Abstract

Fundo

Tpr é uma proteína de dupla espiral grande localizado no cesto nuclear do complexo do poro nuclear para a qual muitas funções diferentes foram propostos a partir de levedura para humano.

Metodologia /Apreciação Principais

Aqui nós mostramos que a depleção de RTP por interferência de RNA aciona prisão G0-G1 e, finalmente, induz uma dependente da presença de p53 fenótipo senescente-like. Nós também descobrimos que a depleção Tpr prejudica o NES [seqüência de exportação nuclear] dependentes de exportação nuclear de proteínas e faz com que co-esgotamento parcial de Nup153. Além disso impactos exaustão Tpr no nível e função do SENP2 SUMO-protease afetando regulação SUMOilação no poro nuclear e SUMOilação global na célula.

Conclusões

Os nossos dados para o primeiro tempo, proporcionar evidência de que um componente nuclear de poro desempenha um papel no controlo da senescência celular. Nossos resultados também apontam para novos papéis para Tpr na regulação da SUMO-1 conjugação no poro nuclear e confirme diretamente envolvimento Tpr na exportação nuclear de Nes-proteínas

Citation:. David-Watine B (2011) silenciando Pore Nuclear Protein Tpr provoca uma senescentes-Like Fenótipo em células cancerosas. PLoS ONE 6 (7): e22423. doi: 10.1371 /journal.pone.0022423

Autor: Michael Polymenis, Texas A M University, Estados Unidos da América

Recebido: 01 de abril de 2011; Aceito: 22 de junho de 2011; Publicação: 19 de julho de 2011

Direitos de autor: © 2011 Brigitte David-Watine. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Institut Pasteur. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:.. O autor declarou que não existem interesses conflitantes

Introdução

complexos poro nuclear (NPCs) mediar todos os transportes bidirecional seletiva entre o núcleo eo citoplasma. As evidências também está emergindo apontando para papéis adicionais para NPCs, suas proteínas constituintes (nucleoporina) e proteínas de transporte associadas, alguns dos quais são independentes dos transportes clássica [1], [2]. Pode, portanto, razoável a hipótese de que NPCs são fundamentais em condições de células patológicas em que o crescimento celular anormal é uma característica central.

A proteína Tpr (para a região do promotor translocado) e seus homólogos são um componente conservada no lado nuclear de NPC . Nos mamíferos Tpr é uma proteína estrutural de 267 kDa com um domínio N-terminal longa que se associa em um dímero paralelo para formar um, em espiral espiralada e duas de cadeia. O domínio C-terminal é altamente ácida e está previsto para ser desestruturado [3]. Em células de mamíferos Tpr é restrita às fibrilas nucleoplasmic do NPC e tem sido sugerido que actua como o principal elemento de arquitectura do cesto nuclear [4], [5]. Mammalian Tpr está amarrado a NPC através de interações com Nup153 [5], [6], [7], [8]. Muitas funções têm sido atribuídas a Tpr e os seus homólogos em diferentes espécies para além de um papel na arquitectura NPC. Estes incluem controle de mRNA de exportação [9], [10], a exportação de proteína nuclear [4], [11], a organização telomérica cromatina silenciosa e controle do comprimento dos telômeros [12], [13], [14]. Além disso, Drosophila e Tpr humana têm sido mostrados para ser envolvido no controlo do ponto de verificação do fuso [15], [16], [17] e Tpr humano no controlo da translocação Erk2 nucleo-citoplasmático [18].

homólogos TPR em leveduras, Mlp1p-Mlp2p, estão envolvidos na fixação SUMO-protease Ulp1p a NPC [19], [20]. Esta interacção parece ser funcional conservado em Arabidopsis thaliana e entre ESD4 NUA, que são homólogos de Ulp1p e Tpr, respectivamente [21]. SUMOilação corresponde à conjugação pós-translacional de SUMO (modificador pequena proteína relacionada com a ubiquitina) para um resíduo de lisina específica em uma proteína-alvo. SUMOilação é mediada por uma reacção enzimática em cascata que envolve, sucessivamente, uma enzima activadora E1 e SUMO ou uma enzima E2 SUMO-conjugar original, Ubc9. modificação SUMO é reversível uma vez que proteases específicas do SUMO pode desconjugar o radical SUMO das proteínas modificadas, sugerindo que SUMOilação proteína é regulada de forma dinâmica em células [22], [23]. Entre os SUMO-proteases relacionadas com a Ulp1p que foram caracterizadas em mamíferos, e SENP1 SENP2 mostra a maior semelhança com levedura Ulp1 e também estão associadas com o envelope nuclear. Ulp1p e SENP2 compartilhar a propriedade de ser dirigida a NPC por seus domínios N-terminais não catalíticos [24]. No entanto, nos vertebrados, o domínio de direccionamento NPC N-terminal em SENP2 interage com o domínio C-terminal no Nup153, mas não com Tpr [25], [26].

