Abstract

Aqui nós apresentamos um dispositivo microfluídico mimética membrana simples e eficaz com bicamada lipídica anticorpo conjugado suportado (SLB ) “revestimento inteligente” para capturar células viáveis ​​circulantes tumorais (CTCs) e circulam microembolias tumorais (CTM) diretamente do sangue total de todos os pacientes com câncer clínicos palco. O SLB não covalentemente ligada foi capaz de promover o agrupamento dinâmico de anticorpos de lipídios-tethered aos antígenos do CTC e minimizado a retenção de células do sangue não específica através da sua natureza não-incrustantes. Um fluxo suave ainda mais nivelado afastado glóbulos fracamente ligados a atingir uma alta pureza de CTCs, e um fluxo de espuma de ar injetado desintegrar os conjuntos SLB para liberar CTCs intactas e viáveis ​​a partir do chip. O sangue humano cravado teste de linha de células de câncer mostrou a ~ 95% de eficiência global para recuperar tanto CTCs e CTMs. ensaio vivo /morto mostrou que pelo menos 86% das células recuperadas manter a viabilidade. Usando 2 mL de sangue periférico, a contagem de CTCs e CTMs de 63 doadores saudáveis ​​com câncer colorretal e foram positivamente correlacionados com a progressão do câncer. Em resumo, uma estratégia simples e eficaz utilizando princípio biomimética foi desenvolvido para recuperar CTC viáveis ​​para enumeração, a análise molecular, assim como

ex vivo

cultura ao longo de semanas. Devido à elevada sensibilidade e especificidade, é a primeira vez que mostram as taxas e quantidade dos CTC detecção de alta em pacientes com cancro não metastático. Este trabalho oferece os valores em ambos detecção precoce do câncer e prognóstico da CTC e fornece uma estratégia não-invasivo acurado para investigação clínica de rotina em CTCs

Citation:. Chen JY, Tsai WS, Shao HJ, Wu JC, Lai JM, Lu SH, et ai. (2016) sensível e específico Biomimético Lipid microfluídica Revestido para isolar viáveis ​​circulantes células tumorais e microembolias para detecção do câncer. PLoS ONE 11 (3): e0149633. doi: 10.1371 /journal.pone.0149633

editor: Jeffrey Chalmers, The Ohio State University, Estados Unidos

Recebido: 29 de setembro de 2015; Aceito: 02 de fevereiro de 2016; Publicação: 03 de março de 2016

Direitos de autor: © 2016 Chen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento: Este trabalho foi financiado por doações do Conselho Nacional de Ciência (hoje Ministério da Ciência e Tecnologia, Taiwan) contrato: NSC101-2113-M-001-021. -MY2, NSC102-2321-B-001-060, MOST-103-2321-B-001-042, e do Programa de Cúpula da Academia Sinica, Taiwan sob 104-0210-01-09-02. Este trabalho também foi apoiado pelo Ministério Taiwan da Saúde e Bem-Estar (Welfare Sobretaxa de produtos do tabaco), No.CMRPG3C1141. J.M. Lai foi apoiado pela Academia Sinica bolsa pós 2013-14. J.Y. Chen foi apoiada pela maioria dos-103-2811-B-001-132. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e interpretação, a decisão de publicação ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:.. Os autores declararam não há interesses concorrentes

Introdução

a metástase é a principal causa de recorrência e mortalidade em pacientes com Solid-tumores em todo o mundo. Acredita-se que uma vez que o tumor primário é estabelecido, mutações adicionais e as interações microambiente das células cancerosas vai promover a disseminação de metástases do cancro. A transição epitelial-mesenquimal (EMT) tem sido implicado como sendo responsável pelo derramamento de células tumorais a partir de células epiteliais aderentes em modelos pré-clínicos [1]. Intravasation de células de câncer primário de origem epitelial permitirá que as células cancerosas circulam na corrente sanguínea como células tumorais (CTCs) que circula através progressão migração /invasão. O CTCs disseminada pode, assim, viajar alguma distância e colