Abstract

células cancerosas cervicais apresentam uma maior exigência para a degradação de proteínas dependente de ubiquitina associado a uma taxa de rotatividade metabólica elevada . A ubiquitina, que é uma proteína pequena, altamente conservado expressa em todas as células eucariotas, podem ser covalentemente ligados a certas proteínas alvo para marcá-los para a degradação pelo sistema ubiquitina-proteassoma. Estudos anteriores destacar o papel essencial da ubiquitina B (UBB) e degradação de proteínas proteossómica UBB-dependente na inibidor da histona deacetilase (HDACi) seletividade do tumor induzida. Nossa hipótese é que UBB desempenha um papel crítico na função de células-tronco do câncer do colo do útero. Medimos os níveis endógenos UBB em mammospheres

in vitro

por PCR em tempo real e Western blot. A função de Ubb em células do cancro da haste-como foi avaliada após knockdown de expressão em Ubb prolongados células HeLa Tricostatina A-seleccionados (HeLa /TSA), medindo

In vitro

proliferação celular, apoptose celular, invasão e quimioterapia resistência, bem como através da medição

in vivo crescimento

num modelo ortotópico de câncer cervical. Nós também avaliou a frequência de haste do cancro de células, tumorsphere formação, e

in vivo

crescimento de xenoenxertos de cancro cervical humanos após UBB silenciamento. Descobrimos que HeLa /TSA eram resistentes à quimioterapia, altamente expressa o gene UBB e os marcadores de células-tronco Sox2, Oct4 e Nanog. Estas células também mostrou habilidades de diferenciação induzidas, incluindo capacidades de migração /invasão /malignidade aprimorados

in vitro

e

in vivo

. Além disso, uma expressão elevada de Ubb foi mostrado nas amostras de tumor de pacientes de quimioterapia. O silenciamento de Ubb inibida tumorsphere formação, reduzido a expressão de marcadores de células estaminais e diminuição do crescimento do xenoenxerto do colo do útero. Os nossos resultados demonstram que Ubb foi significativamente aumentada em células HeLa Tricostatina A-seleccionados prolongados e que desempenhou um papel fundamental na manutenção do cancro cervical células estaminais semelhante.

Citation: Tian Y, Ding W, Wang Y, Ji T, Sun S, Mo Q, et al. (2013) ubiquitina B em Câncer Cervical: Critical para a Manutenção de caracteres de células estaminais-como o câncer. PLoS ONE 8 (12): e84457. doi: 10.1371 /journal.pone.0084457

editor: Aamir Ahmad, Faculdade de Medicina da Wayne State University, Estados Unidos da América

Recebido: 19 Agosto, 2013; Aceito: 22 de novembro de 2013; Publicação: 18 de dezembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Tian et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela National Science Foundation da China (No. 81372806; 81101962; 81101965; 81202060). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer cervical é o segundo câncer mais comum entre as mulheres com menos de 65 anos de idade e a causa mais frequente de morte por câncer ginecológico em todo o mundo. O risco de uma mulher de desenvolver cancro do colo do útero por 65 anos de faixas etárias a partir de 0,69% em países desenvolvidos para 1,38% nos países em desenvolvimento. Em 2010, cerca de 75, 000 novos casos de cancro do colo do útero foram diagnosticados na China [1,2]. Atualmente, cerca de 35% das mulheres diagnosticadas com câncer cervical tem doença recorrente, com 90% destes encontrados dentro de 3 anos após o tratamento inicial [3]. Devido à resistência e também a resistência a múltiplas drogas para a radioterapia, a métodos convencionais não será eficaz para os casos recorrentes. Melhoradas terapias direcionadas e /estratégias de rádio de sensibilização quimio são essenciais para reduzir a mortalidade desta doença maligna devastador.

