Abstract

A proteína p37 na superfície da

Mycoplasma hyorhinis

células faz parte de um alto sistema e transporte de afinidade foi encontrada associada a animais e cânceres humanos. Aqui mostramos em fibroblastos NIH3T3, p37 induz rapidamente a expressão de genes implicados na inflamação e progressão do cancro. Esta activação de gene foi principalmente através do receptor TLR4. A actividade foi perdido a partir de P37 quando os aminoácidos C-terminais foram removidos 20 ou os quatro aminoácidos específicos para a ligação de hidrogénio de pirofosfato de tiamina foi substituída por valina. O bloqueio do receptor de IL6 ou inibição da sinalização STAT3 resultou num aumento da expressão de gene induzida por p37. . Desde que o cancro associado fibroblastos apoiar o crescimento, invasão e metástase através da sua capacidade de regular a inflamação relacionada com o tumor, a rápida indução de genes em fibroblastos pró-inflamatórias por p37 pode ser esperado para influenciar o desenvolvimento do cancro

citação: AC Gomersall , Phan HA, Iacuone S, Li SF, Freguesia RW (2015) O

Mycoplasma hyorhinis

p37 Proteína rapidamente Induz Genes em fibroblastos associada à inflamação e câncer. PLoS ONE 10 (10): e0140753. doi: 10.1371 /journal.pone.0140753

editor: Yi-Hsien Hsieh, do Instituto de Bioquímica e Biotecnologia, TAIWAN

Recebido: 25 de junho, 2015; Aceito: 30 de setembro de 2015; Publicação: 29 de outubro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Gomersall et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: O CEL originais arquivos para análise de microarray e outros dados de apoio já foram depositados em Figshare em https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.1574136

Financiamento:. ACG foi um destinatário de um prêmio australiano de Pós-Graduação .

competir interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a proteína p37 foi descoberto pela primeira vez na superfície de células de rato sarcoma FS9 [1] . Os anticorpos monoclonais dirigidos contra a proteína p37 inibiu o comportamento invasivo das células FS9 confrontados por fibroblastos cardíacos de galinha [2]. A proteína p37 foi encontrado para ser de

Mycoplasma hyorhinis

e fazem parte de um sistema de transporte de alta afinidade de três proteínas [3]. Estas proteínas são altamente semelhantes aos periplasmático sistemas de transporte de alta afinidade de ligação de bactérias gram-negativas. A p37 N-terminal possui a sequência de aminoácidos C-S-N necessário para uma extensão de lípidos glicérido-cisteína N-terminal que se insere na membrana mycoplasmal [4]. Quando

M

.

hyorhinis

estava presente, Rat-1 células e FS9, L929 e NIH3T3 fibroblastos de rato toda invadiram fibroblastos cardíacos de frango no ensaio explante confrontado [5]. Se os anticorpos monoclonais específicos de P37 foram adicionados ao ensaio do comportamento invasivo foi inibida.

A descoberta de invasividade celular induzida por p37 sugeriu que

H

.

hyorhinis

infecção pode desempenhar um papel no desenvolvimento do câncer.

M

.

hyorhinis

infecção foi encontrada posteriormente a ser associado com cancros humanos e animais, incluindo vários carcinomas [6], bem como o câncer de ovário e metástases em linfonodos [7].

M

.

hyorhinis

infecção está correlacionada com metástases e prevê pobres sobrevivência de pacientes com câncer gástrico [8]. Fareed et ai. Analisamos a resposta imune de pacientes imunizados com células tumorais intralymphatically e encontrou pacientes que exibem a regressão do tumor tinham um título mensurável de anticorpos contra uma proteína de 38 kDa [9]. Ilantzis et ai. confirmou que a proteína seja p37 [10]. A proteína p37 foi encontrado associado com carcinomas gástricos humanos e tumores de próstata [11, 12]. Usando um anticorpo como alvo o terminal N de p37, a proteína foi identificada no carcinoma gástrico, cólon, esôfago, pulmão, mama e glioma, bem como em células circulantes tumorais de pacientes com carcinoma hepatocelular [6, 13].

