Abstract
ácido trans-retinóico (ATRA) tem sido amplamente investigada para tratamento de muitos tipos de câncer, incluindo câncer de próstata .
HOXB13
, silenciados na andrógeno receptor-negativo (AR
-) células cancerosas da próstata, desempenha um papel na AR
– o crescimento de células de câncer de próstata prisão. Neste estudo, destina-se a elucidar os mecanismos que estão envolvidos na inibição da proliferação de AR
– células de cancro da próstata desencadeadas pelo ATRA. Descobrimos que ATRA foi capaz de induzir a paragem do crescimento e aumentar a
expressão HOXB13
na AR
– células cancerosas da próstata. Ambos EZH2 e DNMT3B participou na repressão da
HOXB13
expressão através de um mecanismo epigenético envolvendo modificações no DNA e metilação de histonas. Especificamente, EZH2 recrutados DNMT3B para
HOXB13
promotor para formar um complexo de repressão. Além disso, ATRA poderia upregulate
HOXB13
através da diminuição das expressões EZH2 e DNMT3B e reduzindo as suas interacções com o
HOXB13
promotor. Ao mesmo tempo, o nível de metilação do
HOXB13
promotor foi reduzido mediante o tratamento de ATRA. Os resultados deste estudo implicou um novo efeito de ATRA na inibição do crescimento de AR
-. Células cancerosas humanas da próstata resistentes através da alteração das
HOXB13
expressão como resultado de modificações epigenéticas
citação: Liu Z, Ren G, Shangguan C, Guo L, Dong Z, Li Y, et al. (2012) ATRA inibe a proliferação de células DU145 do cancro da próstata através de redução do nível de metilação do gene HOXB13. PLoS ONE 7 (7): e40943. doi: 10.1371 /journal.pone.0040943
editor: Fazlul H. Sarkar, Wayne Escola de Medicina da Universidade de Estado, Estados Unidos da América
Recebido: 20 Abril de 2012; Aceito: 15 de junho de 2012; Publicação: 13 de julho de 2012
Direitos de autor: © 2012 Liu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por subsídios da National Science Foundation Natural da China (30971613, 31071149, 91019011, 30800557), e os fundos de investigação fundamental para as universidades Central (09ZDQD01). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o câncer de próstata é a neoplasia maligna mais comum em homens na Europa, América do Norte e em um número de países africanos [1], [2]. A incidência de cancro da próstata aumentou após o envelhecimento da população mundial [3]. Actualmente, as terapias convencionais, tais como cirurgia e tratamento hormonal frequentemente não permitem atingir o efeito satisfatório. Além disso, as células cancerosas podem adquirir as características de resistência ao hormônio e medicamentos sob essas tensões de tratamento [4]. Até agora, os esforços para conquistar esta doença maligna têm alcançado sucesso limitado [5]. Assim, pesquisas que visam o desenvolvimento de novas e mais eficazes estratégias terapêuticas para o câncer de próstata permanecem uma oportunidade aberta.
gene HOXB13
pertence a uma grande superfamília homeobox, muitos dos quais são fatores de transcrição que regular a especificação região axial durante o desenvolvimento embrionário [6], [7]. expressão limitada de
HOXB13
foi observada na extensão caudal da medula espinal, do seio urogenital, e as células do cólon e do recto de um modo independente de androgénios; mas expresso em tecido da próstata com especificidade notável para manter a sua função fisiológica normal e para induzir a diferenciação terminal de [8], [9].
HOXB13
é silenciada em andrógeno receptor-negativo (AR
-) células cancerosas da próstata. Jung
et al
. [5] mostraram que a expressão ectópica de
HOXB13
em uma linha de células de cancro da próstata G1 induzida paragem do ciclo celular através da regulação negativa do fator-4 de células T, mas não levou a mudança na taxa de apoptose. Superexpressão de
HOXB13
na AR
– células de câncer de próstata resultou em significativa inibição do crescimento celular [10]. No entanto, o mecanismo subjacente a esta silenciamento do gene não é completamente compreendido. Recentemente, nós investigamos as funções do grupo Polycomb (PCG) proteínas e as suas acções epigenéticas em silenciamento de
HOXB13 em células de câncer de próstata, e descobriram que houve uma interferência entre acetilação das histonas e membros de proteínas GPC dos reprimindo a
HOXB13
expressão [11]. Neste estudo, nós fornecemos mais provas de que metiltransferases de DNA (DNMTs) e proteínas PCG sinergicamente inibida
HOXB13
atividade do promotor.