A identificação de câncer de células estaminais-como em tumores sólidos abre novas abordagens para a quimioterapia; uma melhor compreensão dos mecanismos subjacentes à carcinogénese e as propriedades de resistência ao tratamento de cancro de células estaminais-como é necessário. Nos últimos anos, evidências acumuladas sugerem que o potencial de dar início a um tumor, incluindo o carcinoma do colo do útero, é uma característica bastante singular de um pequeno subconjunto de células estaminais do tipo chamado “células cancerosas estaminais” (CSCs) ou “de iniciação do tumor células “. CSCs têm a capacidade exclusivo de auto-renovação, expandindo assim o conjunto de CSCs e permitindo que o tumor a diferenciar-se em cancro do heterogénea não tumorigénico [4]. A hipótese CSCs tem implicações clínicas emocionantes no cancro do colo do útero: poderia explicar a falha terapêutica e recidiva da doença, como resultado da resistência dos CSCs a estímulos de morte. Com efeito, ao manter as características biológicas das células estaminais de tecidos, tais como a quiescência, auto-renovação e resistência a múltiplas drogas, CSCs constituem uma população de células de tumor refractário intrínseca que é resistente a terapias desenvolvidas para erradicar rapidamente células em divisão. Portanto, a identificação e caracterização de CSCs são fundamentais para o prognóstico e tratamento do carcinoma cervical [5].

Em um estudo anterior, foi realizada a SMART para identificar os genes principais responsáveis ​​pela ação tumor-seletiva de Trichostatin A ( TSA), um dos mais extensivamente estudados HDACis. Foram identificados Ubiquitina B (Ubb), que pode ligar covalentemente a determinadas proteínas alvo marcando-os para a degradação pelo sistema ubiquitina-proteassoma (UPS), como um mediador de apoptose de células de cancro induzido pelo TSA. Perda da função do gene UBB conferido a resistência mais forte ao tratamento TSA [6].

A nossa primeira descoberta neste estudo foi que as células que sobreviveram triagem TSA tem algumas propriedades de CSCs. Para confirmar as características dessas células-tronco do câncer-like, foram isoladas células formadoras de esfera (SFC) pela triagem linhas celulares de cancro do colo do útero. Caracterização destes SFCs foi definido por características CSC-like, incluindo tumorigenicidade maior do que as células HeLa progenitoras; expressão elevada de Sox2, Oct4 e Nanog; e resistência multi-droga. A expressão de UBB nestas células estaminais-como foi examinada em pesquisas futuras. Descobrimos que a manutenção de câncer características estaminais-como correlacionada com a expressão UBB, e silenciar a expressão UBB poderia reverter as características de células estaminais câncer.

Materiais e Métodos

Declaração de Ética

Vinte e dois pacientes que diagnosticados carcinoma de células escamosas do colo do útero e se submeteram à cirurgia primária directamente ou após quimioterapia à base de cisplatina regulares recebidos foram escolhidas para participar neste estudo e todos os pacientes forneceram consentimento informado por escrito. As amostras de tecido pós-operatórias foram coletadas pelo Departamento de Patologia Clínica, Hospital Tongji, Tongji Medical College, Huazhong Universidade de Ciência e Tecnologia (HUST). Informações sobre diagnóstico histopatológico foi revisto por pelo menos dois especialistas em patologia ginecológica. Este estudo foi analisado e aprovado pelo Comitê de Ética da Tongji Hospital, Tongji Medical College, HUST.

Xenoenxerto estudo tumor

Estas experiências foram realizadas com não obesos do sexo feminino de 6 a 8 semanas de idade diabética (/SCID NOD) ratinhos /grave combinada imuno-deficiente comprado de HFK (Beijing) e alojados no Centro Experimental animal, Tongji Medical College, HUST. Os ratinhos foram seleccionados aleatoriamente em cada grupo; um total de seis ratinhos por grupo foram utilizados e alojados em três por gaiola. células HeLa e células HeLa /TSA foram tripsinizadas, contadas e re-suspendido em 100 ul de PBS de Dulbecco e depois injectado por via subcutânea. As taxas de crescimento de xenoenxertos foram medidos a cada três dias, e o volume foi calculado utilizando a fórmula: L x W

2 × 0,5. As fotografias de xenoenxertos foram tomadas após os ratinhos receberam uma overdose de anestesia letal de pentobarbital de sódio. Todos os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional Animal do HUST, eo estudo foi realizado em estrita conformidade com a chegar (Pesquisa Animal: Comunicação de

In Vivo

Experiments) orientações [7] {Kilkenny 2012 # 29}.

cultura de células e transfecção

As células HeLa foram obtidas de ATCC e mantidas em nosso laboratório. células HeLa /TSA foram estabelecidos por tratamento de células HeLa com 1 uM Tricostatina A (TSA, Sigma) durante 24 horas e, em seguida, mantendo as células em 200 nM TSA para a outra de 7 a 10 dias. As células sobreviventes foram deixados a recuperar durante mais 4-7 dias. Em seguida, elas foram recolhidas e deixadas proliferar.