a adição de p37 ao carcinoma gástrico humano células (AGS) aumento da migração em um ensaio Transwell (Matrigel) [11]. O tratamento das linhas de cancro da próstata PC-3 e DU145 com p37 também aumentaram a invasividade através Matrigel [14]. A inclusão de um anticorpo monoclonal específico para p37 inibiu a invasão. O nível de metaloproteinase 2 (MMP2) aumentou nos meios de-p37 tratada e

p37

-transfected células AGS [11]. Goodison et ai. sugerem que o aumento da invasividade pode representar uma maior taxa de migração após tratamento com p37 em vez de aumentar a capacidade de degradar o Matrigel [15]. tratamento P37 também foi encontrado para aumentar a

fator de necrose tumoral α

(

TNFa)

gene transcrição e níveis de TNFa nos meios de células mononucleares do sangue periférico humano [16].

várias infecções micoplasmas têm sido associadas com o cancro e a artrite, em animais e seres humanos. Por exemplo, a infecção de células hematopoiéticas 32D com

M

.

fermentans.Tais

ou

M

.

penetrans

durante 4-5 semanas induzido de transformação maligna e quando injectadas em ratinhos nus as células de tumores rapidamente formado [17].

M

.

hyorhinis

,

M

.

pneumoniae

,

M

.

hominis

,

M

.

fermentans.Tais

,

M

.

penetrans

e

M

.

arthritidas

têm sido implicados na artrite humana [18-21].

M

.

fermentans.Tais

produz artrite aguda em coelhos [21].

M

.

hyorhinis

infecção também está associada com poliserosite e artrite de suíno [22].

O objetivo do trabalho aqui relatado foi identificar genes cuja expressão é rapidamente activado após o tratamento p37 de fibroblastos NIH3T3

in vitro

. As células NIH3T3 foram escolhidos porque são uma linha de fibroblastos padrão que se revelaram úteis para o estudo das doenças humanas incluindo cancer.The receptor de membrana (s) responsável pela activação do gene estavam também a ser identificado.

Métodos

construção de plasmídeo

construção de plasmídeo foi realizada utilizando clonagem de enzimas de restrição padrão. O

p37

gene foi inserido no

Bam

local HI corte do pRSET Um vector de expressão derivado de pUC. (Invitrogen; Cat # V351-20) (S1A Fig)

p37 truncado foi construído utilizando a reação em cadeia da polimerase (PCR) para introduzir o

Bam

HI e

Nco

locais de corte I restrição flanqueando o

p37

gene. Os iniciadores inversos (S1 Tabela) introduziu um

Nco I

local do corte de restrição em vários pontos que facilitou a produção de sequências de ADN que reduziram o tamanho da proteína p37 por 20, 60, 80 ou 105 aminoácidos. Os produtos de PCR foram digeridos com o

Bam HI e

Nco I

enzimas de restrição e ligado no pRSET derivado de pUC Um vector de expressão (Invitrogen; Cat # V351-20) (Fig S2) .

dirigida ao local mutagênese

mutagênese do p37 gene que codifica foi realizada utilizando o mutagène fagem�eo

in vitro

kit de mutagénese (Bio-Rad; Cat # 170-3581) . Os oligonucleótidos são fornecidos na Tabela S2

Os quatro aminoácidos S255, F256, S257 e K258 em p37 foram alteradas para valina utilizando o kit QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis (Agilent Technologies; Cat # 200521). E o método de concepção de iniciadores desenvolvidos por Zheng et ai. [23]. Duas reacções em cadeia de polimerase foram utilizados para realizar as mutações; o respectivo para a frente e reverso iniciadores estão listados na Tabela S3 e análise da sequência S3 na fig. A temperatura ótima cartilha de recozimento foi estabelecido como 56,4 ° C.

A expressão proteica e esclarecimentos

A expressão da proteína p37, proteínas P37 truncadas (p37-20, p37-60, p37-80 e p37-105) e a proteína p37 mutado foi completada em células OneShot®BL21 (DE3) (Invitrogen; Cat # C6000-03). As células foram cultivadas em caldo de Luria Bertani (LB) contendo 100 ug ml

-1 de ampicilina e induzidas com IPTG (isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido) até uma concentração final de 1 mM durante 4 horas a 37 ° C com agitação . As células induzidas foram recolhidas e ressuspensas em tampão de lise (50 mM de NaH

2 PO?

4, NaCl 300 mM, imidazol 10 mM, 1 mg ml

-1 de lisozima, pH 8,0) contendo uma solução completa, Mini Inibidor de Protease Tablet cocktail (Roche; Cat # 11836153001). Os lisados ​​brutos foram obtidos por sonicação (6 ciclos, intervalos de 30 segundos), seguido por agitação durante 30 minutos a 4 ° C. O ligado foi clarificado por centrifugação a 12000 g durante 10 minutos a 4 ° C e reunidas por meio de filtração através de um filtro de 25 um.

