Abstract
O transplante de fígado de carcinoma hepatocelular (HCC) resulta em uma condição específica, onde a resposta imune é potencialmente dirigidos contra ambos os antígenos alogénicos e câncer. Nós investigamos o nível de imunidade anti-câncer durante a resposta imune alogênico. Escuro Agouti-a-Lewis e de transplantes de fígado de rato Lewis-a-Lewis foram realizados e os receptores de imunidade anti-cancro foi analisado no momento da activação aloimune. A ocorrência de rejeição nos receptores alogeneicos foi confirmada por uma sobrevivência mais curto (
P
0,01), o aumento da função hepática (
P
0,01), a presença de sinais de rejeição na histologia, e uma específica do doador
ex vivo
reacção linfocitária mista. No momento da activação aloimune, células mononucleares de sangue do grupo alogénica demonstraram um aumento de citotoxicidade anti-cancro (
P
0,005), que estava relacionada com um aumento natural killer (NK) frequência de células (
p
0,05) e um nível de activação de monócitos /macrófagos mais elevada (
P
0,01). Do mesmo modo, a citotoxicidade anti-cancro das células NK do fígado (
P
0,005), e níveis de activação do fígado de monócitos /macrófagos (
P
0,01) foram também aumentados. A citotoxicidade associada-aloimune foi mediado através do receptor NKG2D, cuja expressão foi aumentado no enxerto rejeitado (
P
0,05) e em células NK e monócitos /macrófagos. ligandos NKG2D foram expressos em células de HCC de rato, e a sua inibição impediu a citotoxicidade associada-aloimune. Embora esperando
In vivo
validação, a citotoxicidade associada-aloimune após o transplante de fígado de rato parece estar ligada ao aumento de frequências e níveis de activação de células NK e monócitos /macrófagos, e é pelo menos em parte mediado pela NKG2D receptor
Citation:. Lacotte S, Oldani G, Slits F, Orci LA, Rubbia-Brandt L, Morel P, et al. (2014) Aloimune Activation Promove Anti-Cancer citotoxicidade após Rat Liver Transplantation. PLoS ONE 9 (3): e91515. doi: 10.1371 /journal.pone.0091515
editor: Jacques Zimmer, Centre de Recherche Public de la Santé (CRP-Santé), Luxemburgo
Recebido: 06 de dezembro de 2013; Aceito: 11 de fevereiro de 2014; Publicação: 20 de março de 2014
Direitos de autor: © 2014 Lacotte et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este estudo foi apoiada por doações do Swiss National Science Foundation (PP00P3_139021), a Fundação artères, a Fundação Europeia Astellas ea Fundação Boninchi, a Elsie e Carlos de Reuter, e Marie-France e Francis Minkoff Foundation. Christian Toso foi apoiada por uma Professorship do Swiss National Science Foundation (PP00P3_139021). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o transplante de fígado é o tratamento mais eficaz para pacientes com início irressecável carcinoma hepatocelular (HCC) [1], [2]. No entanto, 15% dos receptores de experiência pós-transplante recorrência HCC, o que leva rapidamente à morte em quase todos os pacientes [3]. Várias estratégias têm sido propostas para diminuir este risco, incluindo um melhor critério de seleção de transplante, o direcionamento de células de carcinoma hepatocelular circulantes, o uso de adjuvantes drogas anti-câncer e uma imunidade anti-câncer promovidos [4].
Transplante para HCC é uma condição única, com ativação imune dirigida contra ambos os antigénios do dador e câncer alogénicos. Esta dupla ativação foi pouco explorado. Uma activação aloimune só pode ser dirigida contra antigénios específicos alogénicas ou ser ligada a uma activação mais ampla também promover uma resposta imune anti-cancro não-específica. A última hipótese tem sido sugerido por um número de estudos que mostram um maior risco de recorrência pós-transplante em doentes com HCC mais profunda inibição imune; Por exemplo, após a utilização de anticorpos anti-linfócitos ou em caso de sobre-exposição a inibidores da calcineurina [5] – [8]. Além disso, uma diminuição da expressão de um ligando NKG2D em tumores HCC, os rácios de sangue baixo neutrófilos de linfócitos e contagens de macrófagos associados a tumores, também têm sido associadas com HCC recorrência [9] – [12].