A senescência celular foi descrito pela primeira vez como ” senescência replicativa “por causa do tempo de vida limitado de fibroblastos diplóides humanos in vitro [27]. Os estudos em células de cancro têm demonstrado que, apesar do facto de que eles são capazes de se dividir indefinidamente, um estado que se assemelha de perto a senescência replicativa pode ser aguda induzida por vários estímulos, tais como agentes quimioterapêuticos e radiação. Isto representa, portanto, um outro programa de células, para além da apoptose, que podem limitar a proliferação de células [28], [29]. As células senescentes são caracterizados por o tamanho da célula alargada, morfologia achatada, incapacidade de sintetizar ADN e de expressão associada a senescência (SA) -β-galactosidase, o biomarcador da senescência [30].

Relatamos aqui que Tpr é crítico para a proliferação celular e que a depleção de Tpr conduz a um fenótipo semelhante a senescência, que é dependente de p53. Além disso, os impactos Tpr down-regulação em matéria de exportação nuclear de proteínas com uma sequência CRM1-dependente da exportação nuclear (NES). Níveis de Nup153 e função SENP2 no poro nuclear também são afetados. Como consequência foram observadas modificações substanciais no padrão de SUMO-1 conjugação a NPC e no interior da célula.

Resultados

Tpr knockdown induz a paragem do G0-G1 e um fenótipo senescente em células HeLa

Tpr foi recentemente descrito ter várias funções diferentes, mas o seu papel no ciclo celular, o destino e proliferação celular nunca foi totalmente avaliada. Investigamos assim o efeito de depleção de Tpr sobre o ciclo celular utilizando ARNsi de segmentação Tpr em células HeLa. Verificou-se que o nível de proteína Tpr foi especificamente reduzida após 48 horas de tratamento com qualquer um dos dois siRNAs sintéticos utilizados, conforme mostrado por análise de Western blot de extractos celulares totais de células HeLa tratadas (Fig. 1A e S1A).

células HeLa semeadas em placas de 24 poços a 5 10

-4 células por poço foram tratadas com ARNsi Tpr ou simulados. 1A. 48 horas após o tratamento com siRNA como indicado na parte superior da figura, um extracto de células foi preparado e analisado por transferência de Western utilizando anti-Tpr Mab 203-37; tubulina foi utilizada como controlo de carga. 1B. imagem brilhante campo (painel da direita) e imagem confocal (painel esquerdo) das células HeLa marcadas com um anticorpo monoclonal anti-Tpr após 2 dias de transfecção com Tpr ou simulada siARN. Barra de escala: 5 um. 1C. curva de crescimento de células HeLa transfectadas com Tpr, simulada siRNA ou não transfectadas: controle (Ctrl). 1D. FACS perfis representativos de siRNA simulado tratado (painel da esquerda), Tpr siRNAs células tratadas (centro) e células não-transfectadas ou de controlo (direita). células fixadas com etanol, foram incubadas com PI e analisadas por FACS para ploidia. O número de células é representada sobre o eixo e o conteúdo de ADN vertical, sobre o eixo horizontal. fases G0-G1 e G2-M são representadas como primeiro e segundo picos a partir do eixo vertical, respectivamente. O domínio listrado intermediário corresponde à fase S. 1E. A indução da senescência: as células foram plaqueadas a baixa densidade e tratou-se com Tpr ou ARNsi simulados. Após 6 dias, as células foram fixadas e coradas para a actividade de SA-β-gal a pH 6,0. Barra de escala: 20 ^ m. 1F. A quantificação de células positivas SA-β-gal em culturas esgotadas de Tpr e coradas para a actividade de SA-β-gal a pH 6,0. 1G-1H. células U2OS foram transfectadas com ARNsi Tpr ou simulados. 1G: Após 6 dias, as células foram fixadas e coradas para a incorporação de BrdU e actividade SA-β-gal a pH 6,0. Barra de escala: 15 ^ m. 1H: Após 6 dias, as células foram marcadas com anticorpos anti-anti-MacroH2A HP1γ e e DAPI. Barra de escala: 5 um. 1I: células A375 foram transfectadas com ARNsi Tpr ou simulados. Após 6 dias, as células foram fixadas e coradas para a actividade de SA-β-gal a pH 6,0. Barra de escala: 15 mm