Arginina absorver proteína

clarificação

de concentrações elevadas da p37 péptidos truncados localizado na fração insolúvel do

E

.

coli

lisado e, assim, aumentar a produção de p37 solúvel uma arginina absorver foi empregado (argSOAK) método. péptidos truncados foram solubilizados com um 1 M arginina embeber antes da purificação utilizando o método descrito por Tsumoto et ai. [24]. P37 nativo foi também purificado usando o 1 M arginina embeber a assegurar que o método não inactivar a proteína

Protein Purification

purificação da proteína foi conseguida utilizando Profinity

TM resina IMAC (BioRad.; Cat # 156-0123) com desvios do protocolo do fabricante.

Dois ml da Profinity

TM IMAC resina foi adicionado por cada 25 ml de ligado clarificado preparado. Para permitir a ligação da proteína a mistura de resina /lisado foi incubado durante 1 hora a 4 ° C, com agitação. A mistura foi, em seguida, centrifugada durante 1 minuto a 3000 g para sedimentar a resina. A resina foi lavada com 10 mL de Tampão de Lavagem (50 mM de NaH

2 PO?

4, NaCl 300 mM, imidazol 20 mM, pH 8,0) por agitação durante 5 minutos a 4 ° C. A mistura de resina /lavagem foi centrifugado durante 1 minuto a 3000 g para sedimentar a resina. Proteína leituras de absorvância a 280 nm (A

280) foram tomados em consideração os sobrenadantes de lavagem. A resina foi lavada várias vezes até que os sobrenadantes de lavagem A

280 foi inferior a 0,01.

A eluição foi alcançada através da adição de 7 ml de Tampão de Eluição (50 mM de NaH

2 PO?

4, 300 de NaCl mM, imidazol 500 mM, pH 8,0) para cada 2 ml de resina, com 1 hora de incubação, a agitação a 4 ° C. A mistura foi centrifugada durante 1 minuto a 3000 g para sedimentar a resina e para cada 7 ml, cinco alíquotas de 1 ml de sobrenadante contendo a proteína eluida foi recolhida. A proteína eluída foi armazenado a -80 ° C

As concentrações de proteína foram calculados de acordo com o kit BCA Protein Assay Pierce®. (ThermoScientific; cat # 23227) e o programa de BCA da Eppendorf 6131. ​​BioPhotometer

SDS-PAGE, coloração com azul de Coomassie e transferência

amostras de proteína foram desnaturadas por WESTERN a 95 ° C um tratamento térmico durante 10 minutos e separadas em 12% de acrilamida com geles de separação num gel de acrilamida 4% de empilhamento. Os géis foram construídos seguindo o Mini-PROTEAN

® 3 Cell (BioRad; Cat # 165-3301 /165-3302) instruções do fabricante. O Mini-PROTEAN 3 celular Mini tanque (BioRad; Cat # 165-3302) foi montado de acordo com as instruções do fabricante e os géis correram durante 60 minutos, a 200 volts a 4 ° C (Bio-Rad PowerPac

TM de alimentação de energia básica ).

Para determinar a eficiência de purificação de géis de SDS-PAGE foram coradas com 0,1% azul de Coomassie (0,1% de Coomassie Blue R-250, 40% de metanol, 10% de ácido acético) durante a noite à temperatura ambiente com agitação suave. Os géis de SDS-PAGE foram fixas antes da coloração com azul de Coomassie com solução de fixação (metanol a 50%, 10% de ácido acético) à temperatura ambiente durante 10 minutos com agitação suave. Seguindo géis de coloração com Azul de Coomassie foram descoradas utilizando uma mistura de metanol a 40%, 10% solução de descoloração de ácido acético durante 2 horas à temperatura ambiente com agitação suave.

