Abstract

O câncer de bexiga é a doença urológica maligno mais comum na China. Hidroxicamptotecina (HCPT) é um DNA topoisomerase I inibidor, que tem sido utilizado em quimioterapia para câncer de bexiga por quase 40 anos. pesquisas anteriores demonstraram que a isoflavona, genisteína, pode sensibilizar várias linhas celulares de cancro para tratamento HCPT, tais como a próstata e o cancro do colo do útero. Neste estudo, nós investigamos se a genisteína poderia sensibilizar linhas celulares de cancro da bexiga e células BDEC de células da bexiga epitelial ao tratamento HCPT, e investigados os possíveis mecanismos moleculares subjacentes. A genisteína poderia de forma significativa e dependente da dose, sensibilizar várias linhas celulares de cancro da bexiga e células BDEC a apoptose induzida por HCPT tanto in vitro como in vivo. crescimento genisteína e HCPT sinergicamente inibido de células da bexiga e da proliferação, e G2 induzida /M parada do ciclo celular fase e apoptose em células de câncer de bexiga TCCSUP e celular BDEC. Pré-tratamento com genisteína sensibilizados BDEC e linhas celulares de cancro da bexiga a danos no DNA induzidos HCPT pela activação sinérgica de ataxia telangiectasia mutado (ATM) quinase. A genisteína atenuou significativamente a capacidade de HCPT para induzir a activação da via anti-apoptótica de NF-kB tanto in vitro e in vivo num modelo de xenoenxerto de cancro da bexiga, e assim contrariado o efeito anti-apoptótico da via NF-kB. Este estudo indica que a genisteína poderia atuar como um agente não tóxico promissora para melhorar a eficácia da HCPT quimioterapia do cancro da bexiga

Citation:. Wang Y, Wang H, Zhang W, Shao C, Xu P, Shi CH, et ai. (2013) Células de genisteína sensibiliza cancro de bexiga ao tratamento HCPT in vitro e in Vivo via ATM /NF-kB /IKK Caminho-apoptose induzida. PLoS ONE 8 (1): e50175. doi: 10.1371 /journal.pone.0050175

editor: Aamir Ahmad, Faculdade de Medicina da Wayne State University, Estados Unidos da América

Recebido: 18 de junho de 2012; Aceito: 22 de outubro de 2012; Publicação: 24 de janeiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Wang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações do National Science Foundation Natural da China (No. 30.901.498, No. 30.100.185, No. 81.250.036, No. 30.973.000, No. 30.872.583, No. 81.072.116) e da Fundação de Ciência Natural de Shaan’xi Province, China ( 2009JQ4003). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de bexiga é uma das neoplasias mais comuns que afetam o sistema urinário. Um total de 44,690 homens (29,8 por 100.000) e 16,730 mulheres (11,2 por 100.000) foram diagnosticados em 2006, ocupando o cancro da bexiga como o quarto homem comum e doença maligna mais comum do sexo feminino nona nos Estados Unidos [1]. Em contraste, a incidência de cancro da bexiga na Ásia é muito menor. Em 2009, Zhang et al. informou que, embora as taxas aumentaram entre 1988 e 2002 (8,22 por 100.000 em 1988-1992, 9,45 por 100.000 em 1993-1997 e 9,68 por 100.000 em 1998-2002), a incidência de cancro da bexiga na China continua a ser inferior à dos Estados Unidos [ ,,,0],2]. Da mesma forma, na Ásia Oriental, baixa incidência de cancro da bexiga têm sido relatados na Coréia (14,39 por 100.000), Japão e Índia (cerca de 14 por 100.000 habitantes) [3] – [5]. Além disso, as taxas de sobrevivência para certas doenças de 5 anos de pacientes com câncer de bexiga na Ásia são mais elevados do que os dos países ocidentais [6].

O agente quimioterapêutico, hidroxicamptotecina (HCPT), é usado principalmente para o tratamento de Câncer de bexiga. HCPT induz a apoptose em células cancerosas da bexiga através da formação de um complexo ternário com ADN e a enzima topoisomerase I de ADN através de ligações de hidrogénio, desse modo estabilizando o complexo. O complexo estável evita a re-ligação do ADN e leva à conversão de quebras de ADN de cadeia simples em quebras de cadeia dupla durante a fase-S. Neste ponto, o garfo de replicação colide com os complexos de clivagem de ADN, que induz a apoptose e ciclo celular prisão [7].