Em seguida, determinaram a localização em células HeLa por microscopia confocal (Fig 1B.).. secções ópticas através do centro do núcleo mostrou o padrão característico de pontuar nucleoporina no NE. A exposição a siRNAs dirigidos contra Tpr reduziu dramaticamente a Tpr padrão pontuada no NE (Fig. 1B). Desde Tpr foi eficientemente baixo regulamentada nessas condições, fomos capazes de analisar o seu papel no crescimento e viabilidade celular. Nós descobrimos que o tratamento com a proliferação celular deficiente Tpr siRNAs, em comparação com as células tratadas com siRNA simulada (Fig. 1C). Para investigar se este foi devido a uma proliferação celular parado ou a morte celular, as células foram tratadas com iodeto de Anexina-V e de propídio para rotular os núcleos de células mortas e as células foram analisadas por células activadas por fluorescência (FACS). Não se observou qualquer diferença macroscópica entre as células tratadas com siRNA Tpr e os controlos, indicando que o defeito de crescimento não foi devido a apoptose (dados não apresentados).

Para caracterizar ainda mais o efeito do knockdown Tpr sobre a proliferação celular, analisou-se a distribuição do ciclo celular de células e os controlos tratados com siRNA Tpr medindo o seu teor de ADN por FACS. Notou-se que a transfecção simulada siRNA não afectar o ciclo celular de células HeLa quando comparada com células não tratadas. Por outro lado, o ciclo celular foi preso na fase G0-G1 em células de knockdown TPR como mostrado na Fig. 1D. Aproximadamente 46% do controlo transfectadas e não transfectadas (células 2 dias após a transfecção) estavam na fase G0-G1 do ciclo celular, ao passo que 69% das células estavam em Tpr knockdown G0-G1. Ao mesmo tempo, cerca de 37-38% das células de controlo progrediu para a fase S em comparação com apenas 16% das células Tpr knockdown (Fig. 1D). A mesma proporção de células foram vistos na fase G2-M em todas as três condições. Foram obtidos resultados semelhantes com as duas sequências de siRNA Tpr (Fig. S1B).

, em seguida, realizado um ensaio de formação de colónia, como uma medição independente do defeito proliferação desencadeada por depleção Tpr. Uma redução substancial (36%) no número de colónias foi aparente quando as células foram transfectadas com ARNsi Tpr em comparação com células falsamente transfectadas (Fig. S1C). Estes resultados sugerem que a transfecção de células HeLa com Tpr siRNAs diminuiu drasticamente a proliferação de células tumorais.

Um exame mais cuidadoso das células tratadas com siRNA RTP mostraram que uma fração delas tinha um fenótipo bastante “grave” em que eles tinham o aparecimento de senescência com um citoplasma expandido grosseiramente. Isso nos levou a realizar novas investigações voltadas para essa resposta particular. Em ensaios de RNAi transitórios, o tempo de esgotamento eficaz da proteína-alvo é não superior a quatro dias, enquanto as células knockdown TPR foram presos em G0-G1. Enquanto isso, as células não transfectadas continuam a dividir-se rapidamente e ultrapassar as células que não se dividem. Por esse motivo, as condições sob as quais as células foram plaqueadas a baixa densidade estabelecido (5,10

4-10

5 por poço numa placa de 6 poços-) para minimizar o efeito de overgrowing células não transf ectadas.

as experiências nestas condições demonstraram que uma grande fracção da população começaram a alterar a morfologia 3-4 dias após a transfecção: células foram ampliadas e achatadas (Figura 1E.). Um importante teste de senescência é actividade SA-β-galactosidase medido a pH ácido [30], e 6 dias após a transfecção, a maioria das células alargadas e achatadas estavam β-gal positivos e de cor azul (cerca de 40%) em poços de knockdown TPR , enquanto que as células azuis como senescentes foram raros (cerca de 10%) na célula simulada tratados (Fig. 1F).