All-trans ácido retinóico (ATRA), a vitamina A metabólito, peças um papel essencial no desenvolvimento de regulação de processos celulares tais como a proliferação, diferenciação e migração [12]. ATRA implementa o seu efeito por ligação específica superfamília de receptores nucleares, os receptores do ácido retinóico (RAR). Os RAR formar um heterodímero com o receptor retinóide X [13]. Estudos anteriores revelaram que o tratamento de células leucémicas com ATRA resultou na apoptose, provavelmente secundária para o processo de diferenciação [14], [15]. Uma vez que o ATRA pode corrigir o crescimento celular aberrante e induzir a apoptose, tem sido amplamente investigados em ensaios pré-clínicos e clínicos para o tratamento de muitos tipos de cancro, incluindo o cancro da próstata e cancro gástrico precoce [16], [17]. Em AR
– e células de cancro da próstata DU145 resistentes a drogas, o ATRA foi demonstrada para aumentar a sensibilidade das células ao agente anticancerígeno docetaxel; No entanto, os mecanismos como ATRA isoladamente induz a paragem do crescimento de células permanecem incertos [18].
PCG proteínas são repressores globais de expressão do gene através da formação de complexo repressor Polycomb (RPC), tais como e PRC1 PRC2 [19]. Várias proteínas PCG têm sido implicados nas actividades oncogénicos [20]. Tem havido indicações de que a actividade do repressor PCG aumenta durante a progressão do cancro da próstata [21]. Além disso, alguns
PCG
produtos de genes também foram encontrados para ser necessário para o silenciamento estável de
Hox
genes em todo
Drosophila
desenvolvimento [22]. Enhancer de Zeste Homólogo 2 (EZH2), a subunidade catalítica de PRC2, possui uma actividade de histona metiltransferase de histona 3 lisina 27 trimethylation (H3K27me3), que estabelece um forte sinal para a expressão do gene repressor [19]. Foi demonstrado que a sobre-expressão ectópica de
EZH2
não só estimulou a proliferação celular, mas também promoveu o crescimento celular e invasão independente de ancoragem
in vitro
[20]. Em contraste, a depleção de
EZH2
por pequenos RNAs de interferência (siRNAs) inibiu a proliferação celular e induziu apoptose em próstata, mama e cólon células cancerosas [23], [24], [25].
a metilação do ADN é um grande modificação epigenética que influencia a transcrição do gene. metilação do DNA em células de mamíferos é estabelecida e mantida pelo DNMTs. A metilação é iniciada por DNMT3a altamente homólogas e DNMT3B, e hereditariamente propagadas por DNMT1 [26]. Entre estes três enzimas, regulação positiva de
DNMT3B
é uma característica de muitas células cancerosas, e DNMT3B pode desempenhar um papel causal na tumorigênese [27]. Estudos realizados em um modelo de rato mostraram que a superexpressão de
DNMT3B
, mas não
DNMT3a
, promovido cólon tumorigênese em
ApcMin /+
ratos [28]. Um estudo anterior demonstrou que a expressão de
HOXB13
foi controlada de uma forma dependente de metilação e a sua metilação estava correlacionado positivamente com o grau do tumor e invasão de microvasos [29]. Em células de cancro do cólon,
HOXB13
, como alvo de DNMT3B, foi metilado em uma ilha CpG a montante, e funcionou como um supressor tumoral em tumores colorretais primários [26].
Desde DNMT3B faz não têm domínios de ligação de ADN, que necessita de transcrição de co-factores para interagir com sequências de genes específicos [30]. Ele tem sido conhecido que muitos membros do PCG, como EZH2, possuir os domínios de ligação para
HOXB13
promotor, e eles suprimem
HOXB13
expressão através das histonas metilação [31]. Significativamente, EZH2 foi implicada como desempenhando um papel chave na mediação de ambos metilação das histonas e metilação do DNA de
gene HOXB13
em algumas células cancerosas [21], [32]. Também, nós relatado anteriormente que YY1 eo histona deacetilase 4 (HDAC4) afetou o crescimento de células de câncer de próstata reprimindo
HOXB13
transcrição através da modificação da histona [11]. Estes dados disponíveis nos intrigou a especular que EZH2 pode ser capaz de recrutar DNMT3B para
HOXB13
promotor para reprimir a sua expressão através de determinadas modificações epigenéticas.
