Abstract

Recentemente, descreveu a localização mitocondrial e importação do receptor da vitamina D (VDR) proliferando activamente em células HaCaT, pela primeira vez, mas o seu papel no organelo permanece desconhecida. Muitos intermediários metabólicos que suportam o crescimento celular são proporcionados pelas mitocôndrias; consequentemente, a identificação de proteínas que regulam vias metabólicas mitocondrial é de grande interesse, e buscou-se compreender se VDR pode modular a estas vias. Nós geneticamente silenciados VDR em células HaCaT e estudados os efeitos sobre o crescimento celular, o metabolismo mitocondrial e vias biossintéticas. VDR knockdown resultou na inibição do crescimento robusto, com acumulação na fase G0G1 do ciclo celular e diminuiu a acumulação na fase M. Os efeitos de silenciamento VDR na proliferação foram confirmadas em diversas linhas de células de cancro humano. Diminuição da expressão VDR foi consistentemente observado em dois modelos diferentes de diferenciação celular. O comprometimento do crescimento celular HaCaT silenciados foi acompanhado por aumentos acentuados no potencial da membrana mitocondrial, o que os sensibilizados células ao stress oxidativo. Verificou-se que a transcrição do subunidades II e IV da citocromo c oxidase foi significativamente aumentada após VDR silenciamento. Por conseguinte, o tratamento de células HaCaT com vitamina D downregulated ambas as subunidades, sugerindo que VDR pode inibir a cadeia respiratória e redireccionar intermediários TCA em relação a biossíntese, contribuindo assim para o interruptor metabólico que é típica das células cancerosas. A fim de explorar esta hipótese, examinámos várias vias de biossíntese de acetil-CoA-dependentes, tais como a via do mevalonato (medido como a biossíntese do colesterol e prenilação de GTPases pequenas), e os níveis de acetilação da histona; Todas estas vias foram inibidas pelo RVD silenciamento. Estes dados fornecem evidência do papel de VDR como um gatekeeper da actividade da cadeia respiratória mitocondrial e um facilitador do desvio de acetil-CoA a partir do ciclo do TCA de produção de energia para vias biossintéticas que são essenciais para a proliferação celular.

citação: Consiglio M, Destefanis M, Morena D, Foglizzo V, Forneris M, Pescarmona G, et al. (2014) A vitamina D receptores inibe a cadeia respiratória, contribuindo para o interruptor metabólico que é essencial para a proliferação de células cancerosas. PLoS ONE 9 (12): e115816. doi: 10.1371 /journal.pone.0115816

editor: Makoto Makishima, Faculdade de Medicina da Universidade de Nihon, no Japão

Recebido: 09 de agosto de 2014; Aceito: 27 de novembro de 2014; Publicação: 29 de dezembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Consiglio et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Ministero dell’Istruzione Università e Ricerca. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o receptor da vitamina D (VDR), juntamente com os outros membros da família de receptores de hormona esteróide, geralmente tem sido descrito como um factor de transcrição modulados por ligandos clássica. Os efeitos diferenciadores do VDR são acionados por translocação nuclear induzida pelo ligando e ligação a locais de vitamina D elemento de resposta (VDRE) em genes regulados, em associação com parceiros heterodimerização, coactivators e co-repressores. As diferenças na ligação de co-repressor e metilação de ADN reflectem a variabilidade das respostas profunda antiproliferativos VDR em diferentes modelos de células [1]. Resistência aos efeitos nucleares de vitamina D tem sido relatada em vários modelos de cancro, incluindo cancros da próstata, mama e da bexiga, em que o aumento corepressor expressão e localização tem sido considerada responsável pela insensibilidade à hormona [2] – [4 ].