A genisteína, um isoflavona bem conhecidos e estrogénio botânicos naturais, tem sido mostrado para inibir o crescimento de células de cancro, sobrevivência, metástase e angiogénese, aumentando a morte celular por apoptose através da indução de vários estímulos que danificam o ADN [8] – [10]. A genisteína foi demonstrado ter um efeito inibidor sobre o crescimento de cancro da próstata [11], o cancro cervical [12], o cancro da mama [13], o cancro do cólon [14] e carcinoma de células renais [15] células. A genisteína pode também chemosensitize muitos tumores malignos para os efeitos de ADN drogas tóxicas. Relatos anteriores indicaram que o pré-tratamento com 10-30 mmol /l genisteína pode chemosensitize células de fibroblastos cervicais, ovarianos e normais ao tratamento com HCPT por induzir um maior grau de inibição do crescimento celular e apoptose [16]. No entanto, se a genisteína pode aumentar o efeito quimioterapêutico da HCPT nas células da bexiga, e do seu mecanismo molecular de acção neste tipo de tecido, permanecem obscuros. Portanto, nós exploramos se a genisteína poderia chemosensitize células cancerosas da bexiga para HCPT, e investigou os potenciais mecanismos subjacentes a este efeito.

Materiais e Métodos

1. As linhas celulares

J82, linhas celulares de cancro da bexiga SCaBER e TCCSUP foram adquiridos a partir da American Type Culture Collection (Manassas, VA, EUA), BFTC905, HT1197, T24, linhas celulares de cancro da bexiga TSGH-8301 eram da Centro China para Type Culture Collection (CCTCC). A linha de células epiteliais primárias da bexiga, BDEC, foi de BioWhittaker (San Diego, CA, EUA) e foram mantidas como culturas em crescimento exponencial em DMEM suplementado com soro fetal bovino a 10%, 100 U /ml de penicilina e 100 ug /ml de estreptomicina. A genisteína (Sigma, Xangai, China) e HCPT (gentilmente cedido pela Sanofi, Xangai, China) foram dissolvidos em DMSO para preparar soluções de estoque 10 mM. Para as experiências, as células foram incubadas durante 3 dias e, em seguida, tratadas com ou sem 10 uM de genisteína e um HCPT uM durante 24 h.

2. inibição do crescimento celular por genisteína e HCPT

As células foram semeadas a uma densidade de 5 x 10

3 células /poço e deixadas a ligar durante a noite. O meio de cultura foi substituído com meio fresco contendo a genisteína, a diferentes concentrações, durante 24 h, e as células foram então expostas a HCPT por um adicional de 72 h. Para cada tratamento único agente, as células foram tratadas com genisteína durante 96 h e HCPT durante 72 h. O crescimento celular foi examinada utilizando o ensaio MTT.

3. A citometria de fluxo para a apoptose

As células aderentes foram tripsinizadas, ressuspensas e tratada tal como descrito anteriormente [17]. A citometria de fluxo foi realizada utilizando luz azul argônio-in laser (comprimento de onda de excitação, 488 nm; potência do laser, 200 mW) e fluorescência vermelha do PI que rotula DNA foi gravado. Todos os ensaios para apoptose foram conduzidos em duplicado e os resultados mostrados são representativos de pelo menos três experiências.

4. coloração de imunofluorescência para γ-H2AX e ATM

Para a coloração γ-H2AX, as células foram tratadas com diferentes concentrações de HCPT e genisteína, os meios foram removidos em vários pontos temporais e as células foram fixadas em paraformaldeído a 1% para 10 min, seguido por 70% de etanol durante 10 min. As células foram então incubadas em 0,1% de Triton X em solução salina de fosfato tamponada (PBS) durante 10 min, permeabilizadas em 0,5% de Triton em PBS durante 10 minutos, lavadas três vezes em PBS e bloqueadas com albumina de soro bovino a 5% (BSA) em PBS durante 60 min. As células foram incubadas com anti-γ-H2AX (1:2,000; Cell Signaling, Xangai, China) ou anti-ATM (1:300, Cell Signaling, Xangai, China) em 5% de BSA em PBS a 4 ° C durante a noite, lavou-se quatro vezes em PBS, incubadas no escuro com um anticorpo secundário marcado com FITC (1:2,000 para anti-γ-H2AX e 1:300 para anti-ATM) em 5% de BSA durante 1 h, lavadas 4 vezes em PBS, incubadas no escuro com 1 ug /ml de 4 ‘, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI; Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) em PBS durante 5 min e montadas e lamínulas em Fluoromount G (Southern Biotech, Birmingham, AL , EUA). As lâminas foram examinadas em um microscópio de fluorescência Leica (Wetzlar, Alemanha), as imagens foram capturadas usando um microscópio de fluorescência Nikon (Nikon Eclipse E800) e importados para Nikon ACT-1 (versão 1.12) software. As imagens foram combinadas em um formato de publicação usando o software Adobe Photoshop CS2. Para cada condição de tratamento, o número de γ-H2AX ou ATM focos foi determinada em pelo menos 50 células. Todas as observações foram validadas por, pelo menos, três experiências independentes.

