Abstract
beta do receptor da hormona da tiróide (
THRB
) gene é comumente desregulamentado em cancros e, fortalecido por modelos animais, postula-se desempenhar um papel supressor de tumores. Nossos estudos anteriores revelaram regulação baixa de
THRB
no carcinoma de células renais de células claras (ccRCC), mas os mecanismos culpados ainda não foram completamente elucidados. Desde regulação epigenética é um mecanismo comum que influencia a expressão de supressores de tumor, a hipótese de que a regulação negativa do
THRB
no resultado de cancro renal de aberrações epigenéticas, incluindo CpG metilação e silenciamento dependente de microRNA. Nosso estudo revelou que os tumores ccRCC apresentaram uma redução de 56% no
THRB
e um aumento de 37% no DNA metiltransferase 1 expressão (DNMT1), quando comparado com amostras de controlo não neoplásicas emparelhados. No entanto,
THRB
CpG análise de metilação realizada utilizando BSP, instantâneo e MSP-PCR consistentemente não revelou alterações nos padrões de metilação entre amostras de tumores e de controlo correspondentes.
In silico
análise resultou na identificação de quatro microRNAs (miR-155, miR-425, miR-592 e miR-599) como potencialmente alvo
THRB
transcrição. ensaio de luciferase mostraram ligação directa de miR-155 e miR-425 a 3’UTR do
THRB,
e subsequente in vivo análises revelaram que a transfecção de linha de células UOK171 com miR-155 sintéticos ou miR-425 resultou na diminuição expressão de endógena
TRHB
em 22% e 64%, respectivamente. Finalmente, a análise por PCR em tempo real mostraram regulação positiva significativa de miR-155 (354%) e miR-425 (162%) em ccRCC quando comparado com controlos correspondentes. Além disso, os níveis de microRNA foram negativamente correlacionadas com a quantidade de
THRB
transcrição em amostras de tecido. Concluímos que CpG metilação não é o principal mecanismo que contribui para diminuição
expressão THRB
em ccRCC. Em contraste,
THRB
é alvo de microRNAs miR-155 e miR-425, cuja expressão aumentada pode ser responsável pela regulação negativa da
THRB
em tumores ccRCC
Citation.: Um Wójcicka, Piekiełko-Witkowska A, Kedzierska H, Rybicka B, Poplawski P, Boguslawska J, et al. (2014) regulação epigenética de hormônio tireoidiano Receptor Beta em Câncer Renal. PLoS ONE 9 (5): e97624. doi: 10.1371 /journal.pone.0097624
editor: Javier S. Castresana, da Universidade de Navarra, Espanha |
Recebido: 18 de dezembro de 2013; Aceito: 23 de abril de 2014; Publicado em: 21 de maio de 2014
Direitos de autor: © 2014 Wójcicka et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. O estudo foi apoiado pelo Centro Nacional de Ciência concede NN401611940 e NN401047638 (a AN), a Bolsa UNESCO /FEBS Collaborative experimental para Central Europa Oriental, de 2010 (a AW) e do Centro Nacional de Ciência Grant 2012/05 /B /NZ5 /01541 (para APW). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
receptores de hormônios da tiróide (TRs): TRa e TRp, estão ligando (3,5,3-tri-iodotironina, T3) fatores de transcrição -inducible que medeiam os efeitos celulares de hormonas da tiróide, ou seja, sua forma ativa – T3 . Uma vez que os genes dependente de T3 incluem numerosas importantes reguladores do ciclo celular, tais como o mdm2, p53 e retinoblastoma [1], [2], medidas de ATR contribuir para a manutenção dos processos celulares chave, incluindo a proliferação, diferenciação, apoptose e metabolismo [3]. TRs incluem 3 proteínas funcionais: TRα1, TRβ1 e TRβ2, codificadas por
THRA Comprar e
THRB
genes. receptores TRα1 TRβ1 e são expressos em virtualmente todos os tecidos, mas os seus níveis de expressão e funcionalidade dependem do tipo de célula e estádio de desenvolvimento de um organismo. atividade Disturbed de TRs, resultantes de aberrações na expressão ou sequências de genes que codificam para TRs é um fenômeno comum em cancros humanos. Isso leva a expressão perturbada de genes dependente de T3 e, em consequência, a grave na homeostase celular. Estas observações conduziram a hipótese no papel supressor de tumor de TRp, ainda confirmada em vários estudos elegantes realizados em linhas celulares e modelos de ratinho [4], [5].