O ARNsi (Invitrogen) foram transfectadas utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. Um shRNA lentivírus foi utilizada para infectar as células seguindo o protocolo do fabricante.

exposição UV das células

para irradiação de UV, as células foram semeadas a uma densidade de 2 × 10

5 /ml e cresceu até anexo foi alcançada e um ainda monocamada foi formado. Em seguida, as células foram lavadas duas vezes com PBS pré-aquecido e exposta a radiação UV, enquanto em PBS. luz UV foi gerado a partir de uma lâmpada de UVB 15-W (UVP), que emite a maior parte da energia dentro da gama de UVB, de 280-370 nm, com um pico de emissão a 310 nm. A intensidade da UVB foi normalizada por um medidor de UVB e fixado em 200J /m

2. A seguir à irradiação, foi adicionado meio fresco.

Transwell ensaio de migração

células HeLa e células HeLa /TSA foram semeadas numa câmara de Transwell durante 48 horas. As células que migraram através da membrana foram fixadas e coradas com violeta de cristal a 0,1% e, em seguida, examinadas sob um microscópio de luz.

Identificação de células SP

HeLa e células HeLa /TSA foram tratadas com tripsina e incubadas com 5 ug /ml de Hoechst 33342 corantes (Roche) a 37 ° C durante 90 min; a reacção foi terminada por incubação em água de gelo durante 10 min. As amostras de células coradas foram analisadas por um citómetro de fluxo FACSCalibur (BD) usando uma excitação UV 355 nm; a emissão de fluorescência foram obtidos utilizando um filtro passa-banda de 450 nm para a Hoechst azul e um filtro passa-banda de 670 nm para a Hoechst vermelho. aquisição e análise de dados foram realizados com o software Pro CellQuest (BD).

A formação de colónias, formação mammosphere e limitando ensaios de diluição

HeLa e HeLa /células TSA foram contados e banhado com a mesma densidade em uma placa de 6 poços, durante 7 dias. As células foram lavadas duas vezes com PBS e fixadas com paraformaldeído a 4% durante 10 minutos. Em seguida, as células foram lavadas com água destilada durante 5 minutos, duas vezes e incubadas com uma solução de coloração com violeta de cristal a 0,1% durante 10 minutos. Finalmente, as células foram lavadas com água destilada durante 5 minutos, duas vezes ou até que o corante em excesso foi removido completamente.

formação Mammosphere e ensaios de diluição limitante foram realizados como descrito anteriormente por Calcagno [8] AM. Geralmente, foi realizada nestas experiências em células HeLa e /células TSA HeLa para avaliar mammosphere formação em poços de ultra-baixa cultura de fixação (Costar) em meio DMEM /F12 isento de soro suplementado com factor de crescimento epidérmico humano recombinante (EGF, 10 ng /mL, Peprotech); recombinante do factor de crescimento de fibroblastos básico humano (bFGF, 10 ng /mL, Peprotech); insulina (50 ng /mL, Sigma); B27 (100 unidades /ml, Invitrogen), penicilina (100 unidades /ml, Invitrogen) e estreptomicina (100 ug /mL, Invitrogen). Mammospheres foram identificadas como descrito [9] a cada 3 dias de acordo com a taxa de proliferação de colónias. O ensaio de diluição limitante foi realizada por plaqueamento de vários números de células (500 células a partir de uma única célula) por poço em três placas de 96 cavidades de ligação de ultra-baixas. Os esferóides foram contadas aos 14 dias ou mais, dependendo das taxas de crescimento dos esferóides. Os experimentos foram realizados em triplicado, e as médias calculadas são apresentadas.

isolamento de ARN, transcrição reversa e análise de RT-PCR quantitativo

O ARN total foi isolado utilizando o kit Qiagen RNeasy de acordo com as instruções do fabricante. ARN quantificação foi determinada utilizando um espectrofotómetro NanoDrop micro-volumes (Thermo Fisher), e a integridade do mRNA foi verificada por electroforese em gel de agarose. A transcrição reversa-reacção em cadeia da polimerase (RT-PCR) foi então realizada utilizando 2 ug de ARN total. RT-PCR quantitativa foi realizada num CFX96 toque

