Abstract

O tecido adiposo é agora considerado como um órgão endócrino envolvido no metabolismo e reações inflamatórias. Adiponectina, um hormônio peptídeo ácido 244-amino, está associada com resistência à insulina e carcinogênese. A curcumina (diferuloylmethane) é o principal curcuminoid do tempero indiano popular, açafrão. A curcumina possui efeitos anti-tumorais, incluindo a inibição da neovascularização e regulação do ciclo celular e apoptose. No entanto, os efeitos de adiponectina e curcumina sobre o cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC) permanecem pouco claros. Neste estudo, avaliou-se a expressão de adiponectina em tumores emparelhados e tecidos pulmonares normais a partir de 77 pacientes com NSCLC utilizando em tempo real da reacção em cadeia da polimerase, transferência de Western, e imuno-histoquímica. De Kaplan-Meier de análise de sobrevivência mostraram que os pacientes com baixo rácio de expressão de adiponectina ( 1) teve tempo de sobrevivência significativamente mais tempo do que aqueles com relação expressão elevada ( 1) (

P

= 0,015). A curcumina inibiu a capacidade migratória e invasiva das células A549 por meio da inibição da expressão de adiponectina, bloqueando a adiponectina receptor 1. Tratamento de curcumina também inibiu o

in vivo

o crescimento do tumor de células A549 e expressão de adiponectina. Estes resultados sugerem que a adiponectina pode ser um indicador de prognóstico de NSCLC. O efeito da curcumina na diminuição da capacidade migratória e invasiva de células A549 através da inibição da expressão de adiponectina, provavelmente, é mediada através de vias de NF-kB /MMP. A curcumina pode ser um agente terapêutico potencial adjuvante importante para o cancro de pulmão no futuro

citação:. Tsai J-R, Liu P-G, Chen Y-H, Chou S-H, Cheng Y-J, Hwang J-J, et ai. (2015) A curcumina inibe células não pequenas células do cancro do pulmão metástase através da adiponectina /NF-kB /MMPs via de sinalização. PLoS ONE 10 (12): e0144462. doi: 10.1371 /journal.pone.0144462

editor: Jeremy J. W. Chen, do Instituto de Ciências Biomédicas, TAIWAN

Recebido: 18 Agosto, 2015; Aceito: 18 de novembro de 2015; Publicação: 10 de dezembro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Tsai et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento: Este estudo foi apoiado pelos subsídios NSC 100 – 2320 – B – 037 – 012 – MY2 do Conselho Nacional de Ciência dos ROC, Taiwan para Jong-Rung Tsai.. O Conselho Nacional de Ciência dos R.O.C, Taiwan é uma organização do governo que é externo à universidade dos autores. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do pulmão continua a ser a principal causa de mortalidade relacionada ao câncer em todo o mundo e em Taiwan. Apesar dos grandes avanços na compreensão da carcinogênese de pulmão e em novos tratamentos nas últimas décadas, a taxa global de sobrevida em 5 anos permanece pobre. esforço de pesquisa inovadora deve ser redirecionada para investigar potenciais marcadores de prognóstico, os mecanismos da carcinogênese pulmonar e terapia adjuvante.

O tecido adiposo é actualmente considerado como um órgão endócrino que secreta várias citocinas (adipocinas) [1], incluindo a adiponectina e leptina. A adiponectina é um polipeptídeo ácido 244-amino que modula vários processos metabólicos como catabolismo regulação da glicose e de ácidos graxos [2]. Ela exerce efeitos significativos sobre o metabolismo e lipogênese, bem como sobre a regulação das respostas inflamatórias humanos [3]. Em adultos, as concentrações de adiponectina estão inversamente correlacionados com percentual de gordura corporal e resistência à insulina [4]. Adiponectina tem antidiabético, propriedades anti-aterogênicos, anti-inflamatórios e anti-angiogênicos [5].

O papel da adiponectina na carcinogênese é controverso [5]. Em malignidades associadas à obesidade, como o cancro endometrial, do cancro da mama pós-menopausa, câncer de cólon, câncer renal, e doenças hematológicas malignas, expressão de adiponectina está positivamente correlacionada com o risco de malignidade. Além disso, as baixas concentrações de adiponectina foram relatados no cancro gástrico e da próstata [6]. No entanto, em cancros não associados à obesidade, tais como câncer de pulmão, a adiponectina sérica não é um importante preditor de risco [7].

receptores de adiponectina 1 e 2 agem diretamente sobre as células tumorais através da ligação e ativação de receptores de adiponectina e vias de sinalização a jusante [5]. A adiponectina possui propriedades anti-angiogénese e capacidade anti-tumoral, o qual é efectuado por meio de apoptose de células endoteliais mediada por caspase [8]. Ele também pode inibir o crescimento do tumor do fígado e metástases através da supressão da angiogénese tumoral e downregulating o ROCK /IP10 metaloproteinase /matriz (MMP) -9 via [9].