Um dos cancros em que a aberrações na função TRp são frequentemente observadas, é o tipo mais comum de tumores renais – carcinoma de células renais de células claras (ccRCC). O mais interessante,
THRB
gene reside dentro da região cromossômica 3p21-25, conhecido como um hot spot para mutações em genes envolvidos na patogênese ccRCC [6]. Os mecanismos culpados identificados até agora incluem mutações, expressão aberrante e splicing desregulado [7], [8], [9].
tem sido demonstrado que é acompanhada por ccRCC aberrações epigenética que pode contribuir directamente para o processo de tumorigénico , atuando na fase inicial e pré-cancerosas da tumorigénese renal vários estágios [10]. Numerosos estudos recentes indicam que a desregulação epigenética está entre as principais causas de ações descarrilou de supressores de tumor em cancros, ea maioria dos mecanismos frequentemente identificados incluem metilação do DNA e os microRNAs. metilação de DNA consiste na adição de um grupo metilo a uma citosina anterior guanina (CpG) na sequência de ADN, e é catalisada por ADN metiltransferases (DNMTs): DNMT1, dnmt3a e DNMT3B. DNMT3A e DNMT3B são
de novo de
metiltransferases, expressa predominantemente durante os estágios iniciais de desenvolvimento [11] que sustentam padrões de metilação dos pais. DNMT1 é referido como a metiltransferase de manutenção, uma vez que é responsável por manter padrões de metilação de ADN durante a replicação [12]. metilação aberrante em câncer é causado por expressão e função de DNMTs prejudicada. As células cancerosas exibem geralmente hipometilação genómico total, levando a instabilidade microssatélite e activação de genes envolvidos nas alterações metastáticos [13], [14]. Simultaneamente, a hipermetilação grave das regiões reguladoras de supressores de tumor, a reparação do ADN e genes de controlo do ciclo celular conduz a progressão do cancro [15]. Para ccRCC foi mostrado casos que numerosos de expressão subregulado de supressor de tumor VHL, inactivado em aprox. 50% dos pacientes ccRCC, resultam da hipermetilação do promotor do gene de [16].
MicroRNAs (miARNs) são RNAs curtos que inibem a expressão de genes codificadores de proteínas por ligação a sequências complementares em 3’UTRs (regiões não traduzidas ) dos seus transcritos. A sequência responsável por este reconhecimento inclui os nucleótidos 2-8 de um miARN e tem de ser totalmente complementar da sequência alvo no ARNm [17]. Inúmeros cânceres exibem expressão aberrante de microRNAs, levando a alterações graves no transcriptoma e proteoma de uma célula cancerosa. Para ccRCC, foi mostrado um número de microARNs ser desregulado no tumor [18] – [21]. Ambos metilação do DNA e regulação dependente de microRNA recentemente trouxe a atenção como dois mecanismos com maior potencial para possíveis intervenções terapêuticas [22]. Mostrou-se que os genes supressores de tumor, silenciados devido à hipermetilação DNA, pode ser reativado com agentes demetilantes. Além disso, imita e inibidores microRNA estão actualmente avaliadas como moléculas terapêuticas que mostram a promessa no medicamento anticancerígeno personalizado [23].
O papel das mudanças epigenéticas em
THRB
distúrbios no câncer foi investigada em um alguns estudos. O papel potencial da regulação dependente de microRNA em
THRB
silenciamento foi sugerido para ccRCC [9] e comprovada para o carcinoma de tireóide papilar [24]. Vários outros estudos sugeriram a hipermetilação do ADN como um mecanismo que contribui para
THRB
silenciamento em leucemia e cancros da mama, pulmão, tiróide e [25] – [30]
Esses estudos, bem como frequente. desregulamentações epigenéticas observados em ccRCC [31], nos levou a analisar o possível impacto da metilação do DNA e regulação dependente de microRNA em
THRB
expressão no câncer renal.