TM em tempo real do sistema de detecção de PCR (Bio-Rad), utilizando o seguinte programa de termociclador para todos os genes: 5 min de pré-incubação a 95 ° C seguido de 40 ciclos de 15 s a 95 ° C, 15 s a 60 ° C, e 30 s a 72 ° C. Os iniciadores de todos os genes-alvo e o gene de referência estão listados na Tabela S1. A recolha de dados, incluindo a mudança vezes na expressão do gene, foi determinada a partir da mesma quantidade de ARN total.

análise de transferência de Western

proteínas celulares totais foram extraídas e resolvidas por 10% SDS-PAGE, transferidos para difluoreto de polivinilideno PVDF (PVDF) (350mA membranas durante 1 h), e sondados com anticorpos contra UBB, a UBC, UbA52, UbA80, pSTAT3, Vimentin, pAKT e β-actina (Proteintech Group), MDR-1 e Oct4 (Santa Cruz), Sox2 e Nanog (Millipore). As proteínas foram visualizadas utilizando peroxidase de rábano conjugada anticorpos secundários com SuperSignal West Pico Substrato quimioluminescente (Pierce) e fotografado em XRS ChemiDoc ™ + do sistema com software da imagem Lab ™ (Bio-Rad).

Imunofluorescência de mammospheres

Mammospheres foram recolhidas após aproximadamente 14 dias, dependendo da taxa de crescimento e de tamanho, e, em seguida, lavada duas vezes com PBS e centrifugadas a 300 g. Os mammospheres foram re-suspensas com o composto de temperatura de corte óptima (O.C.T., Sakura) e colocado em azoto líquido. esferóides congelados foram então cortadas em secções de 5 um de espessura. Imunofluorescência destas secções congeladas foi realizada de acordo com o protocolo do fabricante do anticorpo primário. imagens de fluorescência foi realizada utilizando um microscópio confocal de varrimento laser.

A citometria de fluxo

células HeLa e células HeLa /TSA foram tratadas durante 48 horas com 1 uM de TSA, DDP 30 uM (Sigma, P4393), ou 75 nM ou paclitaxol foram irradiados com UVB. Em seguida, as células foram tratadas com tripsina e incubaram-se com Anexina V-FITC e PI de acordo com o protocolo do fabricante. A percentagem de apoptose foi determinada utilizando BD FACSCalibur citometria de fluxo e software CellQuest Pro (BD).

Métodos Estatísticos

A significância estatística foi determinada pelo teste t de Student não pareado usando o software GraphPad Prism (versão 5.01) , excepto para a comparação da expressão Ubb em amostras de tecido de cancro do colo do útero clínicos, a qual foi analisada através do teste ANOVA de duas vias. Significância para todos os testes foi fixado em

p

. 0,05

Resultados

células HeLa /TSA HDACi-selecionados prolongada foram resistentes à quimioterapia

A incubação de células HeLa com TSA (500 nM) em diferentes pontos temporais (6, 12, 18 e 24 horas) induziu um aumento dependente do tempo nos níveis de ARNm de proteína Ubb e ubiquitina (Figura 1a), enquanto que as expressões dos outros três ubiquitina genes que codificam (UbA52, UbA80 e UBC) não foram afetados. De igual modo, a incubação com diferentes concentrações (200, 400, 600 e 800 nm) de TSA durante 24 horas, também resultou num aumento da expressão do gene Ubb, enquanto nenhuma alteração da expressão dos outros três genes codificadores de ubiquitina foram observadas. TSA administração, dentro de um determinado intervalo de concentrações, durante 24 horas, levou a uma estimulação dependente da concentração específica de ARNm e a expressão da proteína Ubb (Figura 1B).

a, células HeLa foram tratadas com 500 nM TSA para a indicada vezes e submetida a análise do nível de ARNm de Ubb, UBC, UbA52 e UbA80 por PCR em tempo real e o nível de proteína correspondente por transferência de western. B, células HeLa foram incubadas com TSA durante 24 horas a uma dose variando de 200 a 800 nm, e submetido a análise do nível de ARNm de Ubb, UbC, UbA52 e UbA80 por PCR em tempo real e o nível de proteína correspondente por transferência de Western. C, painel superior: pratos representativos da formação de colónias de ensaio no dia 7, 10 e 14. O painel inferior: número de colónias formadas em células HeLa e HeLa /TSA no dia 7, 10 e 14. As colunas representam a média de três experiências separadas ; barras de erro, SD; *,

p Art 0,05. células D, HeLa /TSA foram tratados com TSA (1 uM), DDP (30 uM), e a PTX (75 nM) durante 48 h ou UV, as células de apoptose foram quantificados por anexina V /coloração de PI e a citometria de fluxo. Os exemplos representativos da citometria de fluxo resultados foram mostrados. E, as células foram tratadas como descrito em D, as percentagens médias de células de apoptose foram relatados nos gráficos. Valores, porcentagens médias; barras de erro, SD; *,

p Art 0,05 (n = 3 repetições).

até que a maioria das células HeLa sofreram apoptose após o tratamento com TSA (1 uM durante 24 horas e mantidos com 200 nM durante 7 a 10 dias), as células sobreviventes (HeLa /TSA) foram semeadas para formar clones. Depois de outros 10 a 14 dias de crescimento, coloração com cristal violeta mostrou que as células HeLa /TSA tinha uma capacidade proliferativa significativa em comparação com as células de controlo correspondentes. O número de colónias de células HeLa /TSA era aproximadamente 16 vezes mais do que o do controlo no dia 14 (

P

0,01) (Figura 1C).

Para examinar ainda mais a sensibilidade das células HeLa /TSA TSA, nós tratados HeLa /células TSA com TSA e outros agentes comum de quimioterapia. Tal como mostrado nos resultados de FACS, as células HeLa /TSA demonstrou uma resistência notável não só TSA (média de 9,48% vs 25,53%,

P

= 0,014), mas também cisplatina (DDP) (média de 13,25% vs. 53,76%,

p Art 0,01), paclitaxol (PTX) (média de 8,69% contra 35,36%,

p Art 0,01), e até mesmo a luz ultravioleta (UV) (média 15,38 % vs. 44,8%,

p Art 0,01) (Figura 1D, e). Estes resultados sugerem que as células HeLa /TSA pode conter um subconjunto enriquecida de células resistentes a agentes de quimioterapia comum, mesmo UV.

HeLa /células TSA exibiu um up-regulação da expressão UBB e aumento mammosphere formação

para investigar ainda mais a resistência de células HeLa /TSA à quimioterapia e à radiação UV foi relacionada com a expressão de Ubb, a expressão de ARNm em células HeLa /células TSA foi avaliada. Observou-se um aumento significativo de Ubb em células HeLa /TSA, enquanto nenhuma alteração aparente dos outros três genes de ubiquitina (Figura 2A). Da mesma forma, também encontramos um aumento significativo no nível de proteína de UBB, não os outros três genes codificadores de ubiquitina. Além disso, também descobrimos-regulação de pSTAT3, vimentina e MDR-1, juntamente com a sub-regulação de pAKT em células HeLa /TSA, quando comparado com as células HeLa parentais (Figura 2B). Estes dados indicaram que as células HeLa /TSA foram quimio-resistentes e que pode estar relacionada com a expressão elevada de Ubb. Além disso, a maioria das células HeLa /TSA eram num estado indiferenciado, e a transição epitelial-mesenquimal submetidos (EMT). Os resultados aqui apresentados são consistentes com nossos resultados anteriores, que indicavam que UBB é um mediador essencial da morte tumor-seletiva induzida por TSA [6].

A, foram analisadas as células HeLa /TSA para UBB, a UBC, UbA52 e mRNA UbA80 níveis. As colunas representam a média de três experiências separadas; barras de erro, SD; *,

p Art 0,05. B, células HeLa /TSA foram analisadas para os níveis de proteínas de proteínas Ub, pSTAT3, vimentina, pAKT e MDR-1, β-actina foi utilizado como um controlo de carga. C, a análise quantitativa da taxa de proliferação determinada pelo ensaio de CCK-8 para os tempos indicados. Os resultados mostrados são uma média de três experiências separadas através de; barras de erro, SD. D, exemplos representativos de ensaio tranwell foram fotografadas em 200 × ampliações. E, Themorphologic aparência de um mammosphere representante durante os tempos indicados foi photograghed em 200 × ampliações. F, ensaios de formação de Spheroid foram realizadas por diluição limitante com 256 células de uma célula por poço de uma placa de 96 poços Aderente ultra-baixo. Esta experiência foi realizada para tempos triplos com seis poços por diluição bem. O número de colónias foi contado no dia 14. L, células HeLa e de Mammosphere HeLa /TSA foram re-cultivadas numa placa comum aderente durante 24 h, e depois tratou-se com TSA, DDP, e PTX durante 48 horas ou UV durante 5 min. As células de apoptose foram quantificados utilizando Anexina V /coloração de PI e a análise de citometria de fluxo. Os valores são (barras de erro) médios e desvio padrão de 3 experiências separadas, *,

P

0,05. células mammosphere H, HeLa /TSA foram analisadas para níveis UBB, UBC, UbA52 e mRNA UbA80. GAPDH foi usada como um controlo de referência.