Tpr siRNA knockdown senescência também induzida em duas outras linhas de células tumorais, U2OS, uma célula de osteosarcoma humano A linha, e células de melanoma humano A375 (Fig. 1G-1I). coloração BrdU demonstrou que as células positivas SA-β-galactosidase foram negativos com BrdU (Fig. 1G). Além disso, as células U2OS tratados com siRNAs Tpr e controlos foram marcadas com anticorpos específicos para a variante histona macro-H2A e HP1γ, dois marcadores de constitutiva heterocromatina do SAHF (senescência associada focos heterocromatina) que foram inicialmente identificadas em fibroblastos humanos senescentes [31] , [32]. Muitos macro-H2A e HP1γ focos positivos e colocalizing foram observadas em U2OS células senescentes núcleos, enquanto eles estavam ausentes em núcleos de controle. DAPI pontos brilhantes indicando heterocromatina colocalized com macro-H2A e rotulagem HP1γ pode ser visto na Fig. 1H.

esgotamento Tpr induz a acumulação nuclear de p53

Como a via p53 está frequentemente envolvida em bloquear o desenvolvimento do tumor, desencadeando a senescência celular ou apoptose em resposta ao estresse é importante para avaliar o estado p53 celular quando Tpr é esgotada.

o primeiro imunocitoquímica utilizado para analisar a distribuição de p53 e, ao mesmo tempo estudado o efeito da depleção Nup153 como esta tem sido mostrado para deslocalizar Tpr do poro nuclear para o interior do núcleo. Como mostrado na Fig. 2A, o sinal de p53 apareceu rotulagem pontuada como intensa no núcleo das células e Tpr- Nup153- empobrecido. Nenhum sinal foi observado nas células de controlo. Por comparação, ao passo que o esgotamento de Nup133, um nucleoporina andaime que desempenha um papel importante na estrutura de poros nucleares e função, não induz qualquer acumulação nuclear de p53 [33], tal acumulação foi observado nas células U2OS Tpr-empobrecido (dados não mostrados) . Estes resultados mostram que a depleção Tpr ou mislocalization levar a uma acumulação nuclear de p53.

2A. Análise de distribuição de p53 em células HeLa por imunofluorescência. Painel superior: células HeLa foram transfectadas com Tpr, Nup153 e siRNAs simulados, indicados no lado esquerdo; painel inferior: células HeLa foram transfectadas com Nup133 e siRNAs simulados. As células foram fixadas no dia 2 pós -transfection e marcadas com um Tpr anti-anticorpo (painéis superior esquerdo) ou anti-Nup133 (painel inferior esquerdo) e um anti-p53 (superior direito e painéis inferiores). 2B. Os lisados ​​de células HeLa de proteína celular total foram separadas por SDS-PAGE e imunotransferidas com anticorpos específicos para Tpr, p53, p21, p16 e da tubulina, tal como indicado na figura. 2C. Os lisados ​​de proteína de célula total de células U2OS tratados com Tpr, Tpr ou p53 + siRNAs de controlo (simulados) foram separadas por SDS-PAGE e imunotransferidas com anticorpos específicos para Tpr, p53, p21 e da tubulina, tal como indicado na figura. 2D. Co-depleção de p53 e Tpr invertida indução senescência. As células foram transfectadas com simulada, Tpr, p53 ou p53 Tpr e em combinações, como indicado. A concentração final de ARNip foi de 100 nM em cada caso e de compensação foi feita com siRNAs simulados. As células foram marcadas para SA-β-galactosidase no dia 6 após a transfecção e o resultado é dado como a percentagem de células positivas para SA-β-galactosidase em cada uma das três experiências independentes.

A ciclina dependente de inibidor da quinase (CDK) p21 é elevada em muitas condições estressantes e está transcricionalmente regulados por p53. Por isso, investigou as consequências de depleção Tpr sobre os níveis de p53 e p21. Os níveis de p53 e p21 foram supra-regulados em células HeLa Tpr-empobrecido (Fig. 2B) e as células U2OS (Fig. 2C). Além disso, quando avaliadas em extractos de células em que tanto Tpr e p53 foram esgotadas, a acumulação de p21 foi visto para ser menor do que só com siRNAs Tpr (Fig. 2C). Esta observação indica que parte da acumulação de p21 observado é devido à activação de p53. Os níveis de p16 inibidores de CDK

INKA (Fig. 2B) e cyclinD1 foram também aumentadas em células HeLa Tpr-empobrecido (dados não mostrados).