os receptores de esteróides também possuem uma modalidade não genômica de ação, especialmente na membrana plasmática ou locais mitocondriais, eo VDR não é excepção. Na verdade, os efeitos, não genômicas rápidas de vitamina D pareceu ser mediada pela VDR [5] – [7]. Muitos receptores de esteróides e factores de transcrição nucleares entrar no compartimento mitocondrial, onde quer exercer a regulação da transcrição de ADN mitocondrial ou controlar biogénese mitocondrial e metabolismo [8] – [11]. Recentemente, descreveram a localização mitocondrial do VDR em uma linha de células de queratinócitos em proliferação humano (HaCaT), pela primeira vez e demonstrou que a importação mitocondrial do receptor é mediada pelo complexo de poros de transição de permeabilidade [12]. No entanto, a função do VDR neste organelo continua por ser elucidado. As mitocôndrias são organelas multifuncionais e atividade mitocondrial é importante para a proliferação celular e fisiologia. Por exemplo, as mitocôndrias desempenham um papel essencial em energia celular (ATP) de produção através do ciclo de ácido tricarboxílico (TCA) acoplado a fosforilação oxidativa (FOX), bem como durante a apoptose através de espécies reactivas de oxigénio (ROS) geração e a libertação do citocromo c. Vários estudos têm indicado que a disfunção mitocondrial contribui para o desenvolvimento e progressão de várias doenças humanas, incluindo o cancro [13]. Uma característica das células tumorais se altera o metabolismo apoiar a proliferação celular rápida [14]. Muitos intermediários metabólicos que suportam o crescimento celular são fornecidos pela mitocôndria [15]; consequentemente, a identificação de proteínas que regulam vias metabólicas mitocondrial é de grande interesse, e buscou-se compreender se o VDR pode modular estas vias

.

No presente estudo, usando o nosso modelo anteriormente descrito (a célula HaCaT proliferando linha), que geneticamente silenciados o receptor e examinados os efeitos no crescimento celular, metabolismo mitocondrial e vias biossintéticas. Os dados recolhidos fornecem evidência de um novo papel do VDR como um regulador negativo da atividade da cadeia respiratória, e destacam-se as repercussões para o anabolismo celular e crescimento produzido pela VDR na respiração mitocondrial. Com base em nossas observações, concluímos que o VDR, restringindo a atividade respiratória mitocondrial, permite que a célula de sobra intermediários metabólicos, que podem ser desviados de metabolismo oxidativo em direção a um destino biossintética, apoiando o crescimento celular. Nós validado o papel geral da VDR como um potenciador de proliferação celular estender nossas observações a várias linhas de células humanas de câncer.

Resultados

VDR silenciamento em células HaCaT dificulta celular proliferação

Porque nós previamente caracterizado VDR importação mitocondrial em células HaCaT, usamos este modelo para investigar a função VDR usando silenciamento genético. A redução dos níveis de VDR no momento da entrega lentiviral de shRNA que tinha sido produzido contra o VDR humano foi notável, como demonstrado por análise de ARNm e proteína na fig. 1A e 1B, e provocou a paragem do crescimento potente em células HaCaT, como avaliado utilizando um ensaio de proliferação, que evidenciaram uma diminuição evidente da taxa de crescimento em células de VDR-silenciados em comparação com células de controlo (Fig. 1C). a paragem do crescimento celular foi caracterizado pela acumulação da população de células VDR derrubar na fase G0 /G1 do ciclo celular e um decréscimo na população de células de fase M (Fig. 1D). Não há sinais de células apoptóticas ou que sofrem eram evidentes nas células silenciados, como demonstrado pela análise do ciclo celular, o qual não revelou um pico sub-G0, e o ensaio de toxicidade MTT, que revelaram viabilidade idêntica no controlo e células silenciados (Fig. 1E).