Examinámos ainda mais as características biológicas de células HeLa /TSA e observou-se que a proliferação de células HeLa /TSA era significativamente mais elevado do que em células de controlo HeLa, especialmente no longo -TERM cultura (Figura 2C). Além disso, a taxa de migração em células HeLa /TSA foi significativamente aumentada no Ensaio de Migração Transwell (Figura 2D). Estes resultados sugerem que HeLa /células TSA exibiu um alto potencial de malignidade.

estudos previamente relatados indicaram que uma prolongada selecção contínua de células de resistência aos medicamentos enriquece populações de células com características de células estaminais-como câncer [8]. Os dados acima mencionados demonstraram que HeLa /células TSA revelou um alto potencial maligno, que pode ter surgido sob a pressão selectiva de quimioterapia. Realizamos experimentos para testar se as células HeLa /TSA foram enriquecida com células-tronco cancerosas-like. células HeLa /TSA foram cultivadas em um estado não-aderente para formar mammospheres. Descobrimos que as células HeLa /TSA tinha uma significativamente maior potencial de formação de mammosphere. Os mammospheres HeLa /TSA eram maiores e cresceram mais rapidamente do que os mammospheres HeLa, que eram grupos de células pequenas que aderiram ao prato e eram difíceis de marcar no ensaio de diluição limitante (Figura 2E). Embora as células HeLa tinha uma tendência a formar mammospheres, eles foram incapazes de ser marcado após a semeadura menos de oito células, enquanto que apenas uma célula HeLa /TSA tinha uma probabilidade de 66,7% para formar uma mammosphere (Figura 2F). Para verificar se esferóides foram idênticos aos aderente células cultivadas, nós tripsinizadas esferóides e recultivadas-los em um estado aderente; estas células HeLa /TSA re-aderente ainda eram resistentes a TSA, DDP, PTX e UV, em contraste com os resultados para as células HeLa re-aderente, que não eram resistentes (Figura 2G). Além disso, a expressão do gene UBB em mammospheres HeLa /TSA ainda era significativamente maior do que no controle HeLa células (Figura 2H) mammosphere.

Os dados acima indicam que as células HeLa /TSA exibiram um aumento da regulação do UBB, pSTAT3 , vimentina, enquanto pAKT foi regulada para baixo. Além disso, estas células foram indiferenciada e num estado de repouso e exibiu uma capacidade de formação de mammosphere superior, numa situação de não-aderente. Estas características destacado que as células HeLa /TSA pode conter câncer de células estaminais-like, e este fenômeno pode estar relacionado com o aumento da regulação do UBB.

células HeLa /TSA tem câncer propriedades estaminais-como

para analisar se as células HeLa /TSA foram enriquecida com células-tronco cancerosas-like, foi realizada PCR em tempo real para detectar a expressão do gene de biomarcadores de células-tronco. Descobrimos que Sox2, Oct4 e Nanog foram significativamente sobre-regulada em células HeLa /TSA em comparação com células HeLa mammospheres (Figura 3A). Western blot confirmou que mammospheres HeLa /TSA altamente expressa os biomarcadores de células-tronco. Além disso, também encontramos MDR-1 e UBB foram expressas em alta HeLa /células TSA (Figura 3B). Da mesma forma, os resultados do ensaio de imunofluorescência demonstrou que quase todas as células HeLa /TSA possuía as características primárias de células estaminais, como, nomeadamente, a expressão desses biomarcadores de células estaminais (Figura 3C).

a, HeLa /mammosphere TSA as células foram analisadas para os níveis Sox2, Oct4 e Nanog ARNm. As colunas representam a média de três experiências separadas; barras de erro, SD. B, A análise quantitativa de Sox2, Oct4, Nanog, MDR-1 e proteína Ubb níveis por Western blotting. células mammosphere C, HeLa /TSA foram analisados ​​por imunofluorescência para Sox2, Oct4 e Nanog. As fotografias representativas foram feitas usando um microscópio de fluorescência (ampliação original, x 200). Os núcleos foram apresentados como detectado utilizando