Idealmente, o imunidade alogénica deve ser evitada e a imunidade anti-cancro promovido. Uma melhor compreensão da conversa cruzada entre os dois é, portanto, desejável, a fim de definir melhor os mediadores e os mecanismos envolvidos em cada tipo de imunidade. Em última análise, esses dados irão ajudar a definir a combinação ideal de imunossupressão após transplante de fígado para HCC.
O presente estudo avalia o nível de citotoxicidade anti-câncer no fígado, baço e sangue após o transplante de fígado de ratos alogénicos. Ele define o papel de tipos de células imunes específicas, incluindo células assassinas naturais (NK) e monócitos /macrófagos, ea ação dos receptores-chave de células NK.
Material e Métodos
Animals, Liver Transplantation Ética e Demonstração
As experiências foram realizadas em ratos Lewis macho e escuro Agouti (DA) com peso de 200-250 g (7 a 8 semanas de idade, Janvier). Eles foram submetidos a transplante hepático de acordo com um protocolo previamente descrito [13]. transplantes DA-a-Lewis (modelo alogénica) foram considerados como o grupo de estudo, e transplantes de Lewis-a-Lewis foram usados como controlos singeneicas (seis animais em cada grupo para avaliação da sobrevivência). Todos os animais foram tratados de acordo com as diretrizes internacionais sobre Animal Care e aprovação ética foi obtida a partir da comissão de ética da Universidade de Genebra e as autoridades veterinárias de Genebra (N ° 1052/3653/3).
rato linhas de células de carcinoma hepatocelular
células JM-1 foram gentilmente cedidas por George Michalopoulos (University of Pittsburg) [14]. células MCA-RH7777 foram adquiridas a partir da ATCC (Molsheim, França). Ambas as linhas celulares foram cultivadas em meio DMEM de glicose elevada no nível (Gibco).
Avaliação da função hepática, e Histologia do Fígado imunomarcação
Para detectar sinais de rejeição do fígado, testes de função hepática de soro, incluindo aspartato aminotransferase (AST), alanina aminotransferase (ALT) e a bilirrubina foram avaliadas no dia um, três e dez após o transplante. Os níveis séricos foram medidos em colaboração com o laboratório do hospital clínico central (Synchron LX20). As amostras de nove animais em cada grupo foram analisados.
A presença de rejeição também foi avaliada na histologia, após coloração com hematoxilina /eosina de amostras de fígado recuperado após dez dias após o transplante. O nível de rejeição foi às cegas graduada por um patologista fígado especialista de acordo com a classificação de Banff [15]. células NK foram marcadas em criocortes com anticorpos anti-NKRP1 (CD161, 10/78, BioLegend) seguido por Alexa Fluor®555 de burro anti-IgG de ratinho (Invitrogen). Os macrófagos foram marcadas em secções embebidas em parafina e com anticorpo policlonal de coelho anti-Iba1 (Wako), seguido por IgG de burro anti Fluor®555 Alexa-coelho (Invitrogen).
sangue periférico, baço e fígado célula mononuclear Isolamento
amostras de sangue da veia da cauda (500 mL) foram coletadas em 150 mL de dextrose de citrato ácido. Fígado e baço foram recuperados através de uma incisão na linha média abdominal depois de 10 de injecção de heparina U IV. O fígado foi perfundido com HBSS contendo 0,5 mg /ml de colagenase D (Sigma). Foi cortado em pedaços pequenos, ressuspensas em solução /colagenase HBSS, digerido a 37 ° C durante 20 min. A suspensão de células foi lavado e filtrado através de uma malha de nylon. O baço foi cortado em pedaços, triturada e filtrada através de uma malha de nylon. células de sangue periférico, baço e de fígado foram purificados num gradiente de densidade Ficoll Paque (GE Healthcare). células mononucleares isoladas foram lavadas e contadas.
reacção linfocitária mista e ELISA
ativações imunológicas alogénicas Periféricas e baço foram testadas usando reacções de linfócitos mistas. incubações de células foram realizadas em 96 poços placas em 200 ul de RPMI 1640 (Gibco), FCS a 10% (Invitrogen), 1 M de HEPES (Invitrogen) e 1 U /mL /1 ug /mL de Penicilina-estreptomicina e 0,29 mg /ml de L -glutamina (Gibco). células Lewis de resposta (2,5 × 10
5) a partir de quatro alogénico e quatro receptores singeneicos foram incubados com 2,5 x 10
5 estimulador irradiadas DA (ou terceira parte) esplenócitos (5000 rad) a 37 ° C /5% de CO
2 por 24 horas.