Para a identificação da proteína, após a separação, em 12% de acrilamida separando géis, proteínas eram transferido para membrana de fluoreto de polivinilideno após a Bio-Rad Mini Trans-Blot

® protocolo eletroforética (Cat # 170-3930 /170-3935). O Bio-Rad Mini Trans-Blot

® sistema electroforética correu durante 2 horas a 200 volts

As membranas foram bloqueadas em 5% de leite magro em solução salina tamponada com Tris com Tween-20 (TBST.: NaCl 137 mM, Tris 20 mM, 0,1% de Tween-20), incubou-se novamente durante 1 hora com o anticorpo de T7-Tag monoclonal (Novagen; cat # 69522) diluída 1: 10000 em 5% de leite seco não gordo seguidos por um 1 hora de incubação com conjugado de cabra anti-IgG de ratinho de rábano Peróxido (HRP) (Invitrogen; cat # L-21040) diluída 1: 10000 em leite seco não gordo a 5%

Western blots foram desenvolvidos usando a Fosfatase alcalina

. conjugado Substrato Kit (BioRad; Cat # 170-6432). A membrana foi exposta à luz durante 10 minutos, com agitação e lavou-se com DDQ

2O para parar a reacção antes da digitalização

A Escada Proteína PageRuler prestained. (Fermentas; Cat # SM0671) foi usado para analisar o tamanho da proteína. Análise

Microarray

o ARN total foi extraído a partir de fibroblastos NIH3T3 tratadas com 15 ug ml

-1 proteína p37 purificada por 24 horas ou não-tratada fibroblastos NIH3T3 usando o Kit Mini RNeasy® ( Qiagen; Cat # 74104). Três réplicas biológicas foram tomadas de cada tratamento. contaminação genómico foi rastreada por PCR e eliminado usando desoxirribonuclease I, grau de amplificação (Invitrogen; Cat # 18068-015) por instruções do fabricante. integridade do RNA e qualidade foi verificada usando o Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, Califórnia, EUA).

RNA foi amplificado e cDNA sintetizado de acordo com instruções no GeneChip® 3 ‘manual IVT expresso Kit Usuário ( Affymetrix; Cat # P /N702646 Rev.8). Seguindo rotulagem biotina de cDNA e fragmentação, as amostras foram hibridadas com Affymetrix mouse Genome 430 2.0 Arrays, lavado usando uma estação Fluidics GeneChip® e digitalizados utilizando o Scanner GeneChip® 3000. dados de Microarray foi processado usando o Affymetrix® Expressão Software Console ™ 1.2 (Affymetrix ; Cat # P /N 702387 Rev. 2) e CLC Genomics Workbench 4.7 (bio CLC, https://www.clcbio.com;. Vat # DK28305087)

RT

matriz 2 Profiler ™ PCR sistema

o ARN total foi extraído a partir de fibroblastos NIH3T3 que tinham sido tratados com p37, p37 e S31-201, S31-201 apenas ou não-tratada fibroblastos NIH3T3 usando o kit RNeasy® Mini (Qiagen, Cat # 74104) . Três réplicas biológicas foram tomadas de cada tratamento. contaminação genómico foi rastreada por PCR e eliminado usando desoxirribonuclease I, grau de amplificação (Invitrogen; Cat # 18068-015) por instruções do fabricante. integridade do RNA e qualidade foi verificada usando o Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, Califórnia, EUA)

RNA transcrição reversa ea RT

2 Profiler

TM Resposta Inflamatória matrizes de auto-imunidade de PCR (SABioscience; Cat # PAMM-077A-12) foram realizadas seguindo as instruções do fabricante (SABiosciences; Part # 1022A). Fortes correlações positivas do limiar de ciclo (Ct) valores entre a matriz PCR repetições biológicas de cada tratamento indicado detecção qPCR confiável de expressão gênica (S4 Fig).

Pela análise de variância foi realizada comparando genes valores Ct do tratado as amostras para o controlo não tratado

PCR quantitativa (qPCR)

o ARN foi extraído utilizando o Kit Mini. RNeasy® (Qiagen; cat # 74104) a partir de três réplicas biológicas do tratadas e não-tratadas NIH3T3 fibroblastos. O RNA foi tratado com DNAse (Invitrogen; Cat # 18068-015) antes da conversão de DNA complementar (SuperScript

TM III, Invitrogen; Cat # 18080-044). amplication quantitativa de cDNA foi realizada em triplicado de cada repetição biológico utilizando iQ

TM SYBR

® Verde Supermix (BioRad; Cat # 170-3884) e oligonucleotídeos qPCR (S4 Tabela) usando um iCycler iQ