DAPI

(4 ‘, 6-diamidino-2-fenilindol) coloração. D, A análise da fracção de célula de lado a população em células HeLa e de culturas de células HeLa /TSA. Painel esquerdo: HeLa; painel direito: HeLa /TSA. E, A análise da expressão de CD44 e CD24 em células HeLa e de células HeLa /TSA. Painel esquerdo: HeLa; painel direito:. HeLa /TSA

foi relatado que o efluxo mediado pelo transportador ABC empregada pelo corante Hoechst 33342 para isolar populações laterais-exclusão de corante (SPS) é enriquecida em células com câncer de haste -como propriedades de uma variedade de tumores [10]. Usando diferencial Hoechst 33342 coloração para identificar SPs em células aderentes, observou-se um aumento significativo de células SP-positivas em células HeLa /TSA comparação com células HeLa parentais (média de 8,3% vs. 0,8%,

p Art 0,01, teste t de Student emparelhado) (Figura 3D). Estudos anteriores mostraram que CSCs de mama a partir de células mammosphere exibidos marcadores de superfície de CD44

+ CD24

– [9,11]. Como HeLa /TSA exibiram uma elevada taxa de formação de esferóides, examinámos a expressão de CD44 e CD24 em células HeLa /TSA. Os resultados mostraram que 52,4% dos HeLa /TSA foi CD44

+ CD24

-., Que foi semelhante ao anterior relatada em CSCs de mama (Figura 3E)

Estes dados mostram que a seleção da droga prolongado de HeLa /células TSA induziu uma alta expressão de biomarcadores células-tronco e um enriquecimento de CD44

+ CD24

– células. Portanto, as células HeLa /TSA pode ser enriquecido das células que têm câncer propriedades tronco-like.

Ubb siARN pode regular negativamente a SP e a formação de esferóides

A resistência de células estaminais de cancro para fármacos quimioterapêuticos tenha sido anteriormente descrita em uma variedade de tipos de tumor, incluindo cancro do ovário [10]. Para confirmar que o fenótipo maligno de células e proporção elevada de células HeLa SP /TSA foram relacionados com a expressão elevada do gene Ubb, utilizou-siRNA para knockdown Ubb em células. A seguir à transfecção de células HeLa com 3 siRNAs diferentes que têm como alvo a CDS do gene Ubb, nós escolhemos utilizar UbBsi2 porque mostrou um knockdown 77% do gene Ubb acordo com PCR em tempo real e os resultados de transferência de Western (Figura 4A, B) . Para transfectar efetivamente siRNAs em esferóides, introduzimos UbBsi2 em um vetor lentivírus (LV-UbBsi). Depois de knockdown do gene Ubb tanto em células HeLa e células HeLa /esferóides TSA utilizando LV-UbBsi (Figura 4C), em tempo real Os resultados da PCR mostraram que, embora a expressão do gene Ubb de HeLa /esferóides TSA-LV-UbBsi era ainda significativamente mais elevada do que a de esferóides de HeLa-LV-UbBsi (

P

0,01) (Figura 4D), a diferença entre estes grupos foi apenas 1,74 vezes, o que era muito mais baixa do que a diferença entre 9,25 vezes o HeLa não-silenciados /esferóides TSA e controle HeLa (Figura 2H). Enquanto isso, a expressão de Sox2, Oct4 e Nanog em HeLa /células TSA foi reduzida significativamente após a infecção LV-UbBsi (Figura 4E, F), e a SP

+ proporção de células HeLa /TSA-LV-UbBsi foi significativamente reduzida a partir de 2,58% para 1,25% (

P

0,01) (Figura 4G). Depois de re-cultivo das esferóides Ubb-silenciosas em suspensão, observou-se que o número de esferóides formadas em células HeLa /TSA-LV-UbBsi foi reduzido de uma média de 49-32 (

P

= 0,04) ( A Figura 4H). Estes dados mostram que o silenciamento UBB visivelmente reduzidas as tumorais propriedades estaminais-como de células HeLa /TSA, sugerindo que as propriedades cancer-tronco-like de células HeLa /TSA pode estar relacionada com a elevada expressão de UBB.