5. blotting

células de cancro da bexiga de Western foram lisadas em 400 ul de tampão de SDS a 1% de lise (50 mM de HEPES, pH 7,5, NaCl 100 mM, EDTA 10 mM, NAPPI 4 mM, Na 2 mM de

3VO

4) durante 5 min em gelo para se obter lisados ​​de células totais. Para recolher proteína nuclear, as monocamadas foram lavadas três vezes com tampão de lise hipotónico gelado (HLB, pH 7,5, Tris a 10 mM, KCl 10 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, MgCl 2 mM de

2), e as células foram recolhidos e transferidos para um homogeneizador (Wheaton Ltd, Millville, NJ, EUA) em 500 ul de HLB. As células foram inchados em HLB durante 15 minutos, homogeneizados e os núcleos das células foram recolhidas por centrifugação e lisadas em tampão RIPA. O ensaio suspenso foi realizada pela imunoprecipitação de 500 ug de extracto nuclear ou citosólica (pré-aclarados com proteína A /G grânulos) com o anticorpo primário, e, em seguida, 50-100 ug, total ou lisado nuclear foi resolvido numa dodecilo de sódio 7,5-12,5% sulfato-poliacrilamida (SDS-PAGE) em gel, para uma membrana Hybond ECL (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, EUA), bloqueadas em PBS contendo 5% de leite desnatado seco e 0,05% transferidas electro-Tween-20, incubou-se com anticorpo primário durante a noite a 4 ° C, e, em seguida, incubadas com anticorpos secundários durante 1 h. As bandas de proteína foram visualizadas usando o sistema Phototope-HRP Ocidental Detection (Cell Signaling, Beverly, MA, EUA) e filme Kodar (Perkin Elmer, Waltham, MA, EUA) e digitalizado e quantificados utilizando ImageJ (http: //rsbweb.nih .gov /ij /). O anti-ATM, anti-fosfo H2AX, anti-fosfo ATM (Ser 1981), anti-IKK, anti-fosfo IKK1 /2, anti-β-actina, anti-GAPDH, anti-fosfo-nemo (NF-kappa β modulador essencial), anticorpos anti-NBS1 (síndrome Nijimegen ruptura 1), anticorpo anti-caspase 3 e 9, anti-fosfo PARP e anti-OCT1 foram obtidos a partir de Cell Signaling.

6. siRNA transfecção

A transfecção de células TCCSUP e BDEC com ATM siRNA (50 nmol /L; Invitrogen) foi realizada utilizando o reagente Oligofectamine (Invitrogen) de acordo com o protocolo do fabricante

7.. Em estudos de terapia de tumor in vivo

O experimento foi aprovado pelo Comitê da Quarta Universidade Médica Militar de Ética. células de câncer de bexiga foram pré-misturados 01:01 com Matrigel (Becton Dickinson, Beijing, China) e inoculadas por via subcutânea (5 × 10

6 células por sítio) nos flancos de ratinhos nus SCID fêmea de 10 semanas de idade (Departamento de Animais experimentais, a Quarta Militar Medical University, Xi’an, Shaan’xi, China). O tratamento da droga começou 22 dias após a injecção das células tumorais. Os ratinhos foram divididos aleatoriamente (5 ratinhos /grupo) em grupos de cinco. O grupo de controlo foi comprometida tumores que foram tratados com 0,01% de DMSO. Os ratinhos foram tratados oralmente com comida que continha a genisteína (1 g /kg) e /ou a injecção transperitoneal de 3 ug /ml HCPT. A variação percentual no tamanho do tumor foi calculado por comparação com o valor inicial, ao fim de 22 dias.