células subconfluentes HaCaT foram infectadas com lentivírus VDR shRNA 3 e shRNA partículas de controle. Sete dias após a infecção e puromicina selecção, expressão VDR foi avaliada nos extractos celulares. níveis de expressão de ARNm de (A) foram quantificados utilizando a análise em tempo real de transcritos de VDR, e os valores são expressos como alterações de dobragem nas células silenciados em comparação com os controlos. (B) a expressão VDR nas fracções mitocondriais (painéis da esquerda) e os lisados ​​totais (painéis da direita) a partir de células transfectadas VDR shRNA controlo shRNA-transfectadas e foi analisado utilizando transferência de Western. Tubulina detectada em extractos totais e níveis VDAC em fracções mitocondriais foram utilizados como controlos internos para a carga de proteína. Os efeitos de VDR silenciamento em proliferação foram avaliadas utilizando um ensaio de violeta cristal, em células que tinham sido coradas em vários momentos após a sementeira (C), assim como utilizando análise de ciclo celular (D) em células que foram colhidas no dia 7, pós-infecção . (E) A viabilidade celular foi avaliada utilizando o ensaio de MTT ao dia 7 após a infecção e os valores são expressos como a percentagem de absorvância do controlo shRNA. Os dados são expressos como a média ± DP de três experiências independentes. * P . 0,05 comparado com o controlo

O diferenciador e acção antiproliferativa de vitamina D in vitro tem sido previamente descrita na literatura. Tais efeitos são mediados por controlo da transcrição, que é precedido pela translocação nuclear e não ocorre em células HaCaT estimulada-vitamina D [12]. células HaCaT parecem ser resistentes aos efeitos anti-proliferativos nuclear de vitamina D, e em conformidade, descobrimos que o tratamento de vitamina D não alterou a taxa de crescimento de células HaCaT (S1, como mostrado na Fig.). Assim, as células HaCaT representam um modelo de resistência às propriedades diferenciadoras de vitamina D, e que não há qualquer incongruência entre o papel anti-proliferativa nuclear de vitamina D descritos na literatura e os efeitos proliferativos exercidas pelo VDR no nosso modelo de célula. Os resultados de nossos experimentos de silenciamento mostram que VDR em células HaCaT aumenta o crescimento celular.

mitocondrial localização do VDR é uma característica comum de linhas de células de cancro humano, e silenciamento receptor inibe a proliferação celular

para avaliar se as mitocôndrias pode ser considerado como sendo um alvo regular do VDR, avaliou-se a sua expressão em um painel de linhas celulares de cancro humano, e as células HaCaT acima mencionados (Fig. 2A). Em cada linha de células que testaram positivo para a expressão de VDR, os extractos mitocondriais foram analisadas através de Western blotting e revelou a presença do receptor. Nossa hipótese é que se o VDR foi uma característica marcante de células em proliferação e tinha o potencial de facilitar o crescimento celular, como sugerido pelo fenótipo observado em células HaCaT silenciados, então ele poderia facilmente ser poupado, ou mesmo eliminados, em um estado diferenciado. Assim, avaliamos os níveis de expressão de VDR em dois modelos, permitindo a análise de células em proliferação humanos e os seus homólogos diferenciadas: Foram comparados HaCaT proliferação de células de queratinócitos para totalmente diferenciada queratinócitos primários e células rabdomiossarcoma RD18 que tinham sido induzidos a diferenciar pela expressão condicional de miR-206 [16]. extractos mitocondrial de ambas as populações de células diferenciadas revelou diminuição da expressão do receptor em comparação com os níveis observados na proliferação de células (Fig. 2B).

(A) VDR expressão foi analisada num painel de várias linhas de células humanas utilizando Western blotting em lisados ​​totais (tOT VDR) e os extractos mitocondriais (Mitoc VDR). Para as células MCF7 e RD, detecção VDR necessária uma maior duração de exposição a ECL. (B) Dois modelos de diferenciação celular foram utilizados para avaliar os níveis de VDR no total e lisados ​​fracções mitocondriais: As células humanas em proliferação HaCaT comparada queratinócitos diferenciados primárias humanas e células de diferenciação RD18-indutível que transportam um miR-206 que expressam o vector lentiviral doxiciclina induzível na ausência (não induzidas: Ni) ou na presença de doxiciclina durante quatro (induzida: IND4) e seis dias (induzida: IND6). Tubulina detectada em extractos totais e níveis VDAC em fracções mitocondriais foram utilizados como controlos internos para a carga de proteína. Os borrões são representativos de um conjunto de três experimentos independentes

