Abstract

Fundo

A complexidade do proteoma do plasma humano representa um desafio substancial para descoberta de biomarcadores. Análise proteômica de modelos geneticamente modificados rato de câncer e células cancerosas isoladas e linhas celulares fornecer métodos alternativos para a identificação de marcadores de câncer potenciais que seriam detectáveis ​​no sangue humano utilizando ensaios sensíveis. O objetivo deste trabalho é avaliar a utilidade de uma estratégia integradora usando estas duas abordagens para a descoberta de biomarcadores.

Metodologia /Principais Achados

Nós investigamos uma estratégia que combina proteómica plasma quantitativa de ovário modelo do rato do cancro com a análise de proteínas secretadas ou derramadas por células de cancro do ovário humanos. De 106 proteínas plasmáticas identificadas com níveis aumentados em ratos portadores de tumor, de 58 anos, também foram segregados ou lançar a partir de células de cancro do ovário. O restante consistia principalmente de proteínas-resposta do hospedeiro. De 25 proteínas identificadas no estudo que foram ensaiadas, 8 proteínas secretadas principalmente comuns ao plasma do rato e células cancerosas humanas foram significativamente regulada em um conjunto de plasmas de pacientes com câncer ovariano. Cinco dos oito proteínas foram confirmados para ser regulada em um segundo conjunto independente de plasmas cancro do ovário, incluindo na doença em estágio inicial.

Conclusões /Significado

análise proteômica Integrado de modelos do rato do cancro e humana populações de células cancerosas fornece uma abordagem eficaz para identificar potenciais biomarcadores de proteínas que circulam

Citation:. Pitteri SJ, JeBailey L, o Faça VM, Thorpe JD, Silva MA, Ireton RC, et al. (2009) integrado Análise Proteômica de células cancerosas humanas e plasma de ratos portadores de tumores de câncer de ovário Biomarcador Discovery. PLoS ONE 4 (11): e7916. doi: 10.1371 /journal.pone.0007916

editor: Alfred Nordheim, da Universidade de Tuebingen, Alemanha |

Recebido: 30 de Junho de 2009; Aceito: 26 de outubro de 2009; Publicação: 19 de novembro de 2009

Direitos de autor: © 2009 Pitteri et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores desejam reconhecer concessão SPORE NIH, # P50 CA83636 e CA105009 # P50, do Instituto do Câncer Detecção precoce Rede Nacional de Pesquisa e Canary Foundation. Daniela Dinulescu é um Foundation Scholar V e também é apoiada pela Burroughs Wellcome, Rivkin, Ovarian Cancer Research, e as Fundações Mary Kay Ash, os Madeline Franchi e Moorman Prémios do Instituto de Câncer Dana-Farber, e os modelos NIH mouse de Consórcio Humano do Câncer conceder # U01 CA084301. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

as proteínas detectáveis ​​no soro e plasma são comumente invocada para monitorar ovário, pâncreas, e a resposta do cancro do cólon para terapia e recorrência da doença através da medição do CA125, CA19.9 e CEA, respectivamente. Além disso, o rastreio e a monitorização do cancro da próstata actualmente assenta em parte sobre as medições dos níveis de PSA no sangue [1] – [3]. O desenvolvimento de estratégias eficazes para a identificação de circulação de marcadores proteicos que complementam marcadores atuais seria benéfico [4]. Uma série de estudos recentes têm utilizado cancro do ovário proteómica para identificar proteínas em células de cancro do ovário, tecidos, fluidos e [5] – [9]. Tais estudos sugerem centenas de potenciais candidatos em virtude de a sobre-expressão, mas não dão uma indicação quanto ao facto de o aumento dos níveis sanguíneos das proteínas candidatas podem ocorrer em pacientes com cancro. A identificação de novos marcadores de proteínas que circulam através do perfil de plasma representa um desafio significativo. Apesar de plasma é um dos materiais biológicos mais acessíveis que contém vastos conjuntos de proteínas e complexos e apresenta uma considerável heterogeneidade entre e dentro dos assuntos que dificultam a análise proteômica de proteínas de infestação baixo [10]. modelos de rato modificada de cancro caracterizado pela heterogeneidade limitada e um tumor favorável em relação à massa corporal, e de populações de células tumorais isoladas que podem ser perfilados em profundidade substancial actuais estratégias alternativos para a identificação de marcadores de cancro potenciais, proteínas nomeadamente segregadas que podem ser submetidos a validação no sangue humano utilizando ensaios sensíveis.