O nível de interferon gama (IFN-y) foi quantificada por ELISA. placas de poliestireno (Costar) foram revestidas durante a noite a 4 ° C com anti-rato purificada ylFN (1:500, clone DB-1, BioLegend) em tampão carbonato. As placas foram lavadas e saturado durante 30 minutos com meio RPMI 1640 suplementado. Os sobrenadantes de cultura celular foram adicionados durante duas horas, seguido de IFNy de rato anti-biotina (1:1000, Poly5109, BioLegend), estreptavidina-peroxidase de rábano (1:1000, BioLegend) e a solução de substrato (reagente TMB, R Dsystem). O nível de IFN-y foi obtido de acordo com uma curva de diluição.
citometria de fluxo Os anticorpos e Ensaio de Citotoxicidade
O fenótipo das células imunitárias do sangue, do fígado e do baço mononucleares foi avaliada por citometria de fluxo. Marcação foi realizada utilizando anticorpos contra CD3 (1F4) (BD Pharmingen), CD4 (W3 /25) (BioLegend), CD8 (OX-8), CD172a (OX-41) para monócitos /macrófagos e NKRP1 (CD161, 10/78 ) por células NK. O fenótipo das células foi avaliada em nove animais por grupo.
receptores de células NK foi avaliada utilizando anti-NKG2D (11D5F4) (eBiosciences) e anti-NKp30 anticorpos (SC-33647) (Santa Cruz). A presença de NKG2D-ligandos foi testada em linhas de células JM-1 e MCA-RH7777 após incubação com rato recombinante NKG2D-Fc quimera (139-NK-050, R D Systems) (5 ug /cavidade) e IgG anti-humano Fc (HP6017, BioLegend).
o nível de citotoxicidade de células anti-cancro foi avaliado com células mononucleares de sangue periférico (PBMC) e células NK do fígado (seis animais por grupo), no baço e no sangue ( sete animais por grupo). Eles foram incubados com as células cancerosas alvo YAC-1 marcadas com CFSE-(0,5 uM, Invitrogen), a diminuir a taxa efector /alvo variando de 40/1 a 4/1 durante quatro horas a 37 ° C. Digno de nota, as células YAC-1 têm a maior de histocompatibilidade de classe I e complexo são geralmente utilizadas para ensaios citotóxicos. Na sequência de marcação com AlexaFluor®647-AnnexinV (1,5 ul, BioLegend) e 7-AAD (1/1000, Invitrogen) em tampão de ligação da anexina, células mortas foram avaliados utilizando FACS Calibur (BD).
Em experimentos selecionados , a inibição da citotoxicidade foi testada por incubação com anticorpos anti-NKp30 anti-NKG2D e (1 ug /poço).
NK celular Magnetic Ordenando
a fim de analisar especificamente as células NK, uma classificação negativa foi realizada a partir de PBMC e baço. Após a incubação com anti-rato CD172a (OX-41, GeneTex), anti-CD45RA (OX-33, BioLegend) e anti-TCR (R73, BioLegend) anticorpos, as células foram lavadas com um tampão (PBS 2% de BSA 2 mM de EDTA ), e de cabra Dynabeads® revestidos foram adicionados IgG anti-ratinho (Invitrogen). Após a lavagem, a suspensão de células foi aplicada sobre um íman a fim de remover as células não-NK. A pureza das células NK foi avaliada por citometria de fluxo (85% no baço e 90% no sangue).
células NK do fígado foram obtidas por uma selecção em duas etapas negativo /positivo. As células mononucleares de fígado foram incubadas com biotinilado anti-CD172a e anticorpos anti-biotina acoplados a microesferas (MiltenyiBiotec). Após remoção das células CD172a + através de uma coluna, o fluxo de passagem foi incubada com anticorpo anti-CD161 FITC e microesferas anti-FITC, permitindo a selecção positiva de células NK. A pureza das células NK foi avaliada por citometria de fluxo (80% no fígado). As células seleccionadas foram imediatamente utilizados para o ensaio de fenotipagem ou citotóxico.