8. teste de desvio de mobilidade electroforética (EMSA)

extractos celulares nucleares foram obtidos tal como anteriormente descrito, e 10? g de extracto nuclear foi incubado com oligonucleótido de cadeia dupla

32P-marcado NF-kB consenso purificado e 0,25 mg /mL poli (dI-dC) em 5 × tampão de ligação [18]. As amostras foram separadas em géis de poliacrilamida a 8%, os géis foram secos, exposto a filme de raios-X durante a noite a -80 ° C e desenvolvido usando um All-Pro 100 Plus processador automatizado filme de raios-X (All-Pro Imaging Corporation, Hicksville, NY, EUA).

9. Quantificação e estatísticos métodos

Os grupos foram comparados usando o Student

t

-test;

P

values≤0.05 foram considerados estatisticamente significativos.

Resultados

1. Efeitos de HCPT genisteína e sobre a viabilidade das células cancerosas da bexiga

células de bexiga foram tratados com genisteína durante 3 dias, e a viabilidade celular foi determinada utilizando o ensaio de MTT. O tratamento de uma variedade de linhas celulares de cancro da bexiga e células da bexiga BDEC com genisteína resultou na inibição da dose e dependente do tempo da proliferação celular, o que demonstrou que a genisteína inibe de forma reprodutível o crescimento de células cancerosas da bexiga. No entanto, foi observado um efeito sinérgico quando células cancerosas da bexiga J82, T24, TSGH8301 e TCCSUP e células da bexiga BDEC foram tratadas com diferentes concentrações de genisteína e HCPT (Fig. 1A). ensaios MTT indicaram que o efeito sinergístico de genisteína e HCPT foi (Fig. 1B), dependente da concentração.

. MTT de linhas celulares de cancro da bexiga e células BDEC tratadas com 10 mM genisteína e /ou 1? M HCPT; os resultados são expressos como percentagem de células de controlo. B. Ensaio de MTT de células TCCSUP e BDEC tratados com diferentes concentrações de HCPT e /ou genisteína durante 48 h. C. Distribuição do ciclo celular de TCCSUP ou BDEC tratada com uma HCPT uM e /ou genisteína 10 uM, durante 24 h. D. Apoptose medida por FACS em TCCSUP, e BDEC tratada com 10 uM de genisteína e /ou 1 uM HCPT. Os valores são média ± SEM de três experiências independentes; *

P Art 0,05 e **

P Art 0,01 comparado com o grupo controle. #

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P Art 0,01 em comparação com HCPT; @

P Art 0,05 e @@ P . 0,01 em comparação com genisteína

2. Synergistic detenção do ciclo celular por HCPT e genisteína

Ambos HCPT (1 uM) e genisteína (10 ^ M) durante um período de 24 horas mostraram uma capacidade significativa para prender o ciclo celular (Fig. 1C). Em comparação com o veículo, HCPT causou uma paragem do ciclo celular tanto na fase S (controlo: 57,6%, HCPT: 46,5%, a genisteína: 57,9%, HCPT + genisteína: 31,1% para células TCCSUP; controlo: 57,2%, HCPT: 43,1 %, genisteína: 53,6%, HCPT + genisteína: 29,1% para células BDEC) e a fase G2-M (controlo: 21,5%, HCPT: 30,6%, a genisteína: 22,1%, HCPT + genisteína: 41,6% para células TCCSUP; controle : 21,7%, HCPT: 30,3%, a genisteína: 26,7%, HCPT + genisteína: 36,3% para as células BDEC). Embora a genisteína (10 ^ M) sozinho não afectou o ciclo celular significativamente em comparação com os controlos, a adição de genisteína para células tratadas com HCPT (1 uM) sensibilizados significativamente as células a indução através HCPT /M G2 paragem do ciclo celular.

3. indução sinérgica de apoptose por HCPT e genisteína

Usando FACS para quantificar a apoptose, foi observado que 10? M genisteína e 1 PM HCPT sinergicamente e dose-dependente induzida apoptose em células de cancro da bexiga (Fig. 1D). A indução de apoptose foi dependente da dose e directamente correlacionada com uma inibição do crescimento das células (Fig. 1B, D).