Depois de detectada a expressão mitocondrial generalizada do VDR, buscou-se confirmar que VDR ablação compromete a proliferação celular.; Assim, suprimida a expressão VDR em todas as linhas celulares de cancro por meio de silenciamento genético. expressão VDR foi silenciada em todas as linhas celulares VDR-positivas, bem como as células HaCaT, a expressão do receptor e foi mais uma vez fortemente reduzida, como avaliado em ambos os extractos totais e as fracções mitocondriais (Fig. 3a). As observações feitas em células HaCaT foram fortemente suportada pelos resultados destas experiências knockdown porque a proliferação de todas as células foi marcadamente inibida pelo VDR silenciamento. Na verdade, fomos capazes de demonstrar uma redução geral da taxa de proliferação de todas as células silenciados, que foi semelhante ao observado nas células HaCaT, quando o seu crescimento foi avaliada entre 72 horas e 5 dias, em comparação com a do selvagem as células do tipo (fig. 3B). O fenótipo silenciados foi confirmada utilizando um shRNA diferente para o VDR (shRNA 4, como descrito na secção de Métodos), que foi o mais eficiente em silenciamento do VDR como shRNA 3 e também diminuiu o crescimento das células (S2 Fig.). Além disso, quando se emitiu um shRNA que era ineficaz em termos de VDR silenciamento (shRNA 2, tal como descrito na secção de Métodos) a proliferação das células HaCaT não foi restringida (S2 Fig.).

(A) as células foram infectadas com lentivírus VDR shRNA 3 ou shRNA controlo e a eficácia silenciamento foi examinada em ambos os extractos totais e mitocondriais utilizando western blotting. Tubulina detectada em extractos totais e níveis VDAC em fracções mitocondriais foram utilizados como controlos internos para a carga de proteína. (B) Ambos os silenciados e as células de controlo foram submetidas a ensaios de proliferação de sete dias após a infecção e selecção. As células foram coradas em 72 horas ou cinco dias após a sementeira, e os valores para as células silenciados são expressos como a percentagem dos seus respectivos controlos. Os dados são expressos como a média ± DP de três experiências independentes. * P . 0,05 comparado com o controlo

VDR silenciamento aumenta a respiração mitocondrial

Outros receptores de esteróides tenham sido previamente indicado para regular a transcrição e a actividade mitocondrial [17] – [19], levando-nos a investigar se o VDR, que está localizada no compartimento mitocondrial (semelhante à dos seus análogos da família), controla o metabolismo mitocondrial. Em primeiro lugar, foi avaliada a atividade respiratória mitocondrial de células HaCaT medindo as variações no potencial da membrana através da análise JC-1 utilizando citofluorimetria. Como se mostra na fig. 4A, VDR silenciamentos fortemente aumentado o potencial de membrana mitocondrial, e quando sujeito essas células ao estresse oxidativo (H

2O

2), o seu potencial foi prejudicada a uma extensão maior do que a de células de tipo selvagem sujeito à mesma tratamento (Fig. 4A). No entanto, quando as células foram expostas a uma tensão diferente, não oxidativa (por exemplo, induzida por stress osmótico sorbitol), o potencial mitocondrial de ambos tipo selvagem e derrubar células diminuiu na mesma medida (Fig. 4B). Com base nestas observações, concluímos que o VDR inibiram o potencial de membrana mitocondrial e provavelmente conteve a produção de ROS, protegendo a célula contra o estresse oxidante adicional. Pelo contrário, a perda de VDR aumentou o potencial respiratório, mas as células fundidas mais propenso a um potencial colapso impulsionado-oxidante. Esta possibilidade foi apoiada pelo consumo significativamente inferior glutationa (GSH) em células do tipo selvagem, como revelado pelos níveis mais elevados de a molécula anti-oxidante que foram medidos em células do tipo selvagem em comparação com células silenciados (S3 Fig.).