Temos desenvolvido vários modelos de ratos com câncer epitelial de ovário [11]. Estes modelos foram gerados usando a entrega intrabursal de adeno-Cre (AdCre) adenovírus através do infundíbulo em camundongos geneticamente modificados. Este método activa selectivamente oncogenes supressores de tumores e inactiva dentro do epitélio do ovário superfície (OSE), um local de origem de muitos tumores do ovário humano. Nós já contou com a

LSL-K-ras

G12D /+ Comprar e

Pten

loxP /loxP

cepas de murino condicionais (aqui referidos como K-ras /Pten) para desenvolver um modelo de ratinho de cancro do ovário [11] – [13]. Um segundo modelo desenvolvido em paralelo por nós e os outros baseia-se na cooperação entre as vias Wnt e PTEN (

APC

loxP /lox Pten

loxP /lox

combinação genética, aqui referido como Pten /APC) [14]. Ambos os recursos modelos de exposição de tumores ovarianos endometrióides.

Temos realizado recentemente perfilamento proteomic de populações de células de câncer de ovário, incluindo linhas celulares e células tumorais frescas enriquecidos a partir de ascite fluido, o que resultou na identificação de vários milhares de proteínas e elucidou o repertório de proteínas expressas na superfície da célula e as proteínas libertadas para o meio extra-celular [15]. análise proteômica revelou derramamento de domínios extra-celulares e processos altamente dinâmicos de secreção de proteínas. Aqui temos aplicado uma abordagem proteômica quantitativa em profundidade [16] – [18] para a análise das alterações de proteínas plasmáticas relacionadas com o desenvolvimento do tumor em um modelo K-ras /Pten ovário rato câncer para determinar o seu envolvimento nas vias e redes e sua correspondência com proteínas expressas ou lançados a partir de células de cancro do ovário humanos. Cego análise de amostras humanas foi realizado para determinar quais as proteínas ensaiadas a partir dos dados de células de cancro e plasma de murganho integrados produziu aumentos estatisticamente significativos nos seus níveis em casos de cancro do ovário em relação aos controlos. Um subconjunto de proteínas representando proteínas secretadas principalmente a partir do plasma de rato combinadas e dados de proteômica de células cancerosas humanas evidenciaram diferenças significativas nos níveis entre plasmas de pacientes com câncer ovariano e plasmas de indivíduos controle.

Resultados

Plasma Quantitative Alterações de proteína observado numa Cancer Modelo rato ovário

um conjunto de amostras de plasma de K-ras AdenoCre infectadas /ratos PTEN (n = 5) e uma piscina de controles injetados adeno-vazia (n = 5) foram submetidos à análise proteômica quantitativa para determinar as diferenças nos níveis de proteínas plasmáticas. grupos separados de plasma de casos e controlos foram sujeitos a imunodepleção para remover proteínas do plasma abundantes, seguido de marcação isotópica diferencial para distinguir casos de cancro a partir de controlos. As amostras foram misturadas e, em seguida, submetido a fraccionamento de proteínas intactas por permuta iónica seguido de cromatografia de fase inversa. As proteínas nas fracções individuais recolhidos foram enzimaticamente digeridas e submetido a LC-MS on-line /MS para a identificação de proteínas e de quantificação (Figura 1). Uma característica da plataforma IPAS é que permite grande fraccionamento de-complexação das amostras em fracções individuais para permitir a identificação e quantificação de proteínas presentes no plasma durante 6-7 ordens de grandeza [16], [19]. Um estudo anterior, utilizando esta abordagem tem mostrado que a análise quantitativa das alterações de proteínas pode ser determinado com fiabilidade [18]. Neste estudo, alguns 1.725.000 espectros de massa foram recolhidos e analisados. 1.031 proteínas singulares foram identificados com alta confiança (Tabela S1). 106 proteínas foram sobre-regulada de 1,5 vezes ou mais (p-valor 0,05) (Tabela S2). A maioria (57%) das proteínas upregulated continha um péptido sinal de secreção, ao passo que 17% englobados na sua sequência de gene correspondente de um domínio de trans-membrana. 28% das proteínas regulados positivamente foram previamente identificados em perfis proteoma de tecido de fígado de rato, uma fonte importante de proteínas do plasma [20], [21]. 9% não tinham ortólogo humano, tal como determinado com base na Base de Dados do Genoma do rato [22]. Em contraste, 36 proteínas foram reprimidos 1,5 vezes ou mais (p-valor 0,05). (Tabela S3), incluindo as proteínas secretadas com 8 proteínas que representam previamente identificados no tecido de fígado de ratinho