O objetivo deste estudo foi o de elucidar os mecanismos que estão envolvidos na inibição da proliferação em AR
– células de cancro da próstata desencadeadas pelo ATRA. Os nossos resultados mostraram que o ATRA inibiu o crescimento de células cancerosas da próstata DU145 através upregulating
HOXB13
expressão através da redução do seu nível de metilação. Isto foi conseguido pelo ATRA para prejudicar a acção de EZH2 e DNMT3B, que são responsáveis pela metilação de
HOXB13
promotor. Dados desvendados a partir deste estudo pode fornecer pistas úteis para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para a AR
– câncer de próstata que envolvem o uso de ATRA e modificadores epigenéticos
Resultados
HOXB13 estava envolvido. em induzida por ATRA DU145 de crescimento de células de detenção
ATRA foi relatada como sendo capaz de induzir a paragem do crescimento celular, mas o mecanismo não é completamente claro. A sobre-expressão de HOXB13 em AR
– células de cancro da próstata pode também resultar numa inibição significativa do crescimento celular. Para esclarecer se HOXB13 desempenha um papel importante na paragem do crescimento induzida pelo ATRA em células de cancro da próstata, primeiro testado a taxa de sobrevivência celular relativa sobre o tratamento de ATRA. células DU145 foram expostos a concentrações crescentes de ATRA (de 20 a 120 ^ M) durante 24, 48 e 72 h. Como evidenciado na Fig. 1A e 1B, ATRA, de facto induziu a paragem do crescimento celular em células DU145 de uma forma dependente da dose. Alta citotoxicidade foi observada às 72 horas. Entretanto, tanto HOXB13 ARNm e os níveis de proteína foram elevados em células DU145 após tratamento com ATRA (Fig. 1C). Verificou-se ainda mais o efeito da ATRA na outra AR
– linha de células do cancro da próstata PC-3, e observou-se o efeito dependente da dose semelhante de ATRA na paragem do crescimento de células, como reveladas por ensaios de MTT (Fig S1.). Entretanto, tanto HOXB13 mRNA e os níveis de proteína também foram elevados após tratamento ATRA (Fig. S2).
(A) efeito dose-dependente de ATRA na parada do crescimento celular DU145. células DU145 foram tratados com várias concentrações de ATRA durante 72 h. *
P Art 0,05, **
P Art 0,01 (n = 6). (B) Curso de tempo do efeito de paragem do crescimento do ATRA em células DU145. *
P Art 0,05, **
P Art 0,01 (n = 6). (C) ATRA HOXB13 expressão aumentada nas células DU145. células DU145 foram tratados com 80 ^ M de ATRA durante 72 h. O ARN total foi extraído para RT-PCR (
uppe
R), e os lisados de células inteiras foi preparado por western blotting (
inferior). (D) A prisão crescimento celular DU145 induzida por ATRA foi parcialmente revertida pela supressão da expressão HOXB13. O crescimento celular potente foi medida por ensaios MTT. *
P Art 0,05, **
P Art 0,01 (n = 6)
Em seguida, para testar o papel de HOXB13 em ATRA-. o crescimento de células DU145 mediada prisão, que transitoriamente transfectadas
HOXB13
plasmídeo siRNA em células DU145 tratados com ATRA. A construção e eficiência interferência do HOXB13 siRNA foram descritos no nosso relatório anterior [11]. Descobrimos que knockdown de HOXB13 por siRNA aparentemente inverteu a parada do crescimento celular induzida por ATRA (Fig. 1D). Isto implicou que a prisão crescimento celular DU145 induzida por ATRA foi associado, pelo menos em parte, com a expressão de HOXB13.