Materiais e Métodos
materiais
as amostras de tecido foram obtidos com a permissão do Comitê de Bioética do Centro de Pós-Graduação Educação médica em Varsóvia, de pacientes com carcinoma de células renais de células claras (ccRCC) (Tabela S1). consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes. As amostras foram divididas em dois grupos: tecidos de cancro (N = 35, T) e tecidos de controlo (emparelhado tecido normal a partir do pólo oposto do rim maligna ( 5 cm a partir do tumor) com nenhuma evidência histológica do tumor; n = 35 , C). ccRCC foi diagnosticada pela histologia de acordo com os critérios da OMS [32]
As seguintes linhas celulares foram usadas no estudo:. 1) HK-2 (ATCC CRL-No .: 2190), uma linha de células tubulares proximais derivado a partir de rim normal, imortalizadas por transdução com vírus do papiloma humano 16 (HPV-16) genes E6 /E7. 2) UOK171 (UOB Tumor de Células Linha Repository, fornecido pelo Dr. W Marston Linehan, NIH, NCI, Bethesda, EUA, patente E-033-2010 /0): derivado do tumor ccRCC estágio IV, espontaneamente imortalizada. 3) HeLa (adenocarcinoma CCL-colo ATTC nr. Todas as linhas celulares foram cultivadas de acordo com as instruções do fornecedor.
PCR em tempo real
RNA foi isolado e transcrição reversa como descrito anteriormente [33]. 200 ng de ARN foi utilizado para a transcrição reversa-PCR em tempo real foi realizada como descrito anteriormente [33], utilizando iniciadores específicos para transcritos de
THRB
(THRB-RT-F:. GAACAGTCGTCGCCACATC e THRB-RT-R: GCTCGTCCTTGTCTAAGTAAC) e
DNMT1
(DNMT1-RT-F: TTATCCGAGGAGGGCTAC e DNMT1-RT-R:. GGCTTCACTTCTTGCTTG) a transcrição reversa e PCR em tempo real de microARNs foi realizada como descrito anteriormente [34], utilizando sondas Taq-man específico para HSA-miR-155 (Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA, cat. no. 002623) e HSA-miR-425 (Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA, cat. no. 001516). a quantificação relativa de cada expressa miARN foi calculada usando o método 2-ΔCt padrão de associação entre a microARN e
THRB
expressão em amostras de tecido foi calculada utilizando o ambiente: R [35] e a análise de correlação múltipla de acordo com a fórmula:.
5-aza-2’desoxicitidina Tratamento
células UOK-171 foram semeadas em placas de 12 poços (Corning, Nova Iorque, EUA) numa quantidade de 5 × 10∧4 por poço. As células foram cultivadas 24 horas, em condições padrão, seguido pela adição de 100 mM ou 5 mM-aza-2’desoxicitidina 10 (5-aza-dC) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA). Após 24 horas as células foram lavadas com PBS e utilizado para o isolamento do RNA.
Análise do
THRB
metilação
Para a análise de metilação, foi utilizada a sequência de publicado anteriormente
THRB
promotor [36], GenBank Acc. não. S37458.1), atualizado de acordo com a seqüência do cromossomo 3 contig genômica (GenBank Acc. Não. NT_022517.18). Devido à disconcordance entre as duas sequências depositadas, que clonado e a região de ADN que envolve
THRB
promotor.
Para alcançar este objectivo, o ADN genómico foi isolado a partir de uma amostra de rim não-tumoral, tal como descrito anteriormente directamente sequenciado [37]. A região contendo
THRB
promotor foi amplificado utilizando iniciadores THRB-HindIII-PromU (CGTAAAGCTTCATATGGGTAACACTGAGGGCATAGC) e THRB-HindIII-PromL (CGTAAAGCTTACTCCTTGGGCGAAGAGAGGC) e Hot Start Perpetual OptiTaq (EURx, Gdansk, Polónia), nas seguintes condições: . 95 ° C-10 min, 5 ciclos: [96 ° C-35 s, 62 ° C-30 s, 73 ° C-80 s], 40 ciclos: [96 ° C-40 s, 59 ° C-30 s, 72 ° C-80 s], alongamento final: 72 ° C, 10 min. O produto de PCR obtido foi clonado no vector pGEM-T (Promega, Madison, WI, EUA) e sequenciados. A sequência obtida foi depositada no GenBank (Acc não. KF669869).