Um diagrama esquemático do fluxo de trabalho usado em este estudo. Piscinas de controle e plasma câncer do rato modelo K-ras /Pten foram primeiramente Imunodeprimido para remover as proteínas abundantes e, em seguida, rotulados com D0- e isótopos de acrilamida D3- para distinguir o câncer de controle. As piscinas foram misturados e sujeitos a extensa fraccionamento proteína intacta por permuta aniónica, seguida de cromatografia de fase inversa. Depois da digestão tríptica, as amostras foram submetidas a espectrometria de massa de alta resolução e espingarda análise por LC-MS /MS para a identificação de proteínas e de quantificação. Após a análise estatística e mineração de dados, proteínas regulados positivamente no plasma murino foram comparados com os dados da linha de células derivadas de tumores de células /câncer de ascite humano. Além disso, a análise via foi usado para determinar vias biológicas significativas e processos. A expressão das proteínas upregulated relevantes foi ainda validado em ratinhos e tumores humanos e plasma.

Análise Comparativa do Tumor rolamento mouse Plasma e Tumor de ovário humano celular proteomas

Nós comparamos o plasma do rato de dados com os dados de um estudo extensivo proteoma em três linhas de células de cancro do ovário humano (OVCAR3, CAOV3, e ES2) e de células de tumor de fluido de ascites obtidos a partir de um paciente com cancro do ovário [15]. As linhas de células consistia de dois adenocarcinomas pouco diferenciados serosa (OVCAR3, CAOV3) e um carcinoma de células claras (ES2). As ascite derivados células tumorais foram coletadas de um paciente com câncer de ovário seroso. As células foram isotopicamente marcado em cultura utilizando SILAC [23] para permitir a verificação da origem celular de proteínas identificadas nos meios de comunicação. Ao comparar as proteínas do plasma do rato regulada com a lista de proteínas enriquecido na superfície ou secretadas compartimentos celulares de células humanas do cancro do ovário (Tabela S2), 55% (58/106) de proteínas regulada em plasma de rato foram encontrados para ser liberado do ovário células cancerosas através da secreção ou derramamento ou enriquecido no compartimento superfície do ovário da célula cancerosa. marcadores candidatos previamente descrito para o cancro do ovário identificadas tanto no plasma do rato e células de cancro do ovário (Tabela S4), incluídos WFDC2 (HE4), IGFBP2 e LCN2. O saldo de proteínas não identificadas em células de cancro do ovário análises consistiram principalmente de proteínas inflamatórias e imunológicas de resposta relacionados. Interessantemente, embora a K-ras /modelo Pten tem características de cancro do ovário endometrióide, os dados sugerem que as proteínas secretadas regulada positivamente identificados no plasma de murganho com o desenvolvimento do tumor foram mais representativo de outros subtipos histológicos de cancro do ovário, uma vez que as linhas de células humanas e ascite derivado células tumorais resultou de adenocarcinoma papilar de células claras e subtipos serosa, respectivamente [24], [25] peptídeos.

Além das proporções quantitativas cancer-a-controle para proteínas apresentados, várias proteínas tinha rotulados unicamente detectado com a pesada forma de acrilamida, representando “câncer apenas” peptídeos. Dos 106 proteínas-regulada no plasma do rato IPAS, 33 proteínas tinha câncer somente peptídeos adicionais identificadas (Tabela S2), corroborando ainda mais o seu estado-regulada. Além disso, sete proteínas: CACNA1C, VCL, Fcgbp, Mmp19, Lyz2, Eef1a1 e Gapdhs teve peptídeos só de câncer (Tabela S2). Vcl actua como uma proteína de ligação de adesão focal e foi estudado no contexto de cancro [26]. Mmp19, parte da família de metaloproteinases implicadas em cancro, tem sido relatado para induzir a migração celular epitelial, que joga um papel importante na fase precoce do cancro [27]. Os membros da família Eef1a têm sido relatados como oncogenes putativos overexpressed no cancro do ovário [28], [29].