em tempo real de Reacção em Cadeia da Polimerase (qPCR)
O ARN total (células ou biópsias de fígado) foi preparado e purificado utilizando o Kit RNeasy Mini ( Qiagen, Germantown, MD) de acordo com as instruções do fabricante. Um ug de ADNc foi sintetizado através do alargamento de uma mistura de iniciadores aleatórios com o High Capacity cDNA de transcrição reversa Kit na presença de RNase Inhibitor (Applied Biosystems). A quantidade relativa de cada transcrito foi normalizada de acordo com a expressão de rplp1 (P1 grande proteína ribossomal). As sequências dos iniciadores para
rplp1
,
NKG2D
,
rrlt
,
rae1l
e
irp94
foram projetados com AmplifX e Primers3 softwares e estão disponíveis mediante solicitação. reações de amplificação foram realizadas num volume total de 20 ul usando um detector sequência Termociclador (BioRad CFX96) com kit qPCR Núcleo de SYBR Green I (Eurogentec).
A análise estatística
Os resultados foram representados como média +/- IQR. Os resultados foram comparados estatisticamente por meio do teste de Mann-Whitney. Sobrevivências foram plotados em curvas de Kaplan-Meier e comparadas com o teste log-rank. A significância estatística foi estabelecido em p . 0,05
Resultados
Avaliação da alloimmunity e Rejeição
A presença de uma alloreactivity foi examinado especificamente porque alguns rat rat-a-alogênico modelos de transplante de fígado induzir a única baixos níveis de alloimmunity sem rejeição celular aguda [16]. Como descrito na literatura, os estudados transplantes de fígado de rato ortotópico DA-a-Lewis foram ligados a sobrevivências mais curtos em comparação com os transplantes singeneicos (sobrevivência média: 13 versus 60 dias, p = 0,0037, dados não mostrados). testes da função hepática soro (AST e ALT) foram aumentadas após três dias nos receptores alogeneicos (todos p 0,01 vs. controles singeneicos, Fig. 1A). nível de bilirrubina foi aumentada após 10 dias nos receptores alogeneicos (p = 0,026 vs. controles singeneicos, Fig. 1B).
(A) Soro de aspartato aminotransferase (AST) e alanina aminotransferase (ALT) após alogénica escuras Agouti-to-Lewis (preto) e Lewis-to-Lewis (branco) transplantes de fígado de rato sing�icos. níveis (B) bilirubine após alogênico (preto) e singênico (branco) transplante. (C) e transplante de fígado de rato Representante-hematoxilina eosina biópsias coradas no dia 10 após alogênico (à direita) singênica (esquerda). (D) CD4 no sangue pós-transplante /CD8 no dia 7 (D7) e 11 (D11). secreção de (E) de IFN-y depois que as células mononucleares do sangue periférico (PBMC) reacção mista de linfócitos após dez dias pós-transplante com doador (DA) e estimulação terceira parte. * P 0,05, ** . 0,01
A presença de rejeição celular foi confirmada na histologia dia 10 e foi classificado Banff 8 em todos os destinatários alogénicos estudados. receptores singeneicos de controlo foram classificados Banff 0 (Fig. 1C). Além disso, a relação de CD4 /CD8 periférico no dia 11 era significativamente inferior nos receptores alogeneicos em comparação com receptores singénicos (2,9
vs. 3.6, p = 0,0051, A Fig. 1D). Finalmente, o alloimmunity foi direcionada especificamente aos antigénios do dador como demonstra o dia 10 reacções de linfócitos mistas contra esplenócitos DA (concentração de IFN-y sobrenadante: 410 pg /ml
vs
indetectável.), Ea ausência de resposta contra terceiros antígenos de ratos Fisher (Fig. 1E).
alloimmunity-Associated Peripheral citotoxicidade
em um esforço para avaliar o impacto da rejeição sobre a imunidade anti-câncer, a atividade citotóxica de células imunes periféricos foi testada
ex vivo
contra as células cancerosas YAC-1. No momento da activação aloimune (dia 10), o nível de citotoxicidade foi periférica aumentada nos receptores alogeneicos em comparação com os controlos singeneicos e ratos ingénuos (efector /alvo 40/1: 25,2%
vs 14,7%. e 9,4%, respectivamente, p = 0,0025, Fig. 2A). Este padrão foi observado em todas as diluições testadas (4/1, 10/1, 40/1).