No entanto, a adiponectina é um potencial marcador de próstata progressão do cancro [ ,,,0],10]. Em condrossarcoma, que medeia a migração de células de condrossarcoma de humanos pela sobre-regulação transcricional de integrina alpha2beta1 e a activação do receptor AdipoR, AMPK, p38, e as vias de NF-kB [11]. No entanto, o seu papel no câncer de pulmão permanece incerto [12,13]. Petridou et ai. relataram que os níveis circulantes de adiponectina não são correlacionados com os estágios de câncer de pulmão [14]. A expressão do receptor de adiponectina 1 é um fator prognóstico favorável para o cancro do pulmão [15].

A curcumina (diferuloylmethane), um composto natural extraído da

Curcuma longa

, tem sido usado desde os tempos antigos em o Oriente como um agente de cura para várias doenças. A curcumina tem várias atividades farmacológicas, incluindo anti-inflamatório [16], [16] antioxidante, antimicrobiana [17], e os efeitos anticancerígenos [18-21]. Os seus efeitos anti-cancerígenos são manifestados durante a proliferação celular, invasão, metástase, apoptose, angiogénese e [22]. Por exemplo, a curcumina pode induzir apoptose celular em cancro do pulmão de não pequenas (NSCLC) [23,24]. A base molecular do seu efeito anticancerígeno é atribuída ao seu efeito sobre vários objectivos, incluindo factores de transcrio, reguladores de crescimento, moléculas de adesão, genes apoptóticos, reguladores da angiogénese, e moléculas de sinalização celular [25]. Embora a curcumina inibe a migração de células de câncer de pulmão e invasão via Rac-1 ou Wnt /B-catenina vias, o mecanismo de regulação da curcumina no câncer de pulmão permanece desconhecida.

A maioria dos cancros do pulmão são diagnosticados em fase avançada, quando o tratamento é relativamente ineficaz. Como aumentar a tratamentos quimioterápicos disponíveis atualmente com medicamentos à base de plantas adjuvantes, que podem diminuir os efeitos colaterais e toxicidade sem comprometer a eficácia terapêutica, tornou-se uma abordagem popular nas últimas décadas. A curcumina é um tal potencial candidato. Este estudo explorou as funções de diagnóstico e prognóstico de adiponectina em NSCLC. Usando

in vitro

cultura de células A549 e um modelo animal, demonstramos o papel potencial da curcumina para o tratamento de câncer de pulmão. O mecanismo molecular exacto da curcumina na mediação adiponectina efeito também foi investigada. Consequentemente, o potencial da curcumina como agente adjuvante no tratamento do câncer de pulmão também serão exploradas.

Resultados

Os dados demográficos e expressão de adiponectina em NSCLC pacientes

Dos 77 NSCLC pacientes neste estudo, 58 (75%) tinha confirmado histologicamente adenocarcinoma e 19 (25%) tinham carcinoma de células escamosas. A idade média foi de 61,6 ± 10,3 anos (variação, 36-78 anos). expressão de adiponectina não foi correlacionado com tumor (T), gânglios linfáticos (N), e estágios. pacientes com NSCLC com metástases tinha significativamente mais elevada proporção de expressão de adiponectina (Tabela 1). A análise de sobrevivência de Kaplan-Meier mostrou que pacientes com NSCLC com um rácio de expressão de adiponectina baixo teve um tempo de sobrevivência significativamente maior do que aqueles com uma alta taxa de expressão de adiponectina (

p

= 0,015) (Fig 1). rácios de risco-ajustada multivariada foram calculados a partir de regressão de Cox com as variáveis ​​adicionais de sexo (masculino versus feminino), metástase, tumor, comprometimento dos linfonodos, e etapas (Tabela 2). O grupo expressão alta adiponectina tinha um 2,40 vezes maior risco de mortalidade (

p

= 0,04) do que o grupo de expressão baixa.

Os níveis de expressão de adiponectina, receptores de adiponectina, e MMPs em NSCLC pacientes

Os níveis de expressão de adiponectina, receptores de adiponectina, e MMPs de pacientes com NSCLC foram analisados ​​(Fig 2). coloração imuno-histoquímica e transferência de Western de tecido de cancro do pulmão mostraram uma expressão aumentada de receptor de adiponectina e adiponectina 1 no tecido de cancro do pulmão do que em tecido pulmonar normal (Figura 2A-2C). Todas as MMPs também foram aumentados no tecido de cancro do pulmão do que no tecido de pulmão normal (Figura 2D-2F).