funções biológicas e redes entre regulada Proteínas em rato Plasma

análise Pathway foi realizada para determinar os processos biológicos que contribuem alterações no proteoma do plasma com o desenvolvimento do tumor de ovário, e explorar caminhos para as proteínas de interesse para compreender os processos que eles participam. Contamos com duas ferramentas caminho para esse efeito, Engenho e MetaCore de GeneGo. análise de caminho inicial da lista de 106 proteínas upregulated usando a ferramenta de previsão da rede gene computacional, Ingenuity Pathways Analysis, classificou as proteínas em funções biológicas. Trinta proteínas foram associados com a inflamação (p = 1,30 x 10

-6). Câncer foi identificado como um processo de doença significativa (p = 3,71 × 10

-5) em relação a todas as proteínas identificadas, sendo representada por 52 proteínas relevantes desta lista. Curiosamente, os genes para 11 proteínas foram associados como um grupo com câncer de ovário (p = 1,41 × 10

-3) (CFH, CLU, IFI30, IGFBP2, IGFBP4, LCN2, MMP2, POSTN, TFF3, TNFRSF9, HE4 (WFDC2 .) HE4, um marcador candidato conhecido para o cancro do ovário [30], [31] foi regulada positivamente (8,8 vezes p . 0,001) no conjunto de dados de plasma de murino Algumas proteínas desta lista foram também identificadas em estudos de tumores como resultado clínico preditores (Nov, CLU TNC, POSTN, IGFBP2, LCN2) ou mediadores de resistência à quimioterapia (CLU, FBLN1, THBS, STIP1, PTGES3, IGFBP4, ATOX1) [32] – [45].

58 de as 106 proteínas regulados positivamente na análise de plasma de rato foram encontrados para ser também enriquecida na superfície ou segregada compartimentos sub-celulares de células de cancro do ovário. Pathway Analysis das 58 proteínas identificadas quatro redes significativas utilizando Engenho (Figura 2 e Figura S1) e cinco redes com o fluxo de trabalho de MetaCore (Figura S2). os processos mais prevalentes sublinhados nas redes Ingenuity incluído o crescimento do tumor, proliferação celular e a apoptose, a regulação do microambiente do tumor, angiogénese, a migração celular, invasão e metástases (Tabela S5). Uma avaliação adicional usando ferramentas de enriquecimento de MetaCore através ontologias GeneGo e Gene Ontology (Figura S2, S3 Figura, Tabela S6) confirmou a adesão celular, proliferação, desenvolvimento e remodelação da matriz extracelular como processos representados significativos. As duas principais redes geradas por Ingenuity ressaltam a importância da regulação TGF-mediada da proliferação celular, metabolismo e remodelação do citoesqueleto (Figura 2, Tabela S5), complementando os resultados de enriquecimento MetaCore (Figura S3). Além de TGFp, outros nós central (com ambos Engenho e MetaCore) incluem MMP2, p38MAPK, NFkB, e RAS, todos conhecidos por serem importantes no cancro do ovário [46], [47]. análise de caminho dos 48 proteínas que foram encontrados para ser regulada no plasma do rato com o desenvolvimento do tumor, mas não identificados como secretada ou proteínas de membrana de superfície em células de cancro do ovário rendeu três redes significativas com Ingenuity (Figura S4, S5 Tabela). A lista inclui proteínas inflamatórias putativos como haptoglobina (HP), S100A8 e CCL8. A categorização de proteínas regulada no plasma com base em enriquecimento em células de cancro do ovário sub-frações forneceu um meio para avaliar quais regulada proteínas no plasma foram mais provável derivado de células cancerosas, e que proteínas foram mais provável relacionado para hospedar-resposta.