Finalmente, a fim de demonstrar formalmente o papel desempenhado por p53 em mediar a indução da senescência em células Tpr-empobrecido, que co-empobrecido tanto Tpr e p53. Derrubar tanto Tpr e p53 resultou numa substancial reversão do fenótipo senescência como avaliada pela percentagem de células-SA-β-galactosidase positiva (Fig. 2D).

depleção Tpr interfere com exportação nuclear NES-dependente

tem sido sugerido que os níveis baixos de estado estacionário de p53 em células normais, ou seja, na ausência de stress celular, resultar de exportação contínua CRM1-dependente nuclear [34] e subsequente degradação citosólica de p53. Além disso, Tpr foi encontrado recentemente para interagir com CRM1 em um complexo de exportação trimérica [11]. Podemos, portanto, a hipótese de que Tpr leva a p53 acumulação nuclear e estabilização, bloqueando a sua exportação nuclear.

Para testar essa hipótese, foi usado pela primeira vez a construção pSTAT1-NES-GFP, que codifica os resíduos 367-427 da STAT1 humana que confere atividade NES [35], para evitar atos de regulamentação adicionais que interferem com a inibição de exportação nuclear CRM1-dependente. Esta construção foi co-transfectado com Tpr, CRM1 e siRNAs de controlo para sondar para exportação NES-dependente. Como mostrado na Fig. 3A, a distribuição do sinal de GFP em células vivas 48 horas após a transfecção e mostrou que Crm1- Tpr-depleção levou a retenção nuclear substancial do NES-GFP construir Considerando GFP permaneceram principalmente citosólico em células pseudo-tratados. As células foram depois permeabilizadas e marcadas com anticorpos CRM1 TPR e a verificar a eficiência de depleção (Fig. 3B).

3A-3B. Distribuição de GFP em células co-transfectadas com controle de siRNAs (simulados) STAT1-NES-GFP e da RPT, CRM1 ou. 3A: distribuição de GFP foi analisada em células vivas. Os núcleos foram marcadas com Hoechst 33342. barra de escala: 10 ^ m. 3B: As células foram então permeabilizadas e marcadas com anticorpos específicos para Tpr e CRM1 e DAPI para o ADN. Painel superior: exaustão e controle Tpr; painel inferior: exaustão e controle CRM1. Barra de escala: 10 ^ m. 3C-3D: depleção Tpr atrasa exportação nuclear de NFkB. As células HeLa foram transfectadas com ARNsi Tpr ou simulados 2 dias antes da indução de NFkB. Transfectadas e células de controlo foram então incubados com TNF de 100 UI /mL durante 40 min. TNF foi então removido a partir do meio e as células foram fixas ou mantido durante mais uma 1h30 em meio fresco antes da fixação. 3C: A quantificação do sinal de NFkB: Todas as imagens foram adquiridas com a mesma ampliação e a exposição e o sinal de NFkB foi quantificada utilizando a mesma área de superfície no núcleo e citoplasma de células sob as diferentes condições experimentais utilizando OpenLab3.1.2. O sinal citosólica foi em função do sinal nuclear e desvio padrão foi calculado usando o Microsoft Excel. Barras de erro representam o desvio padrão. Note-se que a relação sinal citosólica para nuclear é muito semelhante em células de controlo antes do tratamento TNF e 1h30 após a remoção do TNF. Este foi conforme o esperado e é devido a NFkB retornar completamente para o citoplasma neste momento. 1h30 após a remoção do TNF citosólica a relação sinal nuclear era cerca de 25% inferior nas células Tpr-empobrecido do que nas células de controlo. 3D: rotulagem de imunofluorescência de NFkB e da RPT 1h30 após a remoção TNF em células Tpr-empobrecido e controle. As células fixadas foram marcadas com um anticorpo anti-coelho e NFkB Tpr mAb anti-203-37.

Um NES CRM1-dependente funcional também é necessária para a exportação nuclear IkappaBepsilon mediada que controla o nucleo-citoplasmático distribuição e depuração nuclear pós-indução de proteínas NFkB /Rel [36]. Para melhor avaliar o efeito da depleção Tpr sobre a exportação de uma proteína endógena NES-nucleares, as células HeLa foram primeiro transfectadas com Tpr ou siRNAs simulados dois dias antes da indução NFkB por TNF. Como mostrado na Fig. 3C-3D, depleção Tpr atrasou o apuramento das NFkB a partir do núcleo, em comparação com as células tratadas simulados. Vale a pena notar que a acumulação de NFkB no núcleo após tratamento TNF não foi diferente em células tratadas mock- e da RPT-siRNAs (Fig. 3C).