(A)
Ex vivo
PBMC citotoxicidade anti-câncer após dez dias após alogênico e transplantações singeneicas e em ratos de controlo naive em vários razão efector /alvo (e /T). (B) Freqüência de NKRP1
células de alta (células NK), entre PBMC no dia 7 (D7) e 10 (D10) após o transplante. Citometria de fluxo dot-plot avaliou a estratégia de gating. (C) A citometria de fluxo ponto-enredo e histograma avaliar a estratégia de gating para monócitos /macrófagos (CD172 +) e nível de expressão NKRP1 sobre as células CD172 +. (D) Frequência de monócitos /macrófagos (células CD172 +) entre PBMC. (E) Nível de activação de monócitos /macrófagos (nível de expressão NKRP1 (intensidade de fluorescência média (IFM)) entre CD172a + células). * P 0,05, ** . 0,01
A fim de avaliar se a citotoxicidade alterada foi relacionada a uma variação nas subpopulações de células, citometria de fluxo análises foram realizadas em PBMC. NKRP1 (CD161), uma glicoproteína do tipo C membrana lectina, é altamente expresso em células NK e foi usada como um marcador para células NK de rato [17]. No dia sete, a frequência de células NK. (CD3
– NKRP1
alto) foi significativamente reduzida nos receptores alogênicos em comparação com os controles sing�icos (2,1%
vs
3,4%, p = 0,028, A Fig. 2B). Esta frequência diminuição das células NK periféricos está em linha com a migração observada previamente das células NK para o fígado logo após o transplante alogénico [18]. No dia 10, o aumento da citotoxicidade periférica observada estava relacionada com um aumento da frequência de células NK no sangue (10,79% em alogênico
vs
. 4,9% em singênica, p = 0,048).
Os monócitos /macrófagos também podem ser envolvidos nos eventos citotóxicos contra células cancerosas. No dia 10 da população de monócitos (CD172a
+) foi aumentado tanto alogénico e receptores singeneicos em comparação com os controlos não transplantados ingénuo, provavelmente reflectindo algum grau de activação imunitária não específica peri-operatória (16,6%
vs
10,7%
vs
5,58%, respectivamente; p = 0,1 para alogênico
vs
ingênua;.. p = 0,023 para singênica
vs
naïve, Fig. 2D). Dito isto, a frequência mais elevada foi observada nos receptores alogénicos (ainda não atingiu significância estatística, p = 0,455 para alogênico
vs
. Singênica). Além disso, a freqüência de monócitos activados que expressam NKRP1 (CD161) foi maior nos receptores alogênicos em comparação com os controles sing�icos e os animais não transplantados naïve (média de intensidade de fluorescência 1282
vs
. 568
vs
. 438, p = 0,0004, Fig. 2E) [19].
Ausência de alloimmunity-Associated Spleen citotoxicidade
a fim de melhor caracterizar a citotoxicidade periférica observada, avaliamos a alogênico e anti-cancro eventos imunitários no baço. No dia 10 esplenócitos de ratos alogénicos estimulados com células do doador (DA) secretado mais IFN-y do que as células de baço de ratos sing�icos, confirmando a presença de uma resposta alogênico específicas do doador no baço (684
vs
. 99 pg /ml, p = 0,028, Fig. 3A). Por outro lado, baço classificados células NK não demonstrou nenhuma diferença de toxicidade entre alogénico e receptores singénicos (razão efector /alvo de 10/1: 42,2 versus 48,3%, p = 0,30, Figura 3B.). Do mesmo modo, não houve alteração no número e o fenótipo de células de baço poderia ser detectada (dados não mostrados).
(A) IFNy após secreção de esplenócitos de reacção mista de linfócitos após dez dias de pós-transplante com doador e terceira parte estimulação . (B)
Ex vivo citotoxicidade anti-câncer
células NK baço após dez dias após alogênico e transplante singênico.
alloimmunity-Associated fígado mononucleares de ativação celular
A resposta imunitária de células mononucleares do fígado foi testado no dia 10 após o transplante. Após o isolamento, o número de células mononucleares do fígado foi aumentado nos ratos alogénicos em comparação com os seus homólogos singeneicos (16 × 10
6
vs. 5,35 × 10
6 células /fígado, p = 0,004 ).