Mais duas redes (a, B) atribuídas pelo Ingenuity Análise Caminho para proteínas regulada no plasma mouse que também foram enriquecidos nos dados de linha de células de câncer. nós centrais incluem TGFp, PI3K, MMP-2, Ras, e MAPK. Proteínas coloridas em vermelho representam proteínas regulada e proteínas não-coloridas são iguais às atribuídas pelos bancos de dados Ingenuity como possíveis interações intermédios, com base no banco de dados Ingenuity. As linhas contínuas indicam relações diretas (duas moléculas de fazer contato físico) e as linhas tracejadas indicam relações indiretas (não requer contato físico). As pontuações para A) e B) são 51 e 24, respectivamente.

Análise de imunotransferência da Mouse e amostras humanas

Um conjunto de proteínas identificadas em células de câncer de ovário e encontrado a ser regulada no plasma de ratos portadores de tumor, TIMP1, LCN2, IGFBP2, PFN1, SPARC, EEF1B2, CLU, e FBLN2, foram selecionados para análise immunoblot usando tecido tumoral coletadas de modelos de rato, meios condicionados a partir de linhas celulares de cancro do ovário humano, e tumores ovarianos primários a partir de sujeitos humanos. Foram observados níveis de proteína aumentou para Timp1, Lcn2, IGFBP2, Pfn1, e Sparc em tecidos tumorais de ovário isolados a partir de K-ras /PTEN (Figura 3A) e Pten /APC (Figura 3B) modelos de ratinho de cancro do ovário em relação ao controle lisados ​​de tecido. Da mesma forma, o enriquecimento em TIMP1, LCN2, IGFBP2, PFN1, SPARC, EEF1B2, CLU, e FBLN2 foi observada em meio condicionado (CM) coletadas de linhas celulares de cancro do ovário derivadas de adenocarcinomas serosa (OVCAR-3, SKOV3, CaOV3, OVCAR-5 , OVCAR-8), carcinoma endometrióide (TOV112D), carcinoma de células claras (ES-2, IGROV1) em comparação com meio condicionado derivado a partir do epitélio do ovário humano superfície (mangueira, Figura 3C). Além disso, os níveis de TIMP1, LCN2, PFN1, IGFBP2, SPARC, EEF1B2, CLU, e FBLN2 expressão foram elevados em lisados ​​de tumor de ovário em relação ao controle de tecido recém-coletadas de pacientes submetidos à cirurgia (Figura 3D).

Protein níveis de TIMP1, LCN2, PFN1, IGFBP2, SPARC, EEF1B2 e CLU foram determinados a partir do seguinte: (a) tecido normal do ovário (N) e tumores do ovário (T) isolado a partir do K-ras /PTEN ou (B) Pten /modelo do rato Apc de câncer de ovário, (C) meio condicionado (CM) das linhas normais de células do epitélio da superfície humana (mangueira) e linhas de células de cancro do ovário e (d) os tecidos primários humanos (HPT): tecido ovariano normal (N) e de ovário tumores (T). Para as preparações de rato, lisados ​​de tecido foram preparados a partir dos ovários e tumores normais tomadas a partir do mesmo animal (a-d), juntamente com quatro e cinco tumores de animais separadas (E-I). Para amostras humanas de tumor primário (HPT), os lisados ​​de tecido foram preparados a partir de 4 amostras de tumor emparelhados com o respectivo tecido normal do mesmo paciente e 3 amostras de tumores solitários, em que não há amostras normais estavam disponíveis. As amostras dos pacientes são os seguintes: o paciente # 14 tinham tumores serosos bilaterais independentes limítrofes na esquerda (TL) e ovário direito (TR), os tumores # 3, # 7 e # 15 são carcinomas serosos papilares, tumor nº 12 é uma fronteira epitelial tumor do tipo Müller, com a diferenciação mucinoso e serosa endocervical, tumor # 13 é o carcinoma de células claras, e tumor # 16 é adenocarcinoma endometrioid.