Em seguida, procurou determinar se o esgotamento Tpr afeta os níveis e distribuição CRM1 , ou vice-versa. Para fazer isso, transfectadas células HeLa com siRNAs dirigidos contra Tpr e, CRM1, ou células HeLa transfectadas em falso, e 48 horas depois nós tratamos as células com Tpr- e anticorpos específicos para CRM1. análise de imunofluorescência para a expressão em células CRM1 knock-down CRM1 controle e mostraram níveis reduzidos no nucleoplasma e envelope nuclear das células CRM1 siRNA-transfectadas. Também expressão Tpr foi substancialmente reduzida nas células tratadas com ARNsi Tpr. Por outro lado, a expressão CRM1 não pareceu ser afectada pela depleção Tpr e da RPT não foi afetada em CRM1 células knock-down (Fig. S2A-B).

impactos exaustão TPR sobre a expressão e distribuição de Nup153 e SENP2 no cesto nuclear

Para avaliar melhor o papel de RTP na organização poro nuclear e função, examinamos mais cuidadosamente a relação entre o TPR eo Nup153 medindo seus níveis nos extractos totais de células transfectadas com Tpr ou Nup153 siRNAs . Tal como mostrado por análise de transferência de Western de extractos de células totais (Fig. 4A), o tratamento de células com Nup153 siRNAs conduziu ao desaparecimento quase completo de Nup153 e uma diminuição acentuada na Tpr. Esta redução nos níveis de TPR foi consistente com estudos anteriores que mostraram que Tpr é mislocalized para o interior do núcleo em células Nup153 knockdown [8]. Da mesma forma, o tratamento com ARNsi Tpr levou a uma diminuição acentuada na Tpr e um sinal Nup153 grandemente reduzida (Fig. 4A). A seguir, confirmou esta observação por análise de imunof luorescência em células HeLa tratadas com ARNsi Tpr e marcados com anticorpos dirigidos contra diferentes componentes do envelope nuclear. A marcação com um anticorpo anti-emerin e o anticorpo que reconhece todas as Mab414 nucleoporina FG-repeat-contendo incluindo Nup153 não foi grosseiramente modificada (Fig. 4B-4C). Por contraste, verificou-se que uma marcação com anticorpo anti-Nup153 específico foi reduzida (Fig. 4B-4C). Concluímos a partir destas observações que a depleção Tpr especificamente afeta o nível de proteína Nup153 no NE.

4A. As células HeLa foram transfectadas com simulada, Tpr ou Nup153 siRNAs como indicado no topo. Os lisados ​​celulares totais foram analisados ​​2 dias após a transfecção por imunotransferência, utilizando anticorpos dirigidos contra Tpr, a repetição anti-FG nucleoporina Mab414 a rotular Nup153 e Nup62 e anti-tubulina como controlo de carga. 4B-4C. Nup153 expressão é especificamente reduzido em células Tpr-empobrecido. As células HeLa foram tratados com TPR2 ou ARNsi simulados durante 2 dias. 4C. As células foram fixadas e marcadas com um anticorpo anti-Tpr e anti-emerin, anti-Mab414 ou anticorpos anti-Nup153. Barra de escala: 15 ^ m. 4D. Detalhes de rotulagem Mab414 e Nup153. Barra de escala: 5 um. 4D. Análise de expressão SENP2 em extractos nucleares de células tratadas com 293 Tpr, SENP2 e siRNAs simulados por análise de Western blot. TRF-II é usado como um controle de carga.