DNMT3B Participou HOXB13 transcricional repressão
HOXB13
gene é silenciado na AR
– células de câncer de próstata e superexpressão de HOXB13 na AR
– células de câncer de próstata resultou em significativa inibição do crescimento celular [10]. Em seguida, investigou os eventos moleculares que estão envolvidos no
HOXB13
silenciamento de genes na AR
– células cancerosas da próstata. O promotor de
HOXB13
tem sido freqüentemente relatado para ser hipermetilado em vários tipos de câncer [33]. Para esclarecer se o silenciamento de
gene HOXB13
é mediada por hipermetilação DNA na AR
– células de câncer de próstata, que avaliou o estado de metilação do
HOXB13
promotor usando a PCR-seqüenciamento bissulfito (BSP), e descobrimos que os
HOXB13
promotor foi mais intensamente metilado em células DU145 em comparação com o que nas células LNCaP malignas inferiores (Fig. 2A, B).
ensaios BSP mostrou a metilação de ilhas CpG no promotor HOXB13 em células DU145 altamente malignas (a) e em células LNCaP malignas inferiores (B). (C) HOXB13 foi regulada positivamente em células DU145 transfectadas com o plasmídeo DNMT3B siRNA, em comparação com as células transfectadas com vector de controlo de siRNA. (D) ensaios BSP mostrou o nível de metilação reduzida do promotor HOXB13 em células DU145 transfectadas com DNMT3B siRNA (
menor
), em comparação com o controle siRNA (
superior
).
uma vez que o DNA metiltransferase DNMT3B desempenha um papel importante na metilação de genes relacionados com o cancro, e
HOXB13
foi relatado como sendo um gene alvo de DNMT3B nos tumores colorectais primários [26], [27], nós especularam que DNMT3B também podem estar envolvidos no
HOXB13
transcricional repressão em células DU145. Para verificar esta hipótese, nós derrubado a expressão DNMT3B com um siRNA específico, e descobrimos que a expressão HOXB13 aparentemente foi aumentada em células DU145 e da eficiência interferência do DNMT3B siRNA foi mostrado (Fig. 2C). Os resultados de ensaios de BSP mostraram que o nível de metilação de
HOXB13
promotor em DU145 foi reduzida após o knockdown de DNMT3B endógeno (Fig. 2D, inferior), em comparação com as células de controlo (Fig. 2D superior). Estes resultados sugerem que a modificação de metilação do DNA mediada por DNMT3B foi responsável pelo silenciamento de
HOXB13
em células DU145.
O PCG Proteínas EZH2 e BMI1 Participou HOXB13 transcricional repressão
em seguida, destina-se a determinar o fator (s) de transcrição que podem participar na regulação da
HOXB13
. As proteínas PCG têm sido relatados para desempenhar um papel na progressão de cancros da próstata e da mama, bem como no silenciamento de
HOXs
[3], [21], [34], [35]. Nós primeiro determinado que expressões de proteínas PCG EZH2 e BMI1 foram significativamente maiores nas células DU145 altamente malignas do que em células LNCaP malignas humildes, e suas expressões foram negativamente correlacionadas com a expressão HOXB13, como revelado por RT-PCR e western blot (Fig. 3A, B).
O mRNA (A) e proteína (B) níveis de BMI1, EZH2 e HOXB13 em diferentes células cancerosas tumor maligno da próstata, LNCap e DU145. (C) Os níveis de ARNm de HOXB13 EZH2 e em células transfectadas com o plasmídeo DU145 EZH2 siARN. (D) Os níveis de ARNm de HOXB13 BMI1 e em células transfectadas com o plasmídeo DU145 BMI1 siARN. (E) Os níveis de proteína de HOXB13 e EZH2 em células DU145 transfectadas com plasmídeo EZH2 siRNA. (F) Os níveis de proteína de HOXB13 e BMI1 em células DU145 transfectadas com plasmídeo BMI1 siRNA.
Para esclarecer melhor se EZH2 e BMI1 participou
HOXB13
transcricional repressão no cancro da próstata DU145 células, construiu-se EZH2 e siRNA BMI1 siRNA plasmídeos e transfectadas las em células DU145, respectivamente. Detectamos que tanto mRNA HOXB13 (Fig. 3C, E) e proteína (Fig. 3D, F) níveis foram upregulated quando EZH2 e BMI1 foram derrubados. As eficiências inibidoras destes plasmídeos de ARNip em EZH2 endógena e BMI1 em ARNm e os níveis de proteína foram visualizados (Fig.3C, D e E, F). Estes resultados indicaram que EZH2 e BMI1 pode reprimir a expressão HOXB13 mediando a modificação das histonas metilação.
DNMT3B foi recrutado para HOXB13 Promotor de EZH2
Como co-repressores de transcrição, DNMTs não possuem canônica domínios e eles são geralmente recrutados para as regiões de cromatina específicos por factores de transcrição [26], [30] de ligação a DNA-. Significativamente, EZH2 tem sido relatada a desempenhar um papel chave na mediação de ambos metilação das histonas e metilação do DNA de
gene HOXB13
em algumas células cancerosas [21], [32]. Em seguida, queria determinar se EZH2 recruta DNMT3B para
HOXB13
promotor. Realizamos ensaios chip para detectar alterações na associação de EZH2 nas três regiões definidas (P1-P3) do
HOXB13
promotor sobre o knockdown de EZH2 endógeno. A região de P4 muito a montante foi escolhido como um controlo negativo (Fig. 4A). Os resultados ChIP demonstrou que a abundância de EZH2 em P1-P3 de
HOXB13
promotor foi reduzida quando EZH2 endógeno foi suprimida por
EZH2
siRNA em células DU145. Ao mesmo tempo, o nível H3K27me3 associada com a função EZH2 em P1-P3 foi aparentemente reduzida (Fig. 4B).
(A) Diagrama da região 5′-fl anking do gene HOXB13. P1, P2 e P3 representam as três regiões promotoras do gene HOXB13 analisados em ensaios de chip, e P4 é um controlo negativo distal. Os ensaios (B) chip em células DU145 transfectadas com ARNsi EZH2 e imunoprecipitadas com anticorpo anti-EZH2 e anticorpo anti-H3K27me3, respectivamente. ensaios (C) CoIP para detectar a associação de DNMT3B com EZH2 em células DU145. extractos nucleares das células foram preparados e precipitados com anti-EZH2 ou anticorpo anti-DNMT3B, e detectada por imunotransferência com anti-DNMT3B ou anticorpo anti-EZH2. (D) ChIP ensaios foram realizados em células DU145 transfectadas com ARNsi EZH2 e o ADN foi imunoprecipitada com anticorpo anti-DNMT3B. As quantidades de ADN precipitado foi determinada por PCR.
Além disso, os ensaios com extractos de células CoIP DU145 revelou que os complexos foram imunoprecipitados por anticorpos anti-anti-EZH2 ou DNMT3B, e pode ser detectada em imunotransferência por anti -EZH2 anticorpos ou anti-DNMT3B, respectivamente (Fig. 4C), sugerindo que DNMT3B EZH2 e estavam presentes no mesmo complexo. Nossos dados do chip na Fig. 4D indicaram ainda que a abundância de DNMT3B as três regiões do promotor (P1-P3) foi reduzida sobre o knockdown de EZH2 endógena. Assim, estes resultados forneceram evidências de que DNMT3B foi recrutado para
HOXB13
promotor de EZH2.
ATRA prejudicada EZH2 e DNMT3B Expressão e enfraqueceu suas interações com HOXB13 Promotor
Nós demonstramos acima desse HOXB13 foi regulada negativamente por EZH2 e DNMT3B e tratamento ATRA resultou em um aumento no
expressão HOXB13
em células DU145. Para verificar a hipótese de que o ATRA pode facilitar a expressão HOXB13 através prejudicando os efeitos reguladores negativos de EZH2 e DNMT3B em HOXB13, examinámos a expressão de EZH2 e DNMT3B em células DU145 tratados com 80 ^ M de ATRA, e 5-aza-2′-desoxicitidina (5 -aza-DC) foi utilizado como o controlo de desmetilação. Os resultados mostraram que as expressões, tanto de EZH2 e DNMT3B foram regulados negativamente por tratamento com ATRA em ambos os níveis de proteína e ARNm (Fig. 5A, B). Resultados semelhantes foram obtidos a partir de um estudo paralelo usando outro AR
-. linha de células de cancro da próstata maligna PC-3 (Fig. S2)
O tratamento de 80? M de ATRA regulada HOXB13 e reprimidos expressões EZH2 e DNMT3B em nível de ARNm de (a) e o nível de proteína (B) em células DU145. 5-aza-cc foi usada como um controlo positivo desmetilação. Controle 1 era etanol absoluto isopícnica e controlo 2 era ácido acético isopícnica (C) ATRA prejudicado as ligações de EZH2 e DNMT3B, e reduziu o nível H3K27me3 pelo promotor HOXB13. ChIP ensaios foram realizados em células DU145 tratados com 80 ^ M de ATRA e imunoprecipitados com anticorpo anti-H3K27me3, anti-DNMT3B ou anticorpo anti-EZH2. As quantidades de ADN precipitado promotor endógeno HOXB13 foram determinadas por PCR. (D) ensaios BSP mostrou a metilação reduzida do promotor HOXB13 em células DU145 após o tratamento após 80 mM ATRA, em comparação com o controlo não tratado.