A, HeLa As células foram transfectadas com 10 nM de ARNsi Ubb de direccionamento, ou controlo de RNAi discrição, durante 72 horas. Em tempo real A análise de PCR de expressão relativa de ARNm Ubb procedeu-se. GAPDH foi usada como um controlo de referência. B, A análise quantitativa do nível de proteína Ubb por western blotting. As células foram tratadas tal como descrito em A. O beta-actina foi utilizado como um controlo de referência. células mammosphere C, HeLa e HeLa /TSA foram infectadas com VE-UbBsi, o qual foi clonado com UbBsi2, durante 72 horas e sujeito a análise por transferência de Western para o nível de proteína Ubb. células mammosphere D, LV-UbBsi infectadas foram analisadas para os níveis UBB, UBC, UbA52 e mRNA UbA80. GAPDH foi usada como um controlo de referência. As colunas representam a média de três experiências separadas; barras de erro, SD. E, as células HeLa mammosphere /TSA LV-UbBsi infectadas foram analisadas para os níveis de Sox2, Oct4 e Nanog mRNA. GAPDH foi usada como um controlo de referência. As colunas representam a média de três experiências separadas; barras de erro, SD. células HeLa mammosphere /TSA F. LV-UbBsi infectadas foram analisadas para os níveis de proteína Sox2, Oct4 e Nanog. Beta-actina foi utilizado como um controlo de referência. G, A análise da fracção de célula de lado a população em células HeLa LV-UbBsi-infectadas e culturas de células HeLa /TSA. H, os ensaios de formação de esferóides foram realizados em células BT-UbBsi-infectados.

Menos células HeLa /TSA poderiam formar xenotransplantes

in vivo

Para validar ainda mais o potencial da haste-como de células HeLa /TSA, foi realizada

in vivo

experiências por injecção subcutânea de 100 a 5000 células em ratinhos NOD /SCID. Nós não poderia detectar qualquer diferença de tumorigenicidade entre as células HeLa /TSA e HeLa ao injetar mais de 1.000 células (Figura 5A, B). No entanto, quando menos do que 500 células foram implantadas, células HeLa /TSA exibiu um estado potencialmente mais tumorigénico (Figura 5C, D). Para além das diferenças no crescimento médio do tumor, as células HeLa /TSA iniciados tumores mais frequentes (6/6) do que injecções de células-mãe HeLa (3/6 injecções) (

P

= 0,04) em resposta a uma injecção de 500 células (Tabela 1). Além disso, as células HeLa /TSA iniciados tumores em 6/6 injecções, enquanto que as células HeLa não iniciar tumores (0/6 injecções) quando 100 células foram implantadas. O maior capacidade para o crescimento tumoral

in vivo

era consistente com tumor maligno em cultura de células aderentes. Depois de knockdown de UBB por LV-UbBsi, embora HeLa /TSA-LV-UbBsi poderia formar xenoenxertos com a mesma frequência em comparação com HeLa /TSA-LV-con quando injectado com 500 células infectadas (Figura 5E), o tamanho e peso do xenoenxertos foram significativamente reduzidos (Figura 5F, G, H). Estes resultados confirmaram que HeLa /células TSA exibiu um elevado potencial tumorigénico que poderia ser reduzida pelo silenciamento Ubb.

células HeLa e células HeLa /TSA foram injectadas subcutaneamente em ratinhos NOD /SCID com quatro densidades celulares diferentes. A-E, o volume do tumor é representada graficamente como uma função do tempo. , 5000 células A; B, células 1000; C, 500 células; D, células 100; E, 500 LV-con ou células HeLa /TSA LV-UbBsi infectados. F, As fotografias de subcutaneamente formado LV-con ou HeLa LV-UbBsi-infectados /tumores TSA são mostrados. G, A diminuição do tamanho do tumor em relação à inibição da infecção Ubb seguinte LV-UbBsi em xenoenxertos de células HeLa /TSA. As linhas horizontais representam o tamanho médio; barra de erro, SD;

p = 0,001

, two-way ANOVA; 6 ratinhos /grupo. H, Os pesos dos tumores de xenoenxertos descritos em G. As linhas horizontais representam o peso médio; barra de erro, SD;

p Art 0,001, two-way ANOVA; 6 ratos /grupo.

Linha celular

No. de células injectadas

No. de tumores /n. de ratos

volume do tumor (mm

3)

peso do tumor máxima (g)

Dia do tumor harvest

HeLa50006/66750.485110005/66280.41545004/66680.46571000/6☆0☆HeLa/TSA50006/68520.595110006/65730.39545006/68100.53571006/65700.3960Table