Para identificar ilhas CpG, foram empregados
in silico
análise utilizando CpG Plot [38] e CpG Ilha Searcher [39], região rica em CpG foi detectada em uma sequência que engloba o promotor e a 5 ‘UTR (exão 1) de TRp transcrição.
Para analisar a metilação de
THRB
ilhas de CpG, 800 ng de ADN genómico foi bissulfito-convertidos utilizando Kit Imprint DNA Modification (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, EUA), de acordo com as instruções do manufecturer. Para prever as alterações de nucleótidos que resultam da conversão de bissulfito,
THRB
sequência era
in silico
convertidos usando Encantador de serpente (https://insilico.ehu.es/restriction/two_seq/snake_charmer.html) e usado para o projeto de primers.
para executar bissulfito-Sequencing PCR (BSP), utilizou-se 100 ng de DNA bissulfito-convertido, juntamente com Perpetual Taq HOT START (EURx, Gdansk, Polónia) polimerase e primers dadas na Tabela S2, sob as seguintes condições: desnaturação inicial: 95 ° C, 10 min, 38 ciclos de: [desnaturação: 95 ° C-15 s, emparelhamento: 56 ° C ou 57 ° C-15 s, de alongamento: 68 ° C -30 s], alongamento final: 75 ° C, 15 min, incubação final: 4 ° C. A temperatura de recozimento variaram de 56 ° C a 67 ° C, dependendo dos iniciadores utilizados (Tabela S2). Os produtos de PCR obtidos foram directamente sequenciados por um serviço comercial (Genomed, Warsaw, Polónia).
metilação específicas de PCR (MSP-PCR) foi realizada como descrito anteriormente [26]. As sequências dos iniciadores são dadas na Tabela S3.
análise instantâneo foi realizada utilizando o kit SNaPshot Multiplex (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) e os iniciadores apresentados na Tabela S3 de acordo com as instruções do fabricante. Os produtos foram analisados por um serviço comercial (Biote21, Cracóvia, Polónia).
A especificidade dos primers utilizados para a análise de metilação foi analisada utilizando MethPrimer [40].
Análise dos microRNAs Segmentação
THRB
Transcrição
microRNAs potencialmente ligação
THRB
3’UTR foram preditos usando miRecords e DIANA-mirPath [41], [42] (Tabela S4). Em seguida, PubMed buscou-se encontrar informações sobre a expressão dos microRNAs previstos em ccRCC. Somente microRNAs tanto com expressão aumentada relatada em tumores renais e potencialmente alvo a
THRB
transcrição foram levados para análise posterior.
Para analisar o efeito de microRNAs em indígena
THRB
expressão , UOK171 células foram semeadas em placas de 12 poços (Corning, NY, EUA) utilizando 5 × 10∧4 células por poço e foram transfectadas, 24 horas mais tarde. mistura de transfecção foi preparado como se segue: 1) 2 ul de Lipofectamina 2.000 (Invitrogen /Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA) foram misturados com 125 ul de Opti-MEM (Gibco /Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA), e 2) 50 imita ou inibidores pmol microRNA (Ambion /Life Technologies, Foster City, CA, EUA, Tabela S5) foram misturados com 125 ul Opti-MEM. Após 10 minutos de incubação à temperatura ambiente, as soluções foram combinadas, incubadas durante mais 10 min, e adicionou-se aos poços. Após 6 horas misturas de transfecção foram substituídos com meio completo. Após 24 horas, as células foram recolhidas para isolamento de ARN.