Nossos ensaios ChIP ainda demonstrado que as ligações de EZH2 endógeno e DNMT3B em
HOXB13
promotor foi reduzida após o tratamento ATRA, e, entretanto, os níveis H3K27me3 em regiões P1-P3 foram aparentemente diminuiu (Fig. 5C).
Além disso, os ensaios BSP revelou que o tratamento com ATRA resultou na redução do nível de metilação de ilhas CpG em
HOXB13
promotor em contraste com a de células DU145 não tratados (Fig. 5D). Aparentemente, EZH2 recrutados DNMT3B para
HOXB13
promotor e provocou o silêncio gene induzindo a H3K27me3 e pelo aumento da metilação de ilhas CpG. Entretanto, tanto a metilação de DNA e H3K27me3 de
HOXB13
promotor poderia ser reduzido em ATRA.
Discussão
ATRA desempenha um papel essencial no desenvolvimento regulando vários processos celulares e tem sido amplamente investigados em ensaios pré-clínicos e clínicos como um agente para o tratamento de muitos tipos de cancro, incluindo o cancro gástrico precoce e cancro da próstata [16], [17]. Além disso, foi demonstrado que HOXB13 desempenhar um papel na paragem do crescimento em AR
– próstata [10], cancro colorrectal [26] e carcinoma de células renais [29]. De acordo com estes dados anteriores, os resultados deste estudo demonstraram que o ATRA foi capaz de induzir a paragem do crescimento de duas AR
– (. A Fig. 1A e Fig S1) células de cancro da próstata DU145 e PC-3 de um modo dependente da dose e este efeito foi parcialmente alcançado através da promoção de mRNA HOXB13 e produção de proteína (Fig. 1C e S2, S3). Contrariamente, um relatório recente descreve que knockdown de HOXB13 endógeno pela interferência de ARN de linhas celulares de cancro do ovário humano foi associada com a proliferação celular reduzida [36]. Estas descrições contraditórias podem ser o resultado da diferença aparente entre os órgãos de ovário e outros, uma vez que HOXB13 é não expresso em células de ovário normal, [36], ao passo que é expresso a um nível elevado em próstata normal e rim [5], [29]. No entanto, os dados apresentados neste relatório fornecem evidência que o tratamento com ATRA inibiu o crescimento de células cancerosas da próstata DU145, através de um mecanismo que envolve a regulação positiva de HOXB13 através da redução do nível de metilação do promotor no gene.
a metilação do DNA e é catalisada mantido pelo DNMTs. Certos DNMTs, expressos em níveis relativamente baixos em células somáticas, são frequentemente regulada em células cancerosas. Ganho de função estudos mostraram que DNMT3B mas não DNMT3a promovido cólon tumorigênese em APC
Min /+ camundongos induzindo
de novo
metilação de vários genes que abrigam ilhas CpG [26]. Também houve indicação de que a depleção de DNMT3B resultou num aumento da taxa de apoptose reduzida e migração de células de cancro da próstata PC-3 [37]. Neste estudo, mostraram que a expressão HOXB13 foi silenciada em DU145 (Fig. S4), e ensaios de BSP revelou que o silêncio pode estar relacionada com a hipermetilação do promotor do gene (Fig. 2A). Foi relatado que
gene HOXB13
foi alvo de DNMT3B em células cancerígenas do cólon [26]. Por isso, torna-se importante compreender a função da DNMT3B no silenciamento de
gene HOXB13
em células de câncer de próstata DU145. Nossos resultados demonstraram que DNMT3B poderia regular
HOXB13
transcrição através da alteração da modificação metilação do DNA no promotor do gene, embora knockdown de DNMT3B não reduziu a metilação de CpG em
HOXB13
promotor como esperado (Fig. 2C e D). Aparentemente, podem existir outros mecanismos subjacentes ao
HOXB13
repressão DNMT3B mediada.