4. activação ATM-dependente NBS1 é induzido por danos no DNA

Os resultados descritos na seção 3.3 indicou que a genisteína pode agir sinergicamente com HCPT para induzir a apoptose. Como afirmado acima, HCPT poderia induzir a apoptose das células por meio de indução de quebras de cadeia dupla (DSB) no ADN. Por isso, nós investigamos se esta sinergismo de apoptose está relacionada com a DSB. TCCSUP células foram tratadas com 1 uM HCPT e /ou 10 fiM de genisteína durante 1 h, e a proteína total a partir de cada grupo foi extraída e foram submetidos a transferência Western para a proteína histona cromossómico, γ-H2AX [19]. A transferência de Western demonstrou que HCPT e genisteína poderia induzir sinergicamente fosforilação H2AX em 1 hora após o tratamento de droga, o que indica que estas drogas poderia induzir DSB. Por outro lado, H2AX forte fosforilação ainda pode ser visto no grupo co-tratadas 24 h depois do tratamento em comparação com as células administradas apenas com drogas individuais, o que demonstrou um atraso no processo de reparação de danos no ADN (Fig. 2A). Além disso, uma HCPT uM e 10 uM genisteína sinergicamente activado a fosforilação de ATM em Sor 794 de uma forma dependente da dose (Fig. 2B). A distribuição espacial de ATM e γ-H2AX após tratamento com drogas foi determinada utilizando um ensaio de imunofluorescência multiplexado (Fig. 2C). Significativamente mais focos nucleares ATM e γ-H2AX foi observado em células tratadas com ambos TCCSUP HCPT e genisteína durante 30 min em comparação com o controlo, HCPT- e células tratadas com genisteína. Além disso, o tratamento com ambos os fármacos aumentaram significativamente a co-localização de ATM e γ-H2AX no núcleo da célula. O inibidor da ATM, Ku55933, diminuiu significativamente a formação de focos de ATM, e assim inibido co-localização γ-H2AX /ATM no HCPT- e células tratadas com genisteína (Fig. 2C). Um ensaio de imunoprecipitação foi realizada para explorar como ATM é fosforilada após HCPT e tratamento genisteína. O tratamento com ambos HCPT e genisteína activado ATM e induziu uma interação entre ATM /H2AX e NBS1 /H2AX nas células TCCSUP e BDEC. O inibidor NBS1, mirin, significativamente HCPT- atenuado e /ou genisteína induzida por ATM ou NBS1 e H2AX obrigatório em HCPT- e células tratadas com genisteína (Fig. 2D).

A. Western blot e quantificação de ADN H2AX reparação de danos após o pré-tratamento de 10 uM de genisteína e /ou 10 HCPT uM. HP-1α foi utilizado como um controlo de carga; os resultados são expressos em relação ao grupo de controlo, a 0 h. B. mancha Ocidental e quantificação de ATM Ser 1981 fosforilação após o pré-tratamento de células com 10 uM TCCSUP genisteína e /ou 10 HCPT uM durante 1 h. C. imagens representativas e quantificação da formação de fosforilação e focos H2AX ATM 30 min após o tratamento de células com 1 TCCSUP HCPT uM e /ou 10 fiM de genisteína; focos discretos de ATM autofosforilação aparecem em locais putativos de rupturas de filamentos duplos. D. Identificação da ATM interação /H2AX-dependente NBS1. TCCSUP células e as células foram tratadas com BDEC HCPT 1 uM e /ou genisteína 10 uM durante 1 h com ou sem o inibidor de NBS1, mirin, imunoprecipitados com anticorpo anti-ATM ou anti-NBS1 anticorpos e imunocomplexos foram detectados por Western blotting. ATM focos aumentou linearmente com a dose após 1 h genisteína e tratamento HCPT. Os valores são média ± SEM de três experiências independentes; IP: imunoprecipitação, W: Western-blot. *

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5. inibição ATM regula negativamente NF-kB e induz a apoptose em HCPT- e células tratadas com genisteína

Os níveis de ativado, fosforilada ATM foram investigados em células TCCSUP. TCCSUP células tratadas com 1 uM HCPT durante 1 h exibiu uma forte fosforilação constitutiva ATM, que pode ser inibida pelo ATM siRNA ou o inibidor da ATM pequena molecular específica, KU55933 (Fig. 3A). ensaios de imunoprecipitação indicou que ATM siRNA reduziu ATM /NEMO obrigatório em células TCCSUP; No entanto, HCPT e genisteína poderia aumentar de forma sinérgica de ligação (Fig. 3B) ATM /nemo, o que indicou que nemo desempenha um papel importante na supressão da activação HCPT induzida de NF-kB. Além disso, o aumento sinergístico da ATM /nemo obrigatório em HCPT- e células tratadas com genisteína foi acompanhada por um aumento da expressão IκBα (Fig 3C.) E reduziu a fosforilação IKK1 2 /(Fig 3D.); por sua vez, estes induziu o aumento da clivagem da caspase 3, caspase 9 e PARP (Fig. 3E).