Para os ensaios de repórter de luciferase, HeLa foram escolhidas devido à baixa expressão endógena de microARNs (Figura S1). As células foram semeadas em placas de 12 poços (Corning, Nova Iorque, EUA) utilizando 5 × 10∧4 células por poço e foram transfectadas, 24 horas mais tarde. mistura de transfecção foi preparado como se segue: 1) 4 ul PEI 1 ug /ul (polietilenimina, Polysciences, Warrington, PA, EUA) foram misturados com 125 ul de Opti-Mem, e 2) 1 ug pGL3-Luc-3’UTR-THRB plasmídeo (Jazdzewski et al., 2011) foi misturado com 125 uL de Opti-Mem. Para plasmídeo de referência, foram preparadas as seguintes misturas: 1) 2 mL de PEI com 62,5 ul de Opti-Mem, e 2) 100 ng de plasmídeo pRL-TK (Promega, Madison, WI, EUA) com 62,5 ul de Opti-Mem. Após 20 minutos de incubação à temperatura ambiente, as soluções foram combinadas, incubadas durante mais 20 min e adicionada aos poços de cultura contendo 700 ul de meio sem FBS. Após 6 horas, o meio foi substituído com misturas de transfecção contendo microARN mimics- preparado como descrito acima. Informação sobre imita microRNA e inibidores é dada na Tabela S5. Após 6 horas, misturas de transfecção foram substituídos com meio completo; As células foram lisadas após 24 horas e analisadas no duplo de Luciferase Reporter Assay (Promega, Madison, WI, EUA) utilizando um luminómetro 2 Sinergia (BioTek, Winooski, VT, EUA).
Resultados
A expressão de
THRB
e
DNMT1
é alterada no cancro renal
PCR em tempo real de análise realizada em ccRCC e emparelhado amostras de controlo não-tumorais revelou alterações significativas em
THRB
expressão de ARNm (Figura 1). A expressão de
THRB
foi diminuída em 56% (p 0,0001) no tumor, quando comparado com amostras de controlo. Esta diminuição de expressão foi encontrado em 32 dos 35 (91,4%) analisaram amostras pareadas.
A.
THRB
e
DNMT1
expressão de mRNA em amostras de tecido: controlos não-tumorais (C, n = 35) e amostras emparelhadas ccRCC (t, n = 35). Os dados estão apresentados como percentagem do controlo (C). PCR em tempo real de cada amostra foi realizada em triplicado. A análise estatística foi realizada utilizando Wilcoxon teste de pares combinados. **** P 0,0001. B. A expressão de
THRB
e
DNMT1
mRNA em linhas celulares: HK2: linha de células tubulares proximais derivada de rim normal, UOK171: linha de células ccRCC derivado do tumor em estágio IV, espontaneamente imortalizada. Os gráficos mostram resultados de cinco experiências biológicas independentes, medidos em triplicado. A análise estatística foi realizada pelo teste t. ** P . 0,01
Em tempo real a análise PCR realizada em cDNA a partir de linhas de células de rim confirmados diminuição da expressão de
THRB
no câncer renal.
THRB
expressão foi de 63% (p = 0,0036) mais baixos na linha celular ccRCC UOK171, quando comparado com células não-cancerosas HK2 (Figura 1).
Estudos anteriores da análise da expressão de DNA metiltransferase 1 (DNMT1) em câncer trouxe resultados conflitantes renais [43] – [45]. Portanto, decidimos analisar
expressão DNMT1
em nosso estudo. Os níveis de ARNm DNMT1 foram aumentadas em 22 de 35 amostras analisadas ccRCC quando comparado com controles pareados (Figura 1). A expressão DNMT1 média em tecidos tumorais foi aumentada em 38%, quando comparado com amostras de tecido controle pareado (p = 0,0098). Em linhas celulares, expressão DNMT1 foi aumentada em 27% no UOK171 quando comparado com a linha de células HK2 não-tumoral (p = 0,0059).
Estes resultados sugerem que o aumento da
níveis DNMT1
em amostras ccRCC poderia resultar em elevada metilação CpG levando a regulação negativa da
expressão THRB
.
Análise do
THRB
CpG metilação em Câncer renal
para verificar se o diminuição
THRB
expressão poderia resultar de CpG hipermetilação, UOK171 células foram cultivadas na presença ou ausência de inibidor DNMT1, 5-aza-dC. O tratamento com 5-aza-dC resultou em um aumento estatisticamente significativo (p = 0,0124), 37% de aumento de
THRB
expressão quando comparado com o controlo, as células não tratadas (Figura 2A).