TM real -tempo de PCR Detection System (BioRad; 170-8740). Foram usadas as mesmas condições de amplificação para todos os conjuntos de iniciadores; desnaturação inicial a 95 ° C durante 3 minutos; processo de amplificação repetido 40x através de desnaturação a 95 ° C durante 10 segundos, hibridação do iniciador 60

° C durante 30 segundos e, em seguida, uma extensão a 72 ° C durante 30 segundos. fluorescência emitida foi medida durante a fase de extensão ciclo. Uma extensão final de 95 ° C durante 1 minuto foi concluído antes da curva de dissociação. A curva de dissociação começou a 55 ° C com um aumento de 0.5 ° C até à temperatura final de 95 ° C foi alcançada.

Os controlos negativos foram verificados para eliminar a contaminação e apenas um único pico foi aceite na curva de dissociação de qualquer gene testado. Todos os produtos amplificados foram sequenciados para indicar especificidade dos oligonucleotídeos qPCR.

Dobre Alterar

Para normalizar as diferentes concentrações de amostras de todos os genes de interesse valores (GOI) Ct foram subtraídos dos valores médios de Ct dos dois genes de referência endógena

βactin

e

GAPDH

(

gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase

); ΔCt (Equação 1). Todos os valores Ct foram obtidos a partir de três réplicas biológicas e técnicas três repetições de cada réplica biológica (N = 9)

foi calculada

Equação 1 A diferença entre o gene de interesse ΔCt de uma amostra tratada e uma amostra de controlo.; ΔΔCt (Eq 2). A eficiência de amplificação da mudança exponencial por ciclo por gene (E) de cada iniciador foi calculada a partir da por cento de eficiência (E%); E (Eq 3). eficiências por cento dos 100 ± 10% e R

2≥0.985 foram considerados aceitáveis. Todas as eficiências par de iniciadores pode ser encontrada na Tabela S4.

2Equation Equação 3

O ΔΔCt foi usado com o respectivo valor E iniciador do gene para calcular a variação relativa de vezes a expressão do gene, devido a um tratamento (Equação 4). Um ΔΔCt 1 indica regulação positiva e 1 indica downregulation.

Equação 4

barras de erro

O desvio padrão (

σ

) foi calculado com base ΔΔCt (Eq 5). O erro padrão (SE) foi calculado a partir do desvio padrão (Eq 6) e a parte superior (Eq 7) e as barras de erro inferiores (8 eq) foram calculados usando o erro padrão, e-valor e dobre mudança. N, o número do tamanho da amostra = 9.

Equação 5Equation 6Equation 7Equation 8

Os valores barra de erro para todos os gráficos são fornecidos na Tabela S5.

análise de variância (ANOVA)

Pela análise de variância foi realizada em todos os dados qPCR comparando o limiar de ciclo normalizado (ΔCt) de amostras tratadas para os controlos ou as amostras de controlo tratadas. Todos os experimentos consistia de três repetições biológicos e três repetições técnicos de cada repetição biológica (N = 9).

As células de mamíferos

fibroblastos

Mouse embrionárias (NIH3T3) estabelecidas a partir de embriões de rato NIH suíços, foram obtidos do Centro de Câncer Peter MacCallum, East Melbourne.

condições de cultura celular

fibroblastos NIH3T3 foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM). O meio foi suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS), NaHCO

3 e penicilina-estreptomicina. Plasmocin

TM (Invivogen) foi adicionado a todos os meios de cultura a uma concentração de 5 ug mL

-1. A linha de células e meios de comunicação foi testado para a contaminação por micoplasma usando primers Mycoplasma descritos por Uphoff e Drexler [25]. condições de amplificação por RCP envolveu uma desnaturação inicial a 95

° C durante 3 minutos, e subsequente processo de amplificação repetido 32x através de desnaturação a 95

° C durante 10 segundos, hibridação do iniciador 65

° C durante 30 segundos e uma extensão a 72

° C durante 30 segundos. Uma extensão final de 95

° C durante 1 minuto foi completada. A linha de células e todos os meios celulares experimento foram encontrados negativo para contaminação Mycoplasma.