A. Western blot de células ATM na fosforilação TCCSUP tratada com uma HCPT uM durante 1 h transfectadas com o controlo não-silenciamento (NSC) siRNA, ATM siRNA ou tratados com o inibidor da ATM, Ku55933 (10 uM, 2 h). B. Imunoprecipitação e Western blot de ATM e NEMO em células TCCSUP transfectadas com NSC siRNA ou ATM siRNA, ou tratados com 10 mM Ku55933, 10 mM genisteína e /ou 1? M HCPT. IP: imunoprecipitação, W: Western-blot. C. EMSA blot da expressão de NF-kB em células tratadas com 10 TCCSUP uM genisteína e /ou 1 uM HCPT na presença de NSC siARN e ATM siARN. D. mancha de Western de NF-kB, IKK2, expressão e IκBα IKK1 /2 fosforilação em células TCCSUP tratados com 10 pM de genisteína e /ou 1 uM HCPT na presença de NSC siARN e ATM siRNA, indicando que a genisteína e HCPT induzir a fosforilação de IKK1 /2 e aumentar IκBα expressão via ATM. E. mancha de Western de PARP, caspase 3 e caspase 9 clivagem em lisados ​​de células totais preparados a partir de células tratadas com 10 TCCSUP uM genisteína e /ou 1 uM HCPT na presença de ATM ou siRNA Ku55933. Todos os experimentos foram repetidos três vezes, e resultados semelhantes foram obtidos em cada repetição.

6. A genisteína atenuada NF-kB-ativação induzida HCPT e apoptose induzida, assim, em sinergia in vivo

Para verificar o efeito inibitório sobre o crescimento sinérgico por genisteína e HCPT em células de cancro da bexiga, determinou-se os seus efeitos num modelo de xenoenxerto de SCID os ratinhos tratados com a linha celular de cancro da bexiga TCCSUP. A genisteína e HCPT exibiu um efeito inibidor sinergético no crescimento do tumor no xenoenxerto (Fig. 4A). Além disso, os tumores tratados com HCPT mostrou activação de NF-kB, ao passo que a genisteína atenuada esta activação (Fig. 4B). A diminuição da activação das moléculas a jusante IKK1 /2, o aumento da fosforilação de IκBα e aumento da clivagem de caspase 3, caspase 9 e PARP foram observados em tumores tratados com genisteína e HCPT (Fig. 4C).

De células de cancro da bexiga

TCCSU os tumores foram autorizados a estabelecer durante 22 dias, em seguida, os animais foram injetados intratumoral com 10 mM genisteína e /ou 10 HCPT? M no dia 0 e 7 do tratamento. Curva de crescimento A. de TCCSUP xenoenxertos de cancro da bexiga tratadas com genisteína e /ou HCPT; o volume do tumor é expressa em relação ao tamanho do tumor no início do tratamento. B. ensaio EMSA de expressão de NF-kB em tecidos de tumor de xenoenxerto de cada grupo. análise de mancha C. ocidental de IKK1 fosforilada /2, IKK2, expressão IκBα em tecidos tumorais de xenotransplante de cada grupo.