células HaCaT foram infectadas com controlo shRNA ou VDR shRNA 3 e o potencial de membrana mitocondrial foi examinada utilizando JC-1 avaliação de citometria de fluxo, na presença ou ausência de dois factores de stress diferentes: (a) de controlo e células silenciados foram tratados quer com mM H 10

2O

2 ou (B) 0,5 M sorbitol. Em ambas as figuras, uma imagem representativa da análise de citometria de fluxo é mostrado no painel de topo, enquanto que os resultados de três experiências independentes estão representados no gráfico no painel inferior. A proporção FL-2 /FL-1 foi calculada e os valores são expressos como uma percentagem do controlo não tratado shRNA. * P 0,05 comparado com o controlo não tratado shRNA,

$ P 0,05 comparado com o controlo tratado shRNA. (C) análise em tempo real da COX II (COX II) e IV (COX IV) expressão da subunidade transcrição em células de controlo e silenciados. Fold alterações são representados nos gráficos como médias ± SD de três experiências independentes. * P 0,05 e ** P 0,01 comparado com o controlo de shRNA. células (D) HaCaT foram cultivadas na presença ou ausência de 10 nM de vitamina D e de COX II e IV COX transcrição de expressão foram avaliados através de análise em tempo real após 24 e 48 horas de tratamento. Os valores representados nos gráficos representam a mudança vezes na expressão de transcrição no tratado versus células não tratadas e são apresentados como médias ± SD de três experiências independentes.

§ P 0,05 e

§§ P . 0,01 em comparação com as células não tratadas

potencial mitocondrial é sustentada pelo gradiente de prótons que é criado pela atividade da cadeia respiratória; portanto, decidimos analisar a expressão de duas subunidades de complexo IV: citocromo c oxidase (COX) subunidades II e IV, cujas transcrições são de mitocondrial (o primeiro) e nuclear (o último) origem. Ambas as proteínas codificadas Nucleares e mitocôndrias são necessários para a formação de complexos de activos respiratórios. RNAs mitocondriais são transcritas como longas transcrições, policistrónicos precursores que são posteriormente processados ​​para libertar rRNAs e mRNAs individuais. Por conseguinte, considerou-se a COX II ser um marcador da actividade de transcrição mitocondrial e COX IV ser um marcador da contribuição nuclear para modulação da cadeia respiratória.

Foi observada expressão aumentada de ambas as subunidades em células silenciados em comparação com células de controlo utilizando PCR em tempo real (Fig. 4C). A fim de confirmar que o VDR afectada negativamente a transcrição da COX, que trataram células HaCaT tipo selvagem com a vitamina D e observou-se que os níveis de todos os transcritos foram reduzidos (Fig. 4D). Dado o facto de que a transcrição da subunidade IV é nuclear, enquanto que a subunidade II é codificado pelo DNA mitocondrial (mtDNA), concluiu-se que a vitamina D de controlo transcricional é exercida em ambos os níveis, o que não é surpreendente, dado o facto de que a energia nuclear e mitocondrial a transcrição de proteínas de cadeia respiratória é finamente sintonizada [20].

Como a modulação da transcrição mitocondrial pelo VDR não foi anteriormente descrito, considerou-se a possibilidade de ligação directa do receptor de mtDNA.

In silico

análise foi realizada com o objectivo de triagem mtDNA para identificar locais de vitamina D de elementos responsivos (VDRE). Utilizou-se uma sequência VDRE representado por um conjunto de matrizes de peso posicionais (como descrito na secção de Métodos e apresentado na tabela S1B) para calcular a afinidade do VDR para a sequência de mtDNA. Apenas dois VDRE locais foram encontrados para ter pontos de corte de alta afinidade (89% e 82% da pontuação máxima) e ambos foram localizados no circuito de deslocamento (D-circular), uma organização não-codificação e região reguladora. Nós também identificou um total de 40 VDRE sites com pontuação baixa afinidade ( 60% do máximo) agrupados em algumas regiões (ver tabela 1 para obter uma descrição dos locais mais elevados VDRE afinidade e mesa S1A para a lista completa). Em alguns casos, estes locais VDRE são formados por múltiplas repetições, o que indica uma presença significativa de locais de ligação nestas regiões. É de notar que a grande maioria dos locais de VDRE foram encontradas na cadeia inversa, o que é provavelmente devido à assimetria da distribuição de nucleótidos mtDNA. Além disso, sites de baixa afinidade foram enriquecidos no segmento hipervariável 1 (p = 0,01425). A elevada afinidade dos sítios identificados VDRE permite a possibilidade de controlo da transcrição directa VDR-mediada de mtDNA. Mais estudos são planejados para investigar as características dessa ligação.