Este aumento do número de células mononucleares estava relacionada com um aumento do número de células NK no enxerto alogénico (19,5
vs
. 3 no enxerto singeneicos, p = 0,006, Fig. 4A) e a um aumento no número de macrófagos (131
vs. 34,5 no enxerto singeneicos, p = 0,0034, Fig. 4B). Estes dois subconjuntos de células foram encontrados tanto no parênquima hepático e na infiltrados de células do enxerto alogénico. A alteração observada do número de células foi associado a um aumento da ativação. fígado classificadas células NK demonstraram um aumento da citotoxicidade anti-câncer nos receptores alogénicos (efetoras rácio /target 10/1:.. 58,8%
vs
32%, p = 0,030, Fig 4C). De nota, alogênicos transplantados de fígado de rato mostraram uma tendência para uma maior citotoxicidade em NK em comparação com as células NK-classificada de baço classificadas fígado (efetoras rácio /target 10/1: 58,8% vs 42,2%, p = 0,101). Esta atividade das células NK fígado superior está provavelmente relacionado com a rejeição alogênico localizados principalmente no enxerto de fígado [20].
(A) Imagens representativas de setores da alogênico (esquerda) e singênico (à direita) enxerto de fígado marcado com anticorpos anti-NKRP1 (vermelho). Os núcleos foram corados com Hoechst (azul). Número de células-NK marcados por imagem contava com várias seções de fígado. (B) Imagens representativas de setores da alogênico (esquerda) e singênico (à direita) enxerto hepático marcadas com anticorpos anti-Iba1 (vermelho). Número de macrófagos marcados por imagem contava com várias seções de fígado. (C)
Ex vivo
células NK fígado citotoxicidade anti-câncer após dez dias após alogênico e transplante singênico. Dois efectora rácio /alvo (E /T) foram testados. O nível de ativação (D) de monócitos fígado /macrófagos (nível de expressão NKRP1 (MFI) entre CD172a + células). * P 0,05, ** 0,01
O nível de activação de monócitos fígado foi aumentada nos receptores alogénicos (MFI:.. 1232
vs
590, p = 0,005, a Fig. 4D).
aloimunidade-Associated citotoxicidade através do receptor NKG2D
de modo a definir o potencial receptor /ligando de vias envolvidas na citotoxicidade detectada, qPCR foram realizadas no dia nove biópsias de fígado. Semelhante a um relatório anterior, a expressão de
NKG2D
, um dos melhores do receptor NK caracterizado relacionado com o tumor, foi 6,9 vezes superior nos enxertos alogénicos do fígado em comparação com os controlos singeneicas (p = 0,028, Fig. 5A ) [21]. Como o receptor NKG2D é constitutivamente expressa em células NK, este resultado poderia ter sido relacionada com o aumento do número de células NK no fígado alogénica. No entanto, os níveis de expressão de NKG2D nas células NK de sangue mediana (MFI:. 7694 vs. 4636, Figura 5B, à esquerda) e monócitos (mediana MFI:. 1180 vs. 666, Figura 4B, direita) foram igualmente mais elevados no alogénica destinatários.
expressão (A) do fígado de
NKG2D
transplante de fígado após dez dias depois. (B) os níveis representativos NKG2D expressão em células NK no sangue (esquerda) e monócitos (direita) de alogénicos (preto) e sing�icos destinatários (cinza). Isotipo foi utilizado como controle (linhas tracejadas). (C) escolhidas sangue inibição de citotoxicidade de células NK com anticorpos anti-NKG2D ou com anticorpo anti-NKp30. (D) Os níveis de ligante NKG2D (
rae1l, rrlt
e
irp94
) expressão no fígado após dez dias após o transplante. (E) Os níveis de ligante NKG2D (
rae1l
,
rrlt
e
irp94
) expressão em linhas de células de carcinoma hepatocelular rato. (F) Nível Representante recombinante NKG2D-Fc ligação ao rato HCC linhas celulares. * P 0,05, ** . 0,01
A implicação do receptor NKG2D em citotoxicidade foi testado com a utilização de anticorpo anti-NKG2D. As células NK de sangue demonstraram níveis ordenados citotóxicos mais elevados nos animais alogeneicos, e este efeito foi prevenido por adição de anticorpo anti-NKG2D (30,1
vs. 10,1, Fig. 5C). Esta inibição era específica do receptor como nenhuma diminuição pode ser observada com a utilização de anticorpo anti-NKp30.