Em particular, normal e padrões de metilação aberrante pode ser mediada por proteínas da cromatina orientadores metiltransferases de DNA para seus genes-alvo [38] . Mais recentemente, a proteína EZH2 PCG foi relatado para recrutar metiltransferases de ADN, especialmente DNMT1 e DNMT3B, para implementar o silenciamento da
MYT1
e
Wnt1
loci através da metilação do DNA [21], [32 ]. A sobre-expressão de EZH2 ocorre geralmente num diverso de doenças malignas, incluindo os cancros da próstata, mama e do fígado, particularmente em casos avançados [39]. Varambally
et al [40] concluíram que a expressão desregulada de EZH2 pode ser uma causa da progressão do cancro da próstata, bem como sendo um marcador que distingue o cancro da próstata indolente daqueles em risco de progressão letal. Nossos resultados sugerem que PCGs participou no desenvolvimento do câncer de próstata. Nós mostramos que a expressão de EZH2 e BMI1 foi muito mais elevado nas células DU145 do que em células LNCaP (Fig. 3A, B). Mais interessante, descobrimos que PCGs suprimida a expressão HOXB13 em células DU145. RT-PCR e ensaios de transferência Western mostrou que a expressão foi regulada positivamente quando HOXB13 EZH2 e BMI1 foram derrubados (Fig. 3C, D, E e F). Além disso, os ensaios revelaram que ChIP EZH2 era capaz de se ligar directamente para o
HOXB13
promotor (Fig. 4B), e isto pode ser um mecanismo de silenciamento de
HOXB13
no cancro da próstata maligna DU145 células.
tem sido proposto que a EZH2 reprime a transcrição de genes alvo, principalmente através de dois mecanismos diferentes. O primeiro envolve a ligação de EZH2 para o promotor do gene alvo para induzir a modificação H3K27me3, diminuindo assim a actividade do promotor [39], [41]. O segundo mecanismo sugere que EZH2 recruta um co-repressor ou complexos, tais como DNMT1 e DNMT3B, para o promotor e o referido co-repressor quer negativamente afecta outros factores que estão presentes, ou altera a estrutura da cromatina local para facilitar a repressão [30], [35]. Aparentemente, os resultados deste estudo estão em acordo geral com ambos os dois modelos. Especificamente, os nossos dados demonstram que EZH2 foi capaz de se ligar diretamente para o
HOXB13
promotor para induzir a modificação H3K27me3 (Fig. 4B). Enquanto isso, os nossos dados também sugeriram que a EZH2 pode recrutar DNMT3B
HOXB13
promotor para afectar o estado de metilação do promotor e, portanto, reprimir a transcrição de gene (Fig. 4C, D). Estes resultados fornecem evidências adicionais de uma interferência entre os dois mecanismos distintos epigenética em silêncio do gene.
ATRA é normalmente utilizado em combinação com outras drogas, tais como o docetaxel, o TSA e o ácido zoledrónico na terapia do cancro da próstata [18], [42], [43], mas o mecanismo molecular de acção ATRA não é clara. O fato de que EZH2 recruta DNMT3B ao
HOXB13
promotor para reprimir a expressão do gene, e que o tratamento com ATRA resulta na regulação positiva da expressão HOXB13, intrigou-nos a propor uma hipótese que ATRA poderia upregulate HOXB13 pela diminuição da nível de metilação do gene induzida por EZH2 e DNMT3B. Os resultados deste estudo validou que as expressões de
EZH2 e
DNMT3B
diminuíram após o tratamento com ATRA em ambos DU145 e PC-3 linhas de células (Fig.5a, B e A Fig. S2, S3 ). Além disso, as ligações de EZH2 e DNMT3B para o
HOXB13
promotor e o nível H3K27me3 em que foram reduzidos em células DU145 tratados com ATRA (Fig. 5C). Curiosamente, os ensaios BSP revelou que o nível de metilação do DNA do
HOXB13
promotor também foi diminuída em células DU145 após tratamento ATRA (Fig. 5D).