O aumento do potencial de membrana que foi observado nas células silenciadas, combinado com a expressão induzida de transcritos COX, demonstrou que a cadeia respiratória foi potencializado in células HaCaT silenciados.

em conjunto, nossos resultados indicam que o VDR desempenha um papel na modulação negativa da expressão da cadeia respiratória e atividade respiratória, que ambos os moderados potencial de membrana e é protetor contra o estresse oxidativo.

VDR silenciamento minimiza a utilização de acetil-CoA em vias biossintéticas

em um esforço para vincular o crescimento celular reduzida e aumento do potencial mitocondrial, que foi observada em VDR derrubar células, a hipótese de que uma intensa atividade da cadeia respiratória estimula o ciclo de TCA em células silenciadas. Em células quiescentes, a função fundamental da mitocôndria é a produção de ATP por meio de uma cadeia de transporte de electrões que se alimentam de ciclo do TCA e fosforilação oxidativa, a fim de fornecer energia para uma variedade de funções celulares; Em contraste, as células cancerosas não são fortemente dependentes OXPHOS por suas demandas de energia e intermediários do ciclo de TCA re-direta para preservar sua função biossintética. Assim, nas células em proliferação, as vias mitocondriais são religados para suportar a proliferação.

Os nossos dados sugerem que a VDR, reduzir as exigências metabólicas da cadeia respiratória, pode reprogramar o ciclo do TCA e seus intermediários podem ser utilizados em processos biossintéticos . A fim de testar esta hipótese, foram analisadas as vias biossintéticas dependentes da acetil-CoA mitocondrial desviado do catabolismo. Em primeiro lugar, considerou-se os produtos da cascata do mevalonato, ou seja o colesterol, ubiquinona e unidades isoprenic essenciais para modificações pós-traducionais das proteínas. Colesterol e ubiquinona

de novo

síntese foi medida em células HaCaT. derrubar As células de controlo e VDR foram marcados com [

3H] acetato de etilo e o teor de lípidos das células foi analisada por CCF. VDR silenciamento diminuiu o

de novo síntese de colesterol (Fig. 5A), enquanto que a taxa de biossíntese de ubiquinona não foi afectada pelo silenciamento (Fig. 5B). A síntese das unidades isoprenic foi medida como o estado de prenilação das duas pequenas GTPases RhoA: e Ras. VDR silenciamento resultou numa diminuição da prenilação de ambas as proteínas, considerando que a sua expressão global permaneceram inalterados (Fig. 5C).

células HaCaT foram infectadas com o controlo ou shRNA VDR shRNA três vias biossintéticas e foram examinados sete dias pós-infecção. A via do mevalonato foi avaliada como a

de novo síntese de colesterol (A) e a ubiquinona (B). Os valores representam as médias ± DP de três experiências independentes. (C) As unidades isoprenóides produzidos pela mesma via foram analisados ​​como incorporação porção prenil na pequena GTPases RhoA e Ras. Controlo e silenciados células foram colhidas e os lisados ​​foram submetidos a TX-114 fase de extracção, a fim de separar as formas prenilados. Total de proteínas preniladas e foram analisados ​​utilizando Western blotting. VDAC e expressão de actina demonstrou carga de proteína equivalentes dos extractos totais de fase e hidrófobos, respectivamente. (D) os níveis de acetilação de histonas foram avaliados por análise de transferência de Western utilizando um anticorpo anti-acetil H4 e tubulina como um controlo de carga. Os borrões são representativos de um conjunto de três experiências independentes.