A expressão de ligandos NKG2D foi ainda avaliado por qPCR no dia nove biópsias de fígado. No rato os três ligantes NKG2D foram descritos: Rae1l, Rrlt (ácido retinóico família transcrição precoce) e Irp94 (isquemia responsivo 94 kDa, choque térmico família de proteínas) [21], [22]. O
rrlt
expressão do gene foi aumentada significativamente nos enxertos alogénicos do fígado em comparação com enxertos de fígado singeneicas (2,93 vezes de aumento, p = 0,028, Fig. 5D).
Numa tentativa para determinar a forma como o aumento da citotoxicidade mediada por NKG2D contribuiu para depuração de células CHC, a expressão de ligandos NKG2D também foi avaliado em duas linhas celulares de carcinoma hepatocelular rato, JM-1 e da MCA.
Rrlt
foi expresso na linha celular JM-1 (21,4 vezes de aumento em comparação com os esplenócitos primários), mas não em células de MCA.
Rae1l
não foi expressa em células de carcinoma hepatocelular e
irp94
foi expresso em níveis diferentes nas duas linhas celulares (JM-1: 2,63, MCA:. 3,68 de aumento, Fig 5E). Finalmente, a presença de ligandos NKG2D na superfície de linhas de células de carcinoma hepatocelular foi confirmada com a utilização de uma proteína quimérica recombinante NKG2D-Fc. Ambos JM-1 e McA expressa altos níveis de ligantes NKG2D conhecidas e potencialmente ainda desconhecidas (IFM, JM1:. 3.53.10
4
vs
1.02.10
4, o MCA: 9.4.10
4
vs
1.83.10
4, Fig. 5F).
no geral, NKG2D-ligantes foram expressos em todas as linhas de células de carcinoma hepatocelular que apoiam a ideia de que activado NKG2D expressando as células NK e monócitos contribuir para apuramento celular HCC.
Discussão
Este estudo proporciona novos insights para a questão da ativação imune equilibrada após o transplante hepático alogênico na presença de HCC, demonstrando a presença de uma atividade citotóxica anti-cancro dependente de alloimmune após o transplante de fígado de rato. Esta citotoxicidade está ligado ao aumento de frequências e níveis de activação de células NK e monócitos /macrófagos, e é pelo menos em parte, mediada através do receptor NKG2D.
O modelo de transplante de estudada escuro Agouti-a-Lewis fígado de rato induzida uma forte activação aloimune especificamente dirigidos contra antigénios do dador [23]. Este perfil imunológico foi associado com um aumento do fenótipo e nível de activação de células NK e monócitos /macrófagos. Isto está de acordo com estudos anteriores que demonstram o impacto negativo dos macrófagos durante uma rejeição do enxerto renal de ratos e o efeito protetor da depleção de células NK após o transplante de fígado de rato alogênico [18], [24].
O cross-talk entre os alogénicas e de anti-cancro imunidades tem sido pouco estudado até agora, e os presentes dados mostram um fígado aumentado e periférico (mas não baço) a citotoxicidade anti-cancro no momento da rejeição de enxertos de fígado. No transplante de órgãos humanos, as células NK estavam presentes em infiltrados celulares endomiocárdicas mas essas células D, mas o não aparecer como principais intervenientes na rejeição do enxerto de fígado [25], [26]. Na verdade, um aumento alloreactivity das células NK após o transplante hepático tem sido relatado e essa atividade não foi correlacionado com os episódios de rejeição [26]. No entanto, o fígado humano e células NK tecidos linfóides secundários têm mostrado fortes níveis de citotoxicidade após a estimulação por IL-2 ou na presença de APCs activadas [27], [28].