Todas as placas de cultura foram incubadas em Água-Jacketed Incubator (Forma Scientific). A incubadora foi regulada automaticamente a 37

° C com 5% de CO

2

Inibidores

Foram utilizados os seguintes inibidores:. IL6R inibidor FOLHA

TM purificado anti- ratinho /rato CD126 anticorpo monoclonal (IL6R

i

) (BioLegend; Cat # 115809) (AB_2127939) a uma concentração final de 0,1 ug ml

-1. A concentração final foi determinada utilizando RT-PCR, que mostrou que as concentrações de IL6R

i

variando entre 0,1 e 0,5 ug ml

-1 inibiu induzida por p37

soro amilóide A3

(

Saa3

) expressão. A sonda química da STAT3 Inhibitor VI (S31-201) (Santa Cruz Biotechnology; Cat # SC-204304) foi usada numa concentração final de 100 ^ M [26]. O viral inibidor peptídico de TLR4 (Viper) e o péptido de controlo Viper CP7 foi utilizado a uma concentração final de 0,5 uM (IMGENEX; cat # IMG-2011set). Os Viper uM de concentração de inibição de 0,5 foi determinada por tratamento das células NIH3T3 com 1 ug ml

-1 lipopolissacárido (LPS) (Invivogen; Cat # tlrl-3pelps) inibição com 0,25, 0,5, 0,75, 1, 5, 10 e 25 uM VÍBORA. A concentração final de 0,5 uM Viper foi encontrada para reduzir a expressão de

Saa3

de 12 vezes a 5 vezes. CP7 também foi encontrada para inibir LPS induzida por

Saa3

expressão em concentrações mais elevadas no entanto em 0,5 mM CP7,

Saa3

expressão não foi significativamente inibido.

tratamento celular

fibroblastos NIH3T3 de tratamento foram passadas para o número necessário de placas de cultura de tecido para permitir a três repetições por tratamento biológicos. Todas as linhas de NIH3T3 originada da mesma congelamento até lote na passagem 10; tratamento ocorreu antes da passagem 15. Antes do tratamento, o meio DMEM10% de FCS foi aspirado e as culturas de células lavadas duas vezes com fosfato de 1x solução salina tamponada (PBS; NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na a 10 mM

2HPO

4,2H

2O, KH 2 mM de

2 PO?

4, pH 7,4), a menos que indicado de outra forma.

para o tratamento p37 a concentração necessária de p37 purificada foi adicionado ao meio de DMEM10% de FCS cobrindo as células e as culturas foram incubadas durante a quantidade de tempo requerido. No caso dos testes de tempo, os tratamentos celulares foram iniciadas em momentos que permitissem para todos os ciclos de tratamento para ser sincronizado e pronto para a extracção de ARN a T

0.

fibroblastos NIH3T3 foram tratados com inibidores antes de 24 horas de tratamento com ou sem p37. Pré-tratamento do tempo de incubação pode variar dependendo do inibidor; 1 hora para IL6R

i

, 2 horas para VIPER e CP7 e 24 horas para S31-201.

Os tratamentos foram terminados por lavagem e lise das células para a extração de RNA imediata. As células foram observadas pós-tratamento para os níveis de toxicidade, se houve um efeito tóxico observado o experimento foi encerrado.

ensaios de migração

A migração celular foi estimulada em uma monocamada usando um

em vitro

ensaio ferida zero. fibroblastos NIH3T3 foram cultivados a uma monocamada confluente de 100% e riscado utilizando uma ponta de pipeta estéril, formando uma ferida de cerca de 300 um de diâmetro. Os detritos celulares foram lavados com PBS 1x e DMEM10% de FCS foi adicionado com 25 ug ml

-1 p37 para fibroblastos NIH3T3 tratadas. As culturas que não tinham atingido uma monocamada confluente após 24 horas de tratamento e feridas que foram maior ou menor do que 300 um foram excluídos da análise. As imagens foram capturadas em 0, 14, 19, 24 e 38 horas. Seis imagens foram capturadas por ponto de tempo por placa. placas em triplicado foram completadas em cada ponto de tempo (n = 18). Taxa de migração celular foi expressa como área de superfície (mm

2) coberto por células dividido pelo tempo (horas) a migração. Para determinar a região na qual as células tinham migrado em cada ponto de tempo, a área da ferida em cada ponto de tempo foi subtraída da área inicial da ferida. ImageJ foi utilizado para determinar a área da ferida.