. O efeito de desoxicitidina 5-aza-2 ‘(5-aza-dC) em
THRB
expressão de ARNm em linhas celulares UOK171. Os resultados estão apresentados como percentagem do controlo (células cultivadas sem suplementação de 5-aza-dC). O gráfico mostra os resultados de três experiências independentes biológicos, medidos em triplicado. A análise estatística foi realizada pelo teste t. * P 0,05. B. A seqüência de
THRB
gene com a região do promotor (GenBank Acc.no. KF669869). CpG ilha, que engloba o promotor e 1
st exão (região -873 a +355) é sombreado azul. caixa de TATA está em negrito. dinucleótidos CpG são sombreados cinza. Letras minúsculas indicam 1
st exão da transcrição TRp. C. Representante análise eletroforética de MSP-PCR. Os produtos de PCR obtidos com os iniciadores específicos de sequência não metilado;: L H: Os produtos de PCR obtidos com os iniciadores específicos para sequência metilado. C: amostras de controlo, T:. Amostras de tumores
Para determinar se a restauração da
THRB
expressão no câncer renal está diretamente regulada por metilação do promotor,
THRB
sequências foram analisados utilizando CpG Plot e CpG Ilha Searcher. Ambos os programas previu uma região rica em CpG dentro do promotor e 5 ‘UTR de
THRB
gene, que abrange os nucleótidos -873 a +355 (Figura 2B). Em seguida, a região prevista foi analisado utilizando sequenciação de bissulfito de PCR (BSP). Para este fim, as amostras de DNA de 15 pares de tecidos ccRCC e correspondentes amostras de rim de controlo não-tumorais foram bissulfito-convertido e directamente sequenciado. bissulfito de conversão eficiente foi confirmada em reacções de PCR com o uso de iniciadores concebidos para direccionar nativa
THRB
promotor e não amplificam ADN-bissulfito convertido. reacções de amplificação de controlo realizados em ADN convertido bissulfito produzido nenhum produto de amplificação (sequências de iniciadores de controlo são dados na Tabela S2). Esta análise revelou falta de diferenças nos padrões de metilação entre as amostras de controlo e de tumor emparelhados a partir do mesmo paciente (Figura S2). Para verificar os resultados da BSP, o bissulfito convertido ADN foi adicionalmente analisada usando SNaPshot e MSP-PCR, um método altamente sensível que permite a detecção de alelos metilados a 0,1% de uma determinada ilha CpG locus de [46] (Figura 2C). Estas análises confirmaram que não houve mudanças nos padrões de metilação CpG em amostras ccRCC quando comparado com amostras de controlo correspondentes. Curiosamente, os resultados MSP-PCR sugeriram que os padrões de metilação variou entre pacientes diferentes, sendo específico do paciente, em vez de-influenciada pelo estado de doença.
Em conclusão, estes resultados sugerem que, embora as alterações na actividade DNMT1 podem contribuir para alterações de
THRB
expressão em culturas de células, a expressão perturbada de
THRB
em amostras de tecido ccRCC é bastante não um resultado da hipermetilação aberrante, específicos do tumor de promotor do gene.
microRNAs miR-155 e miR-425 Diretamente alvo
THRB
3’UTR
Para prever microRNAs potencialmente influenciar
THRB
expressão no câncer renal, foi realizada a análise de duas etapas. Em primeiro lugar, a análise bioinformática utilizando miRecords (um recurso que combina 11 programas de bioinformática) e Diana-mirPath previu cerca de 600 microRNAs potencialmente alvo
THRB
3’UTR. No entanto, com base no pressuposto de que o silenciamento eficiência é mais elevada para o microARNs que se encontram dentro da proximidade mais próximo de cada extremidade da 3’UTR [47] que especificamente voltado para microARNs que satisfizeram este regra. Subsequente pesquisa em PubMed permitido para selecção de microARNs que foram relatados como sobre-expresso em cancro renal [18] – [21]. Usando a abordagem de dois passos, quatro microRNAs (miR-155, miR-425, miR-592 e miR-599) foram selecionados para análise posterior.
A fim de descobrir se os microRNAs escolhidos fato vincular a 3’UTR de
THRB
, as células HeLa foram transfectadas usando microRNAs sintéticos e um repórter construir pGL3-luc-3’UTR-
THRB
(Figura 3). As células HeLa foram escolhidos para esta análise, devido à baixa expressão endógena de
THRB Comprar e analisados microRNAs. A transfecção de células com pré-miR-155 ou pré-miR-425 resultou em 32% ou 17% de decréscimo da actividade de luciferase, respectivamente, quando comparado com o controlo imita miARN (p 0,001). Não há alterações na actividade de luciferase foi observado em células transfectadas com pré-miR-592 ou pré-miR-599. Pré-miR-221, previamente relatado para segmentar
THRB
3’UTR [25] foi usado como controlo positivo e confirmou a eficiência do silenciamento miARN-mediada (Figura 3).
. O efeito de imita microRNA sobre a actividade de luciferase expressa a partir de um plasmídeo repórter pGL3-Luc-3’UTR-THRB. As células HeLa foram transfectadas com o plasmídeo repórter e respectivos imita microRNA: pré-miR-155, pré-miR-425, pré-miR-599, ou pré-miR-221. Os resultados são apresentados como percentagem de controlo (Ctrl, as células transfectadas com anti-pré-direccionamento MIR). O gráfico mostra os resultados de três experiências independentes biológicos, medidos em triplicado. A actividade relativa da luciferase do pirilampo foi normalizada para a actividade da luciferase de Renilla. A análise estatística foi realizada utilizando ANOVA seguido pelo teste de comparação múltipla de Dunnett. *** P 0,001. B. O efeito do miR-155 e miR-425 em endógena
THRB
expressão em células de cancro renal. UOK171 células foram transfectadas utilizando as respectivas imita microRNA (pré-MIRs) ou inibidores (anti-MIRs), e
THRB
expressão de mRNA foi analisada utilizando PCR em tempo real. Os resultados são apresentados como percentagem de controlo (as células transfectadas com anti-pré-direccionamento MIR). As parcelas mostra os resultados de três experiências independentes biológicos medidos em triplicado. A análise estatística foi realizada utilizando ANOVA seguido pelo teste de comparação múltipla de Dunnett. * P 0,05, *** p 0,001. C. A expressão de miR-155 e miR-425 em controlos não tumorais, (C, n = 35) e emparelhado ccRCC amostras de tecido (T, N = 35). Os resultados são apresentados como percentagem de controlo. PCR em tempo real de cada amostra foi realizada em triplicado. A análise estatística foi realizada utilizando Wilcoxon teste de pares combinados. * P 0,05, ** p 0,01
miR-155 e miR-452 Influência
THRB
expressão em células de cancro renal
Para analisar posteriormente a. efeito do miR-155 e miR-425 em endógena
THRB
expressão, linha de células UOK171 derivadas de cancro renal foi transfectado usando imita microRNA (pré-miR-155 ou pré-miR-425) inibidores ou microRNA ( anti-miR-155 ou anti-miR-425) (Figura 3). A transfecção resultou num decréscimo estatisticamente significativo na
THRB
expressão em 22% para a pré-miR-155, p 0,05, e de 64% para a pré-miR-425, p 0,001, quando comparado com microARN controle (Figura 3). A transfecção de linhagens celulares com inibidores microRNA não resultar numa alteração estatisticamente significativa de
THRB
expressão, apesar de uma tendência para o aumento da expressão foi observado (Figura 3). Esta observação pode resultar do facto de que os níveis de miR-155 e miR-425 são altamente elevados na linha de células UOK171, portanto, apesar de numerosas concentrações testadas, a quantidade de inibidores microRNA poderia ser insuficiente para o bloqueio eficiente da actividade microARN.
Estes estudos sugerem que miR-155 e miR-425 influenciar diretamente
THRB
expressão em células de cancro renal.
A expressão de miR-155 e miR-425 é elevada em Câncer renal e se correlaciona com diminuição da expressão de
THRB
a fim de verificar se as alterações específicas do tumor de miR-155 e miR-425 pode afetar
THRB
expressão em tumores ccRCC, a expressão de ambos os microARNs foi analisada em amostras de tecido 25 e 25 ccRCC correspondentes amostras de rim não-tumorais (Figura 3). A expressão de ambos os microARNs foi estatisticamente significativamente aumentada (por 354%, p = 0,0072 para o miR-155 e 62%, p = 0,041 para o miR-425). Simultaneamente, a expressão de ambos os miRs foi negativamente correlacionada com a expressão de
THRB
. Embora o coeficiente de correlação foi fraca (r = 0,245, p = 0,0075) nas amostras de controlo, a correlação foi significativamente maior em tumores (r = 0,469, p = 0,0225). Concomitantemente, houve também uma correlação significativa entre a relação T /N de miRNA e
THRB
expressão (R = 0,396, p = 0,002). Estes resultados indicam que
THRB
níveis de expressão dependerá do miR-155 e miR-425 e expressão de desregulação miRs está ligada com reduzido
THRB
níveis em ccRCC (Figura S3).