As amostras (A) (cancro do pulmão e os tecidos pulmonares normais adjacentes correspondentes) foram analisadas com anticorpos para adiponectina , receptor de adiponectina 1, 2 e receptor de adiponectina por coloração imuno-histoquímica (coloração com hematoxilina DAB e de contraste). Para controlos negativos, o anticorpo foi substituído com IgG de controlo. (B-C) Os níveis de expressão de adiponectina, receptor de adiponectina 1, e do receptor de adiponectina 2 em três pares de cancro do pulmão e nos tecidos normais analisados ​​por western blotting. (D-F) zimografia de gelatina foi utilizada para analisar as actividades de MMP-2 /MMP-9, MMP-1 /MMP-3, MMP-13 e /MMP-14. *

p Art 0,05 vs. tecido pulmonar normal, com dados representativos de três pacientes diferentes com NSCLC. T, tumor; N, normal; ADN, adiponectina; AdipoR1, receptor de adiponectina 1; AdipoR2, receptor de adiponectina 2.

efeito citotóxico da curcumina sobre a expressão de receptores de adiponectina e adiponectina em células A549

As células A549 foram tratadas com diferentes concentrações de curcumina. O ensaio de MTT revelou que a curcumina teve um efeito citotóxico sobre as linhas de células A549 em concentrações 75 uM (Fig 3A). Western blotting também revelou que a expressão de adiponectina em células A549 diminuiu significativamente numa concentração de curcumina 50 uM (Fig 3B). A expressão da proteína do receptor de adiponectina um receptor de adiponectina e 2 não se alterou com o tratamento de curcumina, mesmo em altas concentrações. A transfecção das células A549 com vector de adiponectina ou um pequeno ARN interferente plasmídeo (siARN) aumentou com sucesso ou silenciados a expressão de adiponectina, como demonstrado pela reacção em cadeia da polimerase (PCR) e Western blot (Fig 3C e 3D).

(a) a viabilidade celular foi analisada pelo ensaio de MTT. O efeito citotóxico da curcumina foi evidente em concentrações 75 uM. os níveis de (B) a expressão de adiponectina, receptor de adiponectina 1, e do receptor de adiponectina 2 em células A549 foram analisados ​​por transferência de Western em diferentes concentrações de curcumina. (C-D) indução exógena e silenciamento da expressão de adiponectina em células A549. expressão /proteína de ARNm em células A549 adiponectina aumentaram significativamente após a expressão de adiponectina exógena, tal como analisada por PCR em tempo real. expressão de adiponectina diminuiu significativamente após o silenciamento adiponectina mediada por siRNA. NC-siRNA serviu como um controlo negativo. fotos representativas de três experimentos independentes. *

p Art 0,05 controle vs.. Os ensaios foram realizados em triplicado.

Efeitos de curcumina e adiponectina na capacidade migratória e invasiva de células A549

migração celular foi analisada pelo ensaio de zero ferida, enquanto a invasão foi determinada por revestidos por Matrigel ensaio de câmara de Boyden. Em comparação com o grupo de controlo, a capacidade migratória e invasiva de células A549 foi significativamente inibida com tratamento curcumina de um modo dependente da dose (

P

0,05) (Figura 4A e 4B). Por outro lado, a adiponectina recombinante aumentou a capacidade invasiva e migratório das células A549 de forma dependente da dose (

P

0,05). (Fig 4C e 4D)

(A) migração celular foi determinada utilizando o ensaio de zero ferida e analisados ​​utilizando o software Wimasis WimScratch. A capacidade migratória das células A549 foi significativamente inibida pelo aumento de dosagem curcumina em comparação com o grupo de controlo (

P

0,05). (B) Invasividade foi determinada por ensaio de câmara de Boyden Matrigel-revestido. Curcumina diminuiu significativamente a capacidade invasiva de células A549 (

P

0,05) quando a concentração de curcumina foi 25 uM. (C-D) A aplicação de adiponectina recombinante (rADN) aumentou significativamente a capacidade migratória e invasiva das células A549 (

P

0,05). Os resultados de três experiências independentes são apresentados; os ensaios foram realizados em triplicado.

papéis reguladores de receptor receptor-1 e adiponectina adiponectina 2 na migração e invasão de células A549

As células A549 foram transfectadas com adiponectina siRNA, adiponectina receptor de receptor de um siRNA, e adiponectina 2 plasmídeo siARN. O plasmídeo de transfecção reduziu significativamente os níveis de adiponectina, receptor de adiponectina 1, e do receptor de adiponectina 2 Expressão em células A549, conforme confirmado por Western blotting (Figura 5A-5C). Silenciar a expressão de adiponectina não afectou a expressão de ambas, a adiponectina receptor de receptor de 2 1 e, mas silenciar a expressão do receptor de adiponectina 1 bloqueou o efeito de adiponectina, o que aumentou a capacidade migratória e invasiva das células A549. No entanto, silenciar a expressão do receptor de adiponectina 2 não antagonizou o efeito de adiponectina na migração e invasão de células A549 (Figura 5D e 5E).

(C-A) Os níveis de expressão de adiponectina, receptor de adiponectina 1, e do receptor de adiponectina 2 foram analisados ​​por transferência de western após a transfecção com o vector de silenciamento de adiponectina ou por siADN, siAdipoR1, e siAdipoR2. (D-E) A capacidade migratória e invasiva de células A549 foi inibida após o silenciamento da expressão do receptor 1 adiponectina por transfecção com siAdipoR1.

vias regulatórias da curcumina na expressão de adiponectina

as células A549 foram tratadas com vários tipos de inibidores, incluindo os inibidores de PI3K /AKT e mapa de vias de cinase {PI3K (LY294002; 10 uM), AKT (Api-59; 3