Há três
RAR
genes, ou seja,
RARa, β
e
γ
em células, e todos eles são necessários para a função ATRA. Desde
RARp
é silenciada em células DU145, a sensibilidade das células DU145 a ATRA é menor do que a de células LNCaP [44]. Entretanto, também examinou o efeito da ATRA em células 293 e 293T, as duas linhas de células de rim embrionárias humanas normais. Como esperado, a sensibilidade destas células para o ATRA foi maior do que em células DU145 (Fig. S5a). Visivelmente, o tratamento da AR
– células de câncer de próstata com ATRA não alterou as expressões de HOXB13, EZH2 e DNMT3B a nível mRNA (Fig S5B.), Implicando um mecanismo de ação diferente ATRA neste fundo da célula particular. Presumivelmente, as modificações epigenéticas mediadas por ATRA descrita neste relatório pode, provavelmente, ser restrito a certos tipos de células cancerígenas, como AR
– células cancerosas da próstata, uma vez que não houve relatos de modificações epigenéticas ATRA mediadas em células normais até à data. Da mesma forma, as células malignas e drogas resistentes PC-3 exibiu uma sensibilidade ainda maior para ATRA do que as células DU145 (Fig. S1).
Um relatório anterior desvendados que reduzida expressão DNMT3B resultou em hipometilação do
retinoblastoma (Rb)
,
RARp
, e
polipose adenomatosa coli (APC)
promotores de genes [37]. Presumivelmente, a regulação negativa de DNMT3B pode, em parte potenciar a sensibilidade de células DU145 a ATRA, e este pode estabelecer uma interacção positiva entre o tratamento com ATRA e a regulação negativa da DNMT3B para facilitar a expressão HOXB13, e consequentemente para induzir a paragem do crescimento de células DU145. Neste estudo, descobrimos que ATRA foi capaz de regular positivamente a expressão de HOXB13 e induzir células DU145 parada do crescimento como resultado do nível de metilação reduzida de
HOXB13
. Isto levanta uma questão de saber se um efeito sinérgico entre inibidores de ATRA e DNMTs, por exemplo, 5-aza-dc, existe. Os resultados do nosso MTT e experiências de PCR em tempo real apoiaram esta hipótese, uma vez que o tratamento simultâneo de ambos ATRA e 5-aza-DC exibiu um efeito inibidor muito mais forte para células DU145 do que cada um dos dois fármacos por si só (Fig. S6). Enquanto isso, a expressão de HOXB13 foi regulada positivamente, mas ambos EZH2 e DNMT3B foram reprimidos acentuadamente após o tratamento dos dois fármacos (Fig. S7).
No total, os dados apresentados neste relatório apoiam um modelo de trabalho em que HOXB13 , EZH2 e DNMT3B estão envolvidos na paragem do crescimento celular induzida pelo ATRA em células DU145 (Fig. 6). Especificamente, o ATRA inibe a proliferação de células cancerosas da próstata DU145 através da redução do nível de metilação de
HOXB13
promotor induzido por EZH2 e DNMT3B. Perspectivamente, os dados resultantes deste estudo podem fornecer pistas úteis para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para a AR
-. Câncer de próstata que envolvem o uso de ATRA e modificadores epigenéticos
EZH2 se liga directamente para o promotor HOXB13 e induz trimethylation de H3K27 para reprimir a expressão HOXB13. DNMT3B é recrutado para o promotor HOXB13 por EZH2 para induzir a hipermetilação do ADN, resultando na repressão do gene. Enquanto isso, o ATRA reprime a expressão EZH2 e DNMT3B, e prejudica a sua ligação ao promotor HOXB13 para diminuir o nível de metilação do promotor de HOXB13, resultando na activação de HOXB13, que por sua vez inibe o crescimento de células DU145. Além disso, a repressão de DNMT3B também regula positivamente o
RARp
expressão, que pode aumentar a sensibilidade das células DU145 a ATRA. Um tratamento combinado de ambos ATRA e 5-aza-dc traz efeitos reforçada em HOXB13 regulação positiva e a inibição do crescimento de células DU145.
Materiais e Métodos
Cultura de Células e reagentes
DU145, PC-3, LNCap, 293 e 293T células foram adquiridos a partir do Instituto de Biologia celular (Xangai, China).