Discussão
neste estudo, utilizando três métodos diferentes, mostramos que nas amostras analisadas de câncer renal aberrantes
THRB
expressão não resulta de alterações específicas do tumor na metilação do DNA de
THRB e região promotora. Em vez disso, a expressão de
THRB
em ccRCC é afetado por microRNAs, miR-155 e miR-425 que se ligam diretamente ao
THRB
3’UTR, como sugerido pela observação de que elevada expressão de esses microRNAs em ccRCC é acompanhada por regulação negativa da
THRB
.
hipermetilação de
THRB
promotor foi relatada em várias neoplasias, incluindo mama, tireóide e pulmão e leucemia [25 ] – [30]. Curiosamente, os estudos mostraram que as taxas de metilação de
THRB
foram muito variáveis entre os pacientes, uma vez que hypermethylated
THRB
foi detectada em 25-80% dos tumores analisados. Além disso, apenas metade dos estudos sobre
THRB
metilação foi realizada em ambos os tumores e tecidos de controlo emparelhado não-tumorais. Iwasaki et al. examinou 116 não-pequenas do pulmão de células, incluindo 6 amostras para as quais emparelhado foram analisados tecidos de controle adjacentes. Fora das amostras tumorais de 116, 54 revelou hipermetilação do
THRB
. Quando 6 tumor emparelhado contra amostras de controlo foram comparados,
THRB
foi metilado em todos os tumores e não metilado, em todas as amostras de controlo não-tumorais. Em dois outros estudos que analisaram os tumores de câncer de mama e linhas celulares [25], [29] hipermetilado
THRB
foi detectada em 80% -100% dos tumores e ca. 37% das amostras pareadas. Além disso, o grau de metilação e padrão variou entre amostras derivadas de pacientes diferentes. variabilidade inter semelhante também foi observada em um estudo realizado em tumores da tiróide [30], em que pares de amostras de tecidos normais não estavam disponíveis e, portanto, não analisados. O nosso estudo revelou também que
THRB
metilação variou significativamente entre as amostras de tecido derivadas de pacientes diferentes. Estes resultados sugerem que a falta de amostras de controlo não-tumorais pares pode levar a um viés e resultar em classificação de um variações específicas do paciente em
THRB
metilação como mudanças específicas para o tecido canceroso.
Embora
THRB
expressão não parecem ser influenciadas por metilação do DNA nas amostras de cancro renal, o tratamento de linha de células UOK171 com desoxicitidina 5-aza-2 ‘resultou em aumento da expressão de
THRB
gene. Isto sugere que o
THRB
expressão pode ser indiretamente influenciados pela atividade DNMT1. De acordo com estudos anteriores, a metilação do DNA pode indirectamente afectar a transcrição de um gene alvo em vários mecanismos de [48], incluindo a regulação de genes por uma via de transdução do factor de transcrição ou reactivada sinal que é afectada por metilação do DNA. Qual destes mecanismos pode afetar
expressão THRB
em câncer renal é actualmente desconhecida. Além disso, não podemos excluir a possibilidade de que em outros pacientes ccRCC e nas outras linhas celulares derivadas de ccRCC, o
THRB
metilação do promotor poderia influenciar
THRB
expressão. Isso, espero, será verificada por meio de estudos futuros sobre ccRCC.
Outro mecanismo epigenético que influencia a expressão de genes-alvo é a regulação dependente de microRNA de expressão [49]. Um único gene pode ser alvo de várias microARNs e microARN único pode regular numerosos genes alvo. Em consequência, a desregulação da expressão de miARN que está associado com numerosos cancros leva a uma grave ruptura do proteoma celular e transcriptoma. Neste estudo identificamos dois microRNAs cuja ligação directa com o
THRB
3’UTR foi confirmada no ensaio de luciferase realizado em linhagem de células HeLa, usado devido a níveis de expressão relativamente baixos de ambos analisados miRNAs.