ELISA Ensaios usando o mouse e Plasmas Humano

testada adicionalmente um subconjunto de proteínas encontradas por espectrometria de massa a ser regulada positivamente no plasma de ratinhos portadores de tumor, para os seus níveis no plasma humano e de murino. Nós também comparado o desempenho de proteínas encontradas para ser secretado por células de cancro do ovário, mas não foram identificados, quer em plasma de ratinho ou não encontrada em níveis elevados no plasma de ratos portadores de tumor. 25 proteínas foram escolhidos com base na disponibilidade de ensaios de ELISA. Para os ensaios do rato, avaliou-se os níveis de Timp1 Lcn2 e em fluidos biológicos e de plasmas com tumor ratos (Fase I /II, n = 6; Fase III /IV, n = 5; controlos, n = 18). níveis Timp1 em Fase I /II e Fase III /IV amostras foram aumentou 5,9 vezes (p 0,0001) e 9,5 vezes (p 0,0001) em relação aos controles, respectivamente (Figura 4A). Foram observados resultados semelhantes para Lcn2 (Figura 4B). Nós ainda determinar se Timp1 e Lcn2 foram enriquecidos em fluido extraído de tumores de ovário fase tardia e na ascite peritoneal dada a proximidade destes fluidos de células de cancro do ovário e da natureza segregada das proteínas. TIMP1 níveis elevados foram mais do que 400 vezes e 250 vezes em fluido ascítico de tumor de ovário e peritoneal em comparação com o plasma de murino, respectivamente (Figura 4C). Da mesma forma, Lcn2 tinha um padrão semelhante com um 79- e 19 vezes maiores níveis no líquido tumor ovariano e ascite peritoneal, respectivamente (Figura 4D), consistente com sua secreção ativa em torno fluidos pelas células tumorais.

TIMP1 e os níveis no plasma de murino LCN2 em várias fases da progressão do tumor foram determinados por ELISA como descrito em Materiais e Métodos (a, B). Também são mostradas as TIMP1 (C) e os níveis de fluido do tumor de ovário murino e ascite peritoneais LCN2 (D) em comparação com o plasma. A significância estatística foi determinada utilizando um de Student bicaudal teste t * P 0,05, ** p 0,01 e *** p . 0,0001 comparado com os controlos

As 25 proteínas escolhidas para ensaios em plasmas humanos foram: 1) regulado para cima em plasma de ratinho, 2) expresso por células do cancro do ovário, ou 3) tanto sobre-regulada no plasma do rato e expresso por células do cancro do ovário. O conjunto inicial de plasmas humanos, doravante referidos como Set 1, consistiu em amostras de plasma de 13 mulheres com câncer epitelial de ovário (n = 3 fase inicial, n = 10 fase tardia) e 56 mulheres saudáveis. Todas as amostras em conjunto 1 foram coletadas na clínica, sob condições não-cirúrgicas (Tabela S7). Os resultados do ensaio do Conjunto 1 estão resumidos na Tabela S2, em conjunto com os dados de plasma do rato e da linha de células utilizados para escolher as proteínas para o ensaio. Os níveis de 8 das 25 proteínas, GRN, IGFBP2, THBS1, RARRES2, Timp1, PPBP, CD14, e NRCAM, foram encontrados para ser estatisticamente significativa (p 0,05) elevado em indivíduos recém-diagnosticados com câncer de ovário em comparação com os controles (Tabela 1, Figura 5).

em conjunto 1, os níveis de proteína em pacientes com câncer foram comparados aos níveis nos controles saudáveis, com todas as amostras coletadas na clínica sob condições não-cirúrgicos. No Conjunto 2, os níveis de proteína em pacientes com câncer foram comparados com controles com todas as amostras coletadas na sala de operações sob condições cirúrgicas. A análise de regressão logística foi utilizada para determinar a significância estatística das mudanças nos níveis de proteína entre os grupos caso e controle. Para Set 2, os p-valores para as fases precoces e tardias foram calculados se o p-valor foi significativa em todo o conjunto 2 (todos os casos). * P 0,05, ** p 0,01, *** e p 0,0001 para os casos em comparação com os controlos. níveis de marcadores foram normalizados para dar controles saudáveis ​​uma média de 0 e um desvio padrão de 1. Os eixos y representam os níveis de marcadores padronizados.

Curiosamente, 5 dos 8 proteínas encontradas até -regulated no Conjunto 1 (GRN, IGFBP2, THBS1, RARRES2 e TIMP1) foram proteínas secretadas a partir do cruzamento dos dados de plasma do rato e de células de câncer. PPBP foi uma proteína secretada encontrado sobre-regulada no plasma de ratinho, mas não descobriram nas linhas celulares de cancro do ovário, enquanto que CD14 e NRCAM eram proteínas da superfície celular a partir das linhas celulares de cancro do ovário, e não foram quantificados em plasma de ratinho.