Finalmente, a disponibilidade de unidades de acetilo para fins biossintéticas foi avaliada como acetilação de histonas e VDR silenciamento também diminuída neste processo, o qual foi medido como histona H4 acetilação (Fig. 5D).

Colectivamente, estas observações indicam que após a VDR silenciamento, o aumento da actividade da cadeia respiratória oxida intermediários metabólicos, impedindo a sua utilização em vias biossintéticas. Nós demonstramos o desvio exemplar de acetil-CoA, a incorporação de que é reduzida durante a biossíntese do colesterol, eventos prenilação e remodelação histona.

Discussão

O nosso trabalho anterior em células HaCaT demonstrado VDR localização mitocondrial e o mecanismo de importação. No presente estudo, foi identificado um novo papel surpreendentemente importante para o receptor em função organelo e o metabolismo celular, porque foi demonstrado que a actividade VDR profundamente impactos proliferação.

funções mitocondriais foram previamente descritos para outros receptores de esteróides, vários dos que estimulam a respiração mitocondrial e, portanto, são considerados para ser diferenciação receptores da hormona (isto é, o receptor de tiróide, o receptor beta de estrogénio e receptor de androgénio) ou potenciadores de gasto de energia e os fornecedores (isto é, o receptor de glucocorticóide) [17], [21], [22]. estimulo hormonal afecta a transcrição da OXPHOS mitocôndrias codificado tanto indirectamente, através da indução de sinais nucleares (tais como factores de transcrição mitocondrial, que regulam positivamente a transcrição do genoma mitocondrial), e directamente, através da localização no organelo e interagir com elementos de resposta de ADN mitocondrial [ ,,,0],23]. Até à data, a função de VDR na mitocôndria permanece descaracterizada.

No presente estudo, foi demonstrado que o RVD promove a proliferação, tal como o seu silenciamento afecta fortemente a taxa de crescimento de HaCaT e outras linhas celulares de cancro que expressa um VDR mitocondrial. Começando com as células HaCaT previamente caracterizados e estender a nossa análise a outros modelos de celular, descobrimos que a localização mitocondrial do receptor é uma característica generalizada de células em proliferação, ea associação do VDR com a proliferação foi reforçada pelos resultados de nossa análise dos diferenciada células. Observou-se uma diminuição dos níveis VDR mitocondriais em dois modelos diferentes de células diferenciadas (culturas primárias de queratinócitos representam a diferenciação fisiológica, enquanto que as células RD18 induzidas por miR-206 representam um estado diferenciado impulsionado-miRNA). Em nossa opinião, esta é uma observação interessante que merece uma investigação mais aprofundada do impacto metabólicos e mecanismos moleculares que regulam VDR regulação baixa em células quiescentes.

literatura anterior descreveu as propriedades diferenciadoras de vitamina D, tradicionalmente mediado por efeitos nucleares de VDR na transcrição. No entanto as células cancerosas são frequentemente resistentes às propriedades antiproliferativas e de diferenciação de vitamina D, como um resultado do aumento da associação do VDR com co-repressores no chromatine [24]. Isto foi relatado para o câncer de pele, entre os outros [25]. A linha de células de queratinócitos em proliferação humano HaCaT não responde à acção antiproliferativa de vitamina D (S1 Fig.), E foi demonstrado anteriormente que a translocação nuclear do VDR, que é um pré-requisito para a actividade de transcrição, não é induzida por estimulação do ligando [12 ], indicando, assim, ineficazes, ou fraco, sinalização VDR nuclear nestas células. Portanto, as células HaCaT representam um bom modelo que pode ser usado para examinar os efeitos mitocondriais de actividade VDR em um fundo eram foram perdidas as propriedades diferenciadoras de vitamina D.

