAD-supressora da caspase-3 clivada em U937, Jurkat, Motl-4 e células HL-60: inibição da caspase 3-clivagem por tratamento com zVAD-fmk durante 6 h após 0,3 W /cm

2 EUA ( superior) ou 3 h após o TRAIL (parte inferior). Z-VAD FMK foram pré-tratados 1 h antes treatement TRAIL. (C) induzida por TRAIL, apoptótica DSB-driven células γH2AX + mas não DSB-driven γH2AX + células início 30 minutos após 0,3 W /cm

2 dos Estados Unidos, foram revogados pelo tratamento de todas as linhas de células com 100 mmol /L zVAD-fmk . Azul DAPI cor foi alterada para vermelho para visualização amarela fácil na mesclagem imagem γH2AX verde com usando o Adobe Photoshop Elements 2.0. (Adobe Systems)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0029012.s005

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Figura S6.

Imunofluorescência análise de induzida IR US- e DNA-PKcs pS2056 e γH2AX focos. Pan-nuclear verde focos γH2AX e focos de DNA-PKcs pS2056 altamente vermelho fluorescente depois dos Estados Unidos, mas de baixo fluorescente γH2AX distinta e DNA-PKcs pS2056 focos após IR. As setas vermelhas com células indicado peri-nuclear ADN-PKcs pS2056 focos observada em células sonicadas, mas não em células irradiadas. imagens ampliadas foram na Fig. 2D

doi:. 10.1371 /journal.pone.0029012.s006

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Figura S7.

análises de Western blot mostrando efeitos de Ku55933 (KU) e /ou Nu7026 (TG) no γH2AX 1 h depois de nós em Jurkat, Molt-4, e células HL-60. As células foram pré-tratadas com 10 mmol /L de KU e /ou NU 1 h antes de US

doi:. 10.1371 /journal.pone.0029012.s007

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Figura S8.

histogramas FCM típico que mostra induzida por US γH2AX na presença ou ausência de Ku55933 (KU) e /ou Nu7026 (TG). As distribuições de fase do ciclo celular foi determinado por coloração com iodeto de propídio. Note-se que induzida por US γH2AX não foram restringidos na fase S e efeitos supressores de KU e /ou foram identificados NU sobre γH2AX em toda as fases do ciclo celular

doi:. 10.1371 /journal.pone.0029012.s008

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Figura S9.

imagens típicas mostrando induzida por US γH2AX, fosfo-ATM no S1981, fosfo-DNA-PKcs no S2056, na presença ou ausência de Ku55933 (KU) e /ou Nu7026 (NU). O efeito de KU ou NU na expressão destas proteínas foi quantificada tal como na Fig. 4D

doi:. 10.1371 /journal.pone.0029012.s009

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Figura S10.

histogramas FCM típico que mostra US-γH2AX induzida em células proficientes M059K ADN-PKcs, mas não em células M059J deficiente DNA-PKcs. Estas linhas de células aderentes foram ressuspensas por tripsinização e, em seguida sonicada a 0,4 W /cm

2 durante 60 seg em meio de cultura. As células foram recolhidas em tubos de plástico imediatamente após sonicação em seguida, incubadas durante 30 minutos, seguido pela fixação.