Os 8 proteínas que apresentavam um aumento estatisticamente significativas no conjunto 1 ensaios foram ainda testados em um conjunto adicional de amostras de plasma humano, doravante referida como Set 2. Set 2 consistiu em amostras de plasma de 55 mulheres com cancro epitelial do ovário (n = 31 fase inicial, n = 23, de fase tardia, e n = 1 desconhecido fase) e 39 controlos submetidos a cirurgia. Todas as amostras em Set 2 foram coletados na sala de operações sob condições cirúrgicas (Tabela S7). Dos 8 proteínas encontradas significativa no conjunto 1, 5 proteínas (GRN, IGFBP2, RARRES2, TIMP1, e CD14) foram confirmados para ser regulada para cima no Conjunto 2 (Tabela 1, Figura 5). Notavelmente todas 5 das proteínas foram estatisticamente significativamente elevada nas amostras em fase inicial.

Dos 25 proteínas que foram ensaiadas, dez tiveram resultados concordantes em plasma de ratinho e de dados da linha de células. Curiosamente, cinco proteínas que estavam presentes na intersecção de candidatos de plasma do rato e dados sobre a população de células (GRN, IGFBP2, THBS1, RARRES2 e Timp1), foram encontrados para ser significativamente regulada em Set 1 e quatro das cinco proteínas foram confirmados em Jogo 2, com THBS1 como a exceção. condições de coleta

amostra pode afetar os níveis de proteínas circulantes. Por exemplo, pacientes que tenham sangue colhido no momento da cirurgia podem ter aumentado os níveis de certas proteínas como resultado do stress [48]. Usando um método descrito anteriormente [48], avaliamos se os níveis de proteína diferiu entre os grupos caso e controle após o ajuste para as condições de coleta de sangue. Nas amostras utilizadas para ensaios, sete doentes com cancro do ovário tinha sangue desenha, em dois momentos: antes da cirurgia, e no momento da cirurgia. Os níveis de proteína em ambos os pontos de tempo para cada paciente estão apresentados na figura S5. Análises de regressão foram realizadas utilizando Generalized Estimating Equations (GEE) métodos [48] para explicar a correlação nos níveis de proteína dos 7 mulheres com duas coletas de sangue, e dar-p-valores que são imparciais, pelo sangue vários empates a partir das mesmas mulheres (Tabela S8). Após o ajuste para as condições de coleta de sangue, os cinco proteínas previamente encontrada significativa no Conjunto 1 e do Conjunto 2 análise de regressão logística, também foram encontrados significativa no modelo de GEE para o caso contra a comparação de controle saudável. Para um modelo de GEE secundário, o coeficiente para condições de tirar sangue foram fixados a partir da primeira análise de GEE para evitar viés de remontagem. A segunda análise foi restrita aos espécimes coletados no momento da cirurgia e todos os 5 proteínas encontrada significativa na primeira análise foram significativas no caso vs. não-caso, caso precoce versus não-caso, e caso final vs. comparação não-caso. Tais resultados corroboram os resultados da regressão logística e mostrar que IGFBP2, TIMP1, RARRES2, CD14, e GRN são elevados em todos os casos em comparação ao controle e importante nos casos iniciais em comparação aos controles.

GRN tem sido descrito como um factor de crescimento putativo para romance cancro do ovário, e verificou-se ser altamente segregada por células de cancro do ovário [49]. níveis de GRN e RARRES2 aumentada no plasma de doentes com cancro do ovário, tanto no início e os casos fase tardia são uma nova achados deste estudo. CD14, e IGFBP2 foram previamente ensaiados no soro de pacientes de cancro do ovário [37], [50], [51]. Eles foram significativamente elevados neste estudo, em plasma de ratinho e a fracção enriquecida em proteínas segregadas de linhas celulares de cancro do ovário. Um achado de interesse em nosso estudo é a ocorrência de aumento dos níveis de IGFBP2 e CD14 na doença em estágio inicial. TIMP1 realizada também mostrou o aumento dos níveis em ambos os casos precoces e tardias. dados da linha celular indicou que TIMP1 foi lançado a partir de células de cancro do ovário em nanogramas por milhão de células cancerosas por hora [18], que seriam responsáveis ​​por níveis aumentados em amostras de pacientes de cancro do ovário humanos.