Enquanto espera por
em
vivo e /ou dados clínicos, a presente observação suporta a utilização de níveis mais leves de imunossupressão em pacientes transplantados para o HCC, a fim de preservar a citotoxicidade anti-cancro. É de notar, muitos modelos de transplante de fígado alogénicos rat-a-rat induzir nenhuma rejeição celular aguda, e o modelo perfeito com células de tipo HCC -recipient sing�icos e imunidade alogênico aguda está actualmente em falta (sem linha de células Lewis HCC disponível), impedindo assim a
in vivo
validação dos dados apresentados. Além disso, a actividade anti-cancro descritos foi observada após eventos de rejeição avançados, que raramente são vistos clinicamente. No entanto, se a hipótese de que os níveis mais leves de rejeição também promover a eliminação de células de cancro.
em vez de diminuir a imunossupressão, como um todo, uma selecção cuidadosa de droga também pode ser tentada para poupar as células NK e os monócitos /macrófagos, tendo em vista uma melhor depuração de células CHC. A utilização de anticorpo anti-linfócito esgotar tem sido associada a um risco aumentado de pós-transplante HCC recorrência [8]. Não descartável anticorpos anti-IL2-R também pode ter um efeito, como eles alteram o fenótipo e função das células NK recentemente produzidos [29] – [31]. Sirolimus e micofenolato de mofetil foram mostrados para alterar o fenótipo e função
In vitro
células NK, enquanto que a ciclosporina não parece ter um efeito [32].
In vivo
, todas as drogas de manutenção têm um impacto em vários subconjuntos de células imunes ea combinação imunossupressão ideal continua a ser definida na configuração do transplante de fígado para HCC [33], [34].
o receptor NKG2D /ligantes NKG2D via apareceu como um jogador-chave na citotoxicidade associada à alloimmune. Já foi publicado que nível de expressão NKG2D é levantada no fígado enxerto alogênico [21]. Aqui, demonstramos que a expressão de NKG2D é especificamente aumentada em células NK e os macrófagos periférico no momento da rejeição, e
ex vivo
citotoxicidade das células NK do fígado é evitada por bloquear o receptor NKG2D (mas não o receptor NKp30). Além disso, os ligandos NKG2D poderia ser encontrado em células de carcinoma hepatocelular rato, confirmando os dados humanos com a expressão da proteína de ligação a UL16 (ULBP) 1, um ligando NKG2D humano, em tumores HCC [10]. Esta via tem sido explorada anteriormente, em outras configurações, tais como oncológicas carcinoma colorrectal, e o nível de expressão do ligando NKG2D tumor tem sido associada com a resposta HCC e sobrevivência dos pacientes [10], [35]. expressão NKG2D nas células NK no sangue é aumentada após a ablação por radiofrequência HCC, e está ligada a taxas de sobrevida livre de doença mais elevados [36]. Este aumento na expressão NKG2D também é observada após a quimioembolização transarterial e está correlacionada com uma diminuição no NKG2D ligando-derramamento (MICA solúvel) [37]. expressão NKG2D após o transplante hepático pode ajudar na HCC células de apuramento. Finalmente, NKG2D foi recentemente envolvida na conversa cruzada de células de macrófagos-NK levando a níveis mais elevados de activação da célula NK e a citotoxicidade das células anti-tumor [38]. O aumento da expressão de NKG2D observada em macrófagos no momento de enxerto alogénico rejeição fígado pode contribuir indirectamente, a citotoxicidade através da promoção de activação da célula NK e a citotoxicidade.
Para além NKG2D, um grande painel de activação e inibitórios receptores é expresso em NK células, que padrão de expressão pode modular o nível de activação de células NK [39]. Para ilustrar, os receptores inibitórios pode reconhecer classe I do complexo principal de histocompatibilidade, e inibem a citotoxicidade das células NK [40]. O perfil de receptores difere entre as células NK específicas de órgãos, assim como a sua função de [41], e as alterações no equilíbrio entre os receptores de activação e inibitórios podia explicar, pelo menos, alguns dos fenotípica aqui descrito e diferenças funcionais de células NK entre os locais em singeneicos e alogénicos destinatários. Uma exploração mais profunda é merecido.
Os presentes dados demonstram que a ocorrência de uma rejeição do enxerto rato fígado promove a citotoxicidade anti-câncer através do receptor NKG2D.