Dado que a depleção Tpr distribuição alterada Nup153 no poro nuclear e que Nup153 amarras SENP2 com o NPC, a hipótese de que Tpr possam ter impacto sobre os níveis de proteína SENP2 e função. Para testar esta hipótese, avaliamos o efeito da depleção Tpr em SENP2. Em primeiro lugar, dado que nenhum anticorpo está disponível para observar SENP2 endógeno em células fixadas, foram analisados ​​os níveis de SENP2 em extractos nucleares de células empobrecido em Tpr, Nup153 ou SENP2 e empobrecido em células simuladas. depleção TPR em células HeLa e 293 foi acompanhada por uma redução na SENP2 para níveis muito semelhantes às observadas em extractos depletados de SENP2. Em seguida, para comparar os diferentes níveis de proteína, que monitorizada Nup133 e TRF2 como um controlo de carga para extractos nucleares (Fig. 4D e S3A). Esgotamento de Nup153 induzida semelhante uma redução SENP2 (dados não mostrados).

esgotamento Tpr afeta SUMOilação

A constatação de que a depleção Tpr afeta SENP2 nos levou a abordar a questão de saber se o esgotamento Tpr pode interferir SUMOilação com o de outras proteínas. A fim de investigar mudanças na SUMOilação global de proteínas, células HeLa foram tratados com Tpr, SENP2 e siRNAs de controlo e de extractos nucleares e citoplasmáticos foram analisados ​​e comparados por western blotting utilizando um anticorpo anti-SUMO-1. Blots de extractos nucleares mostraram que a repressão SENP2 causou uma acumulação de peso molecular elevado SUMO-1, tal como era esperado para uma diminuição da actividade SUMO-protease. Sem tal acumulação foi observado em células transfectadas por simulação. Em contraste, as células Tpr-empobrecido apresentaram menor SUMOilação global do que os siRNAs comparadas as células transfectadas (Fig. 5a). Resultados semelhantes foram obtidos em células U2OS e 293 (Fig. S3B e dados não mostrados). Consequentemente, livre SUMO-1 foi visto a acumular-se nas células Tpr-empobrecido (Fig. S3C).

5A-5B. Análise do nível global de SUMOilação em células transfectadas com Tpr, Nup153, SENP2 e siRNAs simulados. 5A. Os extractos nucleares de células tratadas com ARNsi foram preparados e analisados ​​por transferência de Western utilizando os anticorpos tal como descrito no lado esquerdo da figura. RPB1 foi utilizado como controlo de carga. 5B. Análise de RanGAP1 SUMOilação. extractos citoplasmáticos de Tpr, Nup153, SENP2 e células tratadas com siRNAs simulados foram preparados e analisados ​​por transferência de Western utilizando um anticorpo anti-RanGAP1 reconhecendo tanto SUMOylated e formas não-SUMOylated de RanGAP1 e com tubulina como controlo de carga. 5C: SUMO-1 tratamento siRNA substitui Tpr senescência induzida por esgotamento em células HeLa. As células HeLa foram transfectadas com Tpr, SUMO-1, Tpr e SUMO-1 e siRNAs simulados. Após 6 dias, as células foram fixadas e coradas para a actividade de SA-β-gal a pH 6,0. Uma imagem representativa de cada condição é apresentada. Barra de escala:. 15 um

RanGAP1 (Ran-GTPase ativando a enzima 1) é uma proteína abundante SUMOylated ea maioria dos anticorpos anti-RanGAP1 detectar a forma de SUMO-1 modificado eo RanGAP1 livre de SUMO, migração de cerca de 80 kDa e 70 kDa, respectivamente. Nós, portanto, examinado o efeito da depleção Tpr sobre a distribuição e o nível de expressão e SUMOilação de RanGAP1. A fracção de RanGAP1 livre de SUMO detectado por este anticorpo foi aumentada em extractos citosólicos de Tpr- e SENP2-siRNAs tratados em comparação com Mock tratada células HeLa (Fig. 5B) e em extractos de células inteiras U2OS (Fig. S3B). Na fracção de extracto nuclear, única SUMO-1-RanGAP1 foi detectado e verificou-se ser aumentado em Tpr- e SENP2-siRNAs células tratadas em comparação com as células tratadas zombar quando detectada com anticorpos anti-anti-RanGAP1 SUMO-1 e, com o aumento sendo mais pronunciada em células tratadas com Tpr do que nas células tratadas com SENP2 (Fig. 5A).