Discussão

A genisteína é considerado para ser um agente de quimioterapia potencialmente ideal para cancro da bexiga, como é natural, seguro, com efeitos colaterais mínimos e custos relativamente baixos [20]. Investigações anteriores têm indicado que a isoflavona de soja, que está presente em grandes quantidades de produtos de soja, podem desempenhar um papel importante na inibição de tumorigénese [21]. Também tem sido mostrado para induzir a apoptose das células por meio de diminuição da expressão da caspase 3 32 kDa precursor e do aumento dos níveis da forma activa da caspase clivado deste [22]. Zhou et al. relataram que as isoflavonas de soja e de soja concentrados fitoquímicos poderia inibir o crescimento de murídeo e linhas de células de bexiga humana in vitro e in vivo de um modo dependente da dose [23]. Investigações prévias revelaram que o efeito inibidor sinérgico de genisteína e camptotecina no cancro do colo do útero, células de carcinoma do ovário do rato e fibroblastos resultou da sua inibição da translocação de NF-kB e a indução de G2 /M, a paragem do ciclo celular e apoptose [16].

se genisteína poderia sensibilizar as células da bexiga para tratamento de camptotecina não foi estudado anteriormente. Neste estudo, a genisteína e HCPT foram encontrados para inibir o crescimento de várias linhas celulares de cancro da bexiga e a linha celular epitelial da bexiga BDEC primária (Fig. 1A). A genisteína e HCPT sinergicamente e sobrevivência celular dependente da dose, inibiu a (Fig. 1B), G2 induzida /M paragem do ciclo celular (Fig. 1C) e apoptose (Fig. 1D) na linha celular de cancro da bexiga e TCCSUP BDEC células epiteliais da bexiga. No que diz respeito ao mecanismo subjacente, a indução de dano do ADN sinérgica dependente da dose por genisteína e HCPT e o seu efeito inibitório sobre o processo de reparação de danos no ADN foi observada durante até 24 h, em comparação com genisteína ou tratamento HCPT sozinho (Fig. 2A) . Como relatado anteriormente, tanto HCPT [24] e genisteína [25] pode inibir directamente o ADN de topoisomerase I. Nós supomos que a indução de dano do ADN por HCPT e genisteína é devido à sua inibição da topoisomerase I de ADN e, portanto, os seus efeitos sobre a formação de forquilha de replicação, o que requer uma investigação mais aprofundada.

Então, nós investigamos os efeitos de sinalização a jusante de danos no DNA genistein- e induzida HCPT para determinar como a indução sinérgica de ATM fosforilação está relacionada ao seu efeito pró-apoptótica. cinase ATM é um regulador chave que é activado por danos no ADN [26]. Tem sido relatado estar estreitamente correlacionado com a apoptose de células em várias células de cancro. Zuco et ai. relatado que o derivado da camptotecina, ST1968, podem induzir apoptose através da activação de ATM [27]. Kawakami et ai. relataram que a doxorrubicina pode induzir apoptose em células do adenocarcinoma A549 do pulmão pela activação ATM [28]. Neste estudo, verificou-se que um tratamento combinado com genisteína e HCPT induzidos sinergicamente fosforilação ATM Ser 1981 (Fig. 2B) em locais de danos no ADN. Em células tratadas com genisteína e HCPT, a inibição da ATM pelo seu inibidor específico, Ku55933, inibiram a fosforilação de ATM e H2AX, e, assim, inibe a sua co-localização (Fig. 2C).

NBS1 foi provado a ser o elemento-chave da MRE11 /RAD50 /NBS1 complexo, que faz imediatamente depois de formas de ADN DSB para recrutar proteínas relacionadas para reparar os locais DNA danificado [29]. ATM e NBS1 ambos se ligam a H2AX, uma proteína andaime em locais de danos no DNA. Conforme descrito anteriormente [30], descobrimos que a capacidade da genisteína e HCPT para induzir sinergicamente danos no DNA em células de cancro da bexiga através da activação ATM foi dependente NBS1, como o mirin inibidor NBS1 especificamente revogada HCPT- e vinculativa induzida por genisteína ATM /H2AX e NBS1 /H2AX de ligação (Fig. 2D). Estes resultados indicaram que o efeito prejudicial de ADN sinérgica das duas drogas foi, devido à sua inibição da ATM, que é dependente da NBS1. A fosforilação de ATM poderão activar o NF-kB via através nemo [31], o que leva à activação e expressão de uma variedade de genes pró-proliferativas e anti-apoptóticos, protegendo assim as células de cancro da apoptose. Nemo se pensa ser uma subunidade de ligação de poliubiquitina, que recruta IKK para andaimes de poliubiquitina lineares ou K63-ligadas que formam como consequência de eventos de sinalização iniciada por receptor [32]. Por conseguinte, após o tratamento com fármacos tóxicos de ADN, tais como HCPT, DSB induzidos activação ATM, e a jusante via de NF-kB é activado através nemo (Fig. 3B). No entanto, a via de NF-kB foi mostrado para proteger as células da apoptose celular, o que pode, em parte, atenuar os efeitos tóxicos de HCPT. Em nossa pesquisa, o tratamento genisteína pode inativar a via NF-kB no cancro da bexiga e células epiteliais. Em resumo, após tratamento HCPT, dano de ADN pode induzir a fosforilação da ATM, que activa a via de NF-kB para proteger as células da apoptose. No entanto, a capacidade de protease múltiplo de genisteína ajuda para ab-rogar a activação de NF-kB induzida HCPT [33]. O knockdown da ATM bloqueou completamente a capacidade da genisteína HCPT e para induzir a activação do NEMO /IKK (Fig. 3D) e inibiu a clivagem de caspase 3, caspase 9 e PARP (Fig. 3E). Isto indicou que a ATM desempenha um papel central na HCPT- e apoptose induzida por genisteína.