Resultados

perfil de expressão gênica de P37 fibroblastos NIH3T3 tratadas

foi induzida p37

expressão genética recombinante

Escherichia coli e a proteína purificada utilizando cromatografia em Ni-afinidade (Fig 1). Inicialmente, foi determinado o efeito da p37 purificada sobre a migração de fibroblastos NIH3T3. Em um ensaio de cicatrização de feridas 25 ug ml

-1 P37 tratado fibroblastos aumento das taxas apresentaram migração (S5B FIG) e fechamento da ferida mais rápido do que os controles (S5A FIG). p37 não afectou a taxa de proliferação de células NIH3T3. Existe um relato de tratamento p37 causando um ligeiro aumento da proliferação de células da próstata DU145 (dados não incluídos), no entanto, as células de próstata PC3 foram afectadas (15).

p37 purificada foi separado por 12% SDS- PAGE e coradas com azul de Coomassie (A). A proteína purificada foi transferida para membranas de fluoreto de polivinilideno e sondadas com o anticorpo monoclonal de T7-Tag e IgG de rábano Peróxido (HRP) anti-ratinho (B) de cabra. Os padrões de peso molecular (MW) estão em quilo Dalton (kDa) e indicados à esquerda da figura. A proteína p37 purificada correu para a posição de cerca de 52 kDa. A proteína p37 está previsto para ser de 43,5 kDa com um adicional de 8,5 kDa, como resultado da 6x His e Xpress epitopo do pRSET Uma grelha de leitura. A identidade da proteína p37 purificada foi ainda confirmada usando sequenciação de proteínas.

fibroblastos NIH3T3 foram incubadas com 15 ug ml

-1 p37 por 24 horas e uma análise de microarray do ARN total purificado indicado expressão de 537 genes afetados significativamente (p≤0.001); 288 destes genes foram regulados positivamente (variação vezes ≥ 3) (S6 Tabela). As atribuições ontologia gene para os 288 genes significativamente upregulated são fornecidos em S6 Fig. Os dez genes mais fortemente regulados positivamente (9- e 64-vezes) têm sido relatados para influenciar a progressão do cancro e /ou a inflamação (ver discussão). Foram selecionados para análise mais oito genes (upregulated de 3 a 9 vezes) que também afetam a inflamação /câncer. Os dados de microarray para os dezoito genes foi validado utilizando PCR quantitativa (qPCR) (Fig S7). A sobre-regulação, em resposta ao tratamento com P37 foi confirmada por catorze dos genes. As mudanças dobra permaneceu relativamente constante entre os vários (mais tarde) experimentos. Nós posteriormente usado 25 ug ml

-1 p37 e tratamentos de 24 horas; dobram mudanças foram comparáveis ​​entre os experimentos.

haptoglobina

(

Hp

) foi uma exceção.

A análise microarray identificou 249 genes fortemente reprimidos (dobre mudança ≥ 3) (S7 Tabela). Regulação negativa de cinco destes genes tem sido associada com a progressão do tumor e a activação de proteína de fase aguda (APPs) genes (S8 tabela).

Efeito de diferentes concentrações de P37 e tempos de tratamento

fibroblastos NIH3T3 foram incubadas com 0,5, 1, 5 e 25 ug ml

-1 p37 durante 24 horas. As concentrações mais baixas P37 foram menos eficazes para estimular a expressão do gene, embora

Complemento componente 3

(

C3

) e

Lipocalin 2

(

Lcn2

) ainda estavam significativamente ativado por 5 ug ml

-1 p37 (Tabela 1).

para determinar mudanças na expressão gênica ao longo do tempo NIH3T3 fibroblastos foram tratados com 5 ug ml

-1 p37 para 2 , 4, 8, 12 e 24 horas.

Angiopoietina like-4

(

Angptl4

),

soro amilóide A3

(

Saa3

),

molécula de adesão celular vascular 1 | (

VCAM1

) e

Interleucina 6

(

IL6

) expressão aumentaram fortemente durante as primeiras 4 horas de tratamento, mas a ativação havia caído para níveis baixos ou estava ausente em 24 horas (Tabela 2). O grande aumento no

Lcn2

e

C3

expressão ocorreu entre 12 e 24 horas.

Decorina

(

DCN

) e

fator inibidor de leucemia

(

LIF

) expressão aumentada durante as primeiras 4 horas, posteriormente caiu e, em seguida, aumentou ligeiramente novamente às 24 horas.