até agora, o papel da proteína na indução SUMOilação senescência só foi estudado em fibroblastos normais. Verificamos que a depleção de SENP2 poderia induzir a senescência em células U2OS em nosso meio experimental (Fig. S3D). Para melhor avaliar a contribuição da via modificação SUMO-1 para o fenótipo senescência induzida Tpr em células cancerosas, foi realizada em paralelo knockdown RNAi de RTP, SUMO-1 e combinado SUMO-1 e da RPT. Após 6 dias, as células foram fixadas e analisadas por coloração com SA-β-galactosidase. O número total de células foi drasticamente diferente entre a condição sozinho Tpr e as outras duas condições. Quarenta ou 50 campos foram contados para cada uma das condições: o número de campos que contêm células azuis e a percentagem de espaço ocupado pelas células azuis ampliadas foram avaliadas (quadro 1). Na verdade, para SUMO-1 células esgotadas, a maioria dos campos estavam cheios de células no sentido de que a densidade de saturação da proliferação de células não foi interrompida. Foram observadas muito poucas células azuis: 3 (em um campo) para cerca de 20 células azuis ou então poderia ser enumerados em apenas 7 campos, sendo o resto negativo. No final, os resultados foram tão diferentes que era impossível incluí-los na Tabela 1. Por uma questão de fato havia células positivas menos SA-β-galactosidase nas células empobrecido SUMO-1 do que no controle simulada. Os resultados descritos na Tabela 1 mostram que a população como um todo foi afetado pela depleção Tpr enquanto que as células com um fenótipo senescente-like foram muito mais disperso na Tpr além de SUMO-1 condição. Além disso, com poucas exceções, a maioria das células azuis não apresentam um fenótipo senescente completa, pois não estavam achatados ea coloração SA-β-galactosidase era fraca (Fig. 5C).

Discussão

Nós demonstrámos neste estudo que empobrecem Tpr é suficiente para induzir um fenótipo senescente, como em linhas celulares tumorais. O fenótipo senescência pode ser explicado pela acumulação de várias proteínas de crescimento-supressora que actuam em transdução de sinal mitogénico e regulação do ciclo celular. Duas principais vias de sinalização, p16INK4a-PRB e p14ARF-p53, são responsáveis ​​pela execução de prisão proliferativa que caracteriza a senescência [37], [38]. A via de Rb-p16 é defeituoso em ambas as linhas celulares HeLa e U2OS mas p53 e p16 em células U2OS e HeLa em células HeLa são aumentados depois Tpr knockdown. P53 acumula-se no núcleo e assim faz p21 /CIP1, um efector a jusante que está envolvido em várias formas de controlo G1 do ponto de verificação. Além disso, parte do p21 /Cip1protein sobre-regulação é dependente da presença da proteína p53

Nas células normais, a p53 é um alvo da via da ubiquitina-proteassoma:. Os baixos níveis de p53 resultado de Mdm2- contínua mediada exportação nuclear de p53 de degradação citosólica. Em células HeLa, exportação nuclear também é necessário para a degradação de p53 mediada pelo vírus do papiloma humano (HPV) E6 proteína 18 [39]. Mostramos aqui que a depleção Tpr leva à retenção nuclear de um repórter GFP abrigando a sequência de NES de STAT1 e atrasa a folga nuclear de pós-indução de NFkB após a remoção do TNF nas células HeLa [36], dois acontecimentos dependentes do factor de exportação CRM1. Tpr recentemente foi encontrado para interagir com CRM1 na presença de um péptido ou um péptido NES NES mais RanGTP como num complexo trimérico exportação [11]. Embora os pormenores moleculares das interacções não foram ainda caracterizados, a ausência de Tpr é susceptível de alterar a função de CRM1 na exportação nuclear. Descobrimos que Tpr knock-down fracamente afeta os níveis CRM1 em experimentos de western blot, mas não obviamente impacto sobre os níveis CRM1 como medido utilizando anticorpos específicos em células fixas. No entanto, tem sido previamente reportado que mesmo ligeira regulação negativa de CRM1 resulta em defeitos proeminentes na exportação nuclear [40]. inibição CRM1 também reduziu a proliferação de células e alterações celulares induzidas profundas e apoptose (dados não mostrados), como relatado anteriormente [41]. Somos a favor, assim, a hipótese de que a principal consequência do esgotamento Tpr é o acúmulo nuclear e ativação de p53 pela inibição da sua exportação nuclear.

Em apoio a esta, leptomycin B (LMB), um inibidor CRM1, tem sido mostrado para reduzir a capacidade de E6 de degradar p53 em células de carcinoma cervical [39], [42] e causa: (i) a retenção de STAT1-NES construir no núcleo [34], [35], (ii) acumulação nuclear e activação de Tubulina foi utilizada como controlo de carga. Tubulina foi utilizada como controlo de carga.