Para confirmar os efeitos sinérgicos de HCPT e genisteína, foi realizada experiências in vivo de xenoenxertos. Em xenoenxertos de células TCCSUP crescidos em ratinhos SCID, o tratamento combinado com HCTP e genisteína sinergicamente inibiu o crescimento tumoral (Fig. 4A). Este evento molecular intracelular está de acordo com resultados previamente descobertos nas células da bexiga. HCPT foi mostrado para activar o NF-kB, que foi neutralizada pela genisteína em ratinhos SCID (Fig. 4B). Co-tratamento com estes dois medicamentos sinergicamente activado ATM e inibiu IκBα (Fig. 4C).

Esta pesquisa indica que a isoflavona, a genisteína, pode reforçar significativamente os efeitos do agente de quimioterapia para o cancro da bexiga, HCPT, tanto em vivo e in vivo. Os efeitos pró-apoptóticos sinérgicos destas duas drogas induzem mais LAP e atrasar o processo de reparação de danos no DNA, ativando o /NEMO /IKK via ATM /NBS1. No entanto, alguns aspectos desta mecanismo permanecem por ser elucidados. Em primeiro lugar, não se sabe se a DSB sinérgico efeito da HCPT e genisteína induzindo ocorre através de interferência com a forquilha de replicação e toposoimerase I. Em segundo lugar, ainda não está claro como o processo de reparação de DSB está atrasado, se isso é através da inibição da homóloga recombinação, ou a inibição da extremidade não-homóloga aderir. Em terceiro lugar, o papel da inibição sinérgica de NBS-1 activação por HCPT e genisteína na má formação do complexo MRN requer exploração adicional. No final, a genisteína é um estrogénio botânico bem conhecido, e estrogénio tem mostrado ser expressa no cancro de células de transição da bexiga, e foi negativamente correlacionado com o grau do tumor [34]. Se o efeito estrogênio de genisteína está correlacionada com o efeito inibidor do crescimento sinérgico ainda precisam ser exploradas no futuro.

Em conclusão, este estudo demonstra que a genisteína pode sensibilizar linhas celulares de cancro da bexiga para HCTP, levando a uma dose sinérgica inibição dependente da proliferação e indução da paragem do ciclo celular e apoptose. A genisteína e HCTP induzir quebras no ADN de cadeia dupla, o que leva à activação sinérgica da ATM, atenua nemo /NF-kB /IKK /transdução de sinal de caspase, e, assim, induz a apoptose tanto in vitro como in vivo. A genisteína pode também neutralizar induzida HCPT activação da via NF-kB, e, assim, atenuar o efeito anti-apoptótico da via de NF-kB, tal como resumido na Fig. 5. Estes resultados indicam que, embora os mecanismos subjacentes exigem uma maior exploração, a administração combinada de HCTP e genisteína pode ser uma abordagem promissora para o tratamento de cancro da bexiga humana.

ATM é fosforilada em locais de DNA de fita dupla quebras por NBS1 na presença de fosforilação H2AX. Activado ATM é transportado para o citoplasma, e activa nemo, que fosforila IKK1 /2. IKK1 /2 ativa e ubiquitinizes IκBα, levando à degradação IκBα. Isso estimula a liberação e transporte de NF-kB para o núcleo, onde se liga ao DNA, ativa clivagem caspase e inicia a apoptose.

Reconhecimentos

Agradecemos ao Dr. Claudia Buehnemann ( Universidade de Oxford, UK) pelo seu excelente assistência técnica.