Apesar de alguma variabilidade na mudança vezes ocorreu quando fibroblastos NIH3T3 foram tratadas com 25 ug ml

-1 p37 por 24 horas (Tabela 1 e experimentos posteriores), cinco genes

Angptl4

,

Saa3

,

DCN

,

C3 Comprar e

Lcn2

foram consistentemente disparado mais de 10 vezes. Três genes

ácido hialurônico sintase 2

(

HAS2

),

Hp

e

LIF

em pelo menos 5 vezes.

P37 ativa a expressão do gene através do receptor TLR4

o rápido aumento da

Angptl4

,

LIF

,

Saa3

,

IL6

e

expressão VCAM1

no P37 fibroblastos tratados sugeriu a proteína p37 está sinalizando através do receptor toll-like 4 (TLR4). fibroblastos NIH3T3 possuem TLR4 desde 1 pg ml

-1 lipopolissacarídeo tratamento (LPS) por 6 horas resultou em um aumento de 28 vezes em

expressão IL6

em fibroblastos NIH3T3 [27]. Nós tratada fibroblastos NIH3T3 com 1 mg ml

-1 LPS durante 24 horas e encontrou a 2 vezes e um aumento de 12 vezes em

IL6

e

Saa3

expressão, respectivamente (dados não mostrado). O viral inibidor peptídico de TLR4 (Viper) e o seu péptido de controlo (PC7) [28] foram utilizados para determinar se os sinais de P37 através TLR4. fibroblastos NIH3T3 foram incubadas durante 24 horas com P37 (25 ug ml

-1) ou pré-tratadas durante 2 horas com o Viper ou péptidos CP7 (0,5 uM) antes da adição de p37. O efeito dos péptidos sobre os níveis dos sete genes mais fortemente induzidas pela expressão p37 foi determinada (Fig.2). A expressão induzida por p37 de todas as sete genes foi significativamente inibida por Viper. Embora alguma inibição induzida CP7 ocorreu, na maioria dos casos, esta era significativamente menor do que a inibição causada por Viper. O tratamento de fibroblastos NIH3T3 com VIPER 0,5 uM ou CP7 sozinho não teve efeito sobre os genes testados, com a excepção de

Saa3

que foi regulada negativamente em 0,5 vezes (Fig S8A).

PCR quantitativa ( qPCR análise) de fibroblastos NIH3T3 tratadas com 25 ug ml

-1 p37 por 24 horas (preto) ou pré-tratadas durante 2 horas com VIPER (cinza) ou a CP7 péptido de controlo (branco) antes de 25 ug ml

-1 p37-tratamento durante 24 horas. diferenças significativas entre CP7 ou VIPER + p37 tratamentos e tratamento p37 foram calculados usando análise de variância (+ p≤0.05, ++ p≤0.01, +++ p≤0.001).

truncamento de p37 ou mutação de local de ligação de TPP inibe a activação do gene

Quatro péptidos P37 truncadas foram preparados a partir do qual 20, 60, 80 ou 105 aminoácidos foram removidos do terminal-C. péptidos solúvel (25 ug ml

-1) purificado utilizando o método argSOAK foram utilizadas para tratar os fibroblastos NIH3T3. A capacidade de P37 para induzir a expressão do gene foi perdida quando os 20 aminoácidos C-terminais estavam ausentes (figura 3). A excepção foi

Angptl4

cujo nível de expressão induzida pelo péptido 20 aminoácido truncado foi semelhante ao péptido P37 de comprimento completo. Os níveis de expressão de outros genes testados (sete são mostrados) não foram significativamente afetados pelos peptídeos P37 truncado.

A análise quantitativa PCR de fibroblastos NIH3T3 tratadas com 25 ug ml

-1 p37 excluindo 20 aminoácido (aa), 60aa, 80aa ou 105aa (cinza escuro para branco) a partir do C-terminal; durante 24 horas. Arginina mergulhar (argSOAK) p37 purificado (cinza mais escuro) diminui ligeiramente a expressão do gene (preto) induzida por p37 em fibroblastos NIH3T3. Diferenças significativas entre os fibroblastos tratados e não tratados foram calculados usando análise de variância (* p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001)

A estrutura cristalina de p37 foi definido para. 1,9 Å de resolução [29]. P37 é uma proteína da classe alfa /beta que consiste em dois domínios separados por uma fenda que liga modelagem indica pirofosfato de tiamina (TPP).