silenciamento genético do VDR em células HaCaT produzidos dois efeitos que foram ligados: a proliferação, que correspondia a um aumento da expressão da cadeia respiratória e o potencial de membrana mitocondrial reduzida. Tivemos evidências de que o VDR equilibra a atividade da cadeia de elétrons, resultando em vantagens duplas para a célula: proteção contra o estresse oxidativo e apoio à proliferação através de intermediários biossintéticos facilmente disponíveis. O ex conclusão foi alcançada quando observamos o aumento da vulnerabilidade das células silenciadas a um insulto oxidativo forte, acompanhada por uma diminuição da piscina GSH intracelular. A última interpretação, o outro grande achado do nosso trabalho, foi sugerido pelas experiências destinadas a avaliar a capacidade biossintética de células HaCaT silenciados. Foram analisadas vias biossintéticas diferentes que dependem da acetil-CoA-redutase de origem mitocondrial. Acetil-CoA é um bloco de construção indispensável para a biossíntese endógena de colesterol e ácidos gordos e está envolvida na modificação de proteínas à base de isoprenóides; acetil-CoA é também necessária para as reacções de acetilação que modificam as proteínas, tais como a acetilação da histona. Descobrimos que VDR derrubar células exibida uma taxa de biossíntese reduzida da via do mevalonato, medida como a redução da produção de moléculas de colesterol e prenil a serem empregados na modificação de proteínas. Foram excluídos o facto de que nas nossas experiências fomos exclusão de modulação positiva de 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A (HMG-CoA) redutase, uma enzima chave na cascata de mevalonato porque os níveis de um dos produtos da via, ubiquinona (CoQ), não foram afetados pelo VDR silenciamento. Em vez disso, atribuída a taxa de biossíntese dificultada a diminuição da disponibilidade de acetil-CoA, e esta possibilidade foi validado pela observação de que VDR silenciamento também diminuiu acetilação da histona. A insensibilidade da síntese de ubiquinona a uma diminuição nos níveis de acetil-CoA, que é crítico para outros lípidos, pode ser devido a diferenças nos valores de Km das enzimas de ponto de ramificação na via do mevalonato. O princípio da hipótese de derivação do fluxo clássica indica que variações no tamanho do conjunto de precursor irá influenciar essencialmente a síntese de colesterol, porque o Km da sintase do esqualeno para o seu substrato é elevada, ao passo que todas as outras enzimas de pontos de ramificação apresentam baixos valores de Km ea enzimas limitantes da velocidade do ramo biossintética CoQ pode ter os mais baixos valores de Km. Infelizmente, os detalhes completos de síntese CoQ em tecidos animais continuam a ser elucidado.

Concluímos que o VDR, restringindo a atividade respiratória mitocondrial, poupa intermediários metabólicos mitocondriais, que podem ser desviados do metabolismo oxidativo em direção a um destino biossintética . Os produtos finais que foram encontrados para ser afetado por este interruptor no presente estudo são essenciais para a proliferação; Em particular, o colesterol, o qual é continuamente incorporadas em membranas, e vários relatórios indicam que cholesterogenesis é muito elevado em várias células de cancro [26] – [28]. Além disso, a prenilação é uma modificação pós-tradução de várias pequenas GTPases e é essencial para o encaixe e a actividade destes enzimas; prejudicando a actividade de GTPase interfere com a proliferação, o que tem sido extensivamente relatados para as duas pequenas GTPases que foram analisados ​​no presente estudo, RhoA e Ras, a prenilação de que é necessário para a sua capacidade de induzir a transformação maligna, invasão e metástase [29] . Finalmente, o estado de acetilação de histonas é um aspecto importante da proliferação porque representa uma estratégia de controlo epigenética cromatina remodelação. follows:

5′-CCGGCCTCCAGTTCGTGTGAATGATCTCGAGATCATTCACACGAACTGGAGGTTTTT-3′,

5′-CCGGCTCCTGCCTACTCACGATAAACTCGAGTTTATCGTGAGTAGGCAGGAGTTTTTG-3′,