Discussão

Há é actualmente uma compreensão limitada às alterações de proteínas do plasma que ocorrem com o desenvolvimento de tumores do ovário e para a maioria dos tipos de tumores em geral [52], [53]. A descoberta de novos marcadores de plasma tem representado um desafio significativo, particularmente para os marcadores que são aplicáveis ​​aos estágios iniciais da doença. Análise de dados de alta dimensão genômica, proteômica transcriptomic ou permite vias afetadas, redes e nós de sinalização a ser explorado [53], [54]. O presente estudo fornece evidência para a utilidade da integração de dados de análise aprofundada proteoma quantitativa de modelos de ratos com câncer com dados de células cancerosas humanas para a identificação de biomarcadores. Aqui usamos um modelo de rato com câncer epitelial de ovário em combinação com a plataforma proteômica IPAS para nos permitir avaliar e quantificar as alterações que abrangem proteínas de baixa abundância no plasma do rato com o desenvolvimento do tumor [53] de forma confiável. Integração com os dados a partir de linhas celulares de cancro do ovário humano fornecido um meio para avaliar quais upregulated proteínas foram expressas em células de cancro. foram determinados adicionalmente, nós sinalização que contribuíram proteínas regulada no plasma. Como resultado, as proteínas que provavelmente resultou de alterações inflamatórias e imunitárias de resposta foram distinguidos de proteínas que mais provavelmente resultou da secreção por células tumorais ou a partir de processos tumorigénicas. Mudanças no microambiente do tumor e ECM estão associados com a regulação autócrina. proteínas da MEC foram anteriormente identificados como genes de assinatura de metástases do cancro do ovário [55], [56]. As alterações no citoesqueleto foram observados, incluindo a migração mediada por citoesqueleto, a adesão, invasão e. Por último, as alterações de proliferação celular foram observadas e incorporado a apoptose celular. Vários nós de sinalização centrais foram identificados neste estudo, incluindo TGF, MMP2 e sinalização de NFkB. TGFp, sinalização em particular, é central para uma variedade de processos, incluindo a proliferação celular e a apoptose, a remodelação de ECM, a migração celular, adesão, invasão e metástase, angiogénese, e a inflamação e vigilância imune [57], [58]. A família TGF é um alvo ativo para prevenção e terapia [57] câncer, [58]. Curiosamente, o TGF-p é conhecido por ter tanto supressor de tumor e efeitos pró-oncongenic em vários cancros, incluindo o do ovário [59]. TGFp também desempenha um papel na homeostase do nicho de células estaminais epiteliais [60], e supressão do receptor de TGFp induz um ambiente altamente invasivo proliferativa e [61]. Tumbar et ai. também determinado que a perda de receptores de TGF-p em combinação com Ras oncogénicos tumorigenicidade aumentada. Esta hipótese é também apoiada pelas redes gerados na nossa análise via (Figura 2B), em que NFkB (presumivelmente sob o controlo de TGF-p) é atribuída a eliciar Ras, PI3K, e MAPK sinalização no sentido de respostas mediadas-actina dirigir a migração celular, EMT , invasão e metástase [59]. Esta função de sinalização de TGF-p é uma reminiscência da pluripotência seus efeitos sobre células estaminais embrionárias e desenvolvimento do tecido embrionário, incluindo o ovário [62] – [64]. Consistente com esta hipótese, redes adicionais ilustrados por análise de caminho (Figura S1) para a fase tardia Notch proteoma destaque e Dkk3, conhecidos efetores de células-tronco [65], [66]. Portanto, não é surpreendente que esta efetoras é dominante nos dados de plasma e de linhas de células de câncer, apoiando o papel atual da TGF, uma vez que provoca uma variedade de respostas relevantes aos processos de câncer (proliferação, Apotosis, inflamação, angiogênese, autorcrine-regulação de tumor microambiente /ECM e adesão, invasão e metástase).

Em busca de potenciais biomarcadores de câncer de ovário, foi realizada uma análise integrativa romance de comparação de dados proteoma do plasma mouse com linha de células humanas e ascite derivados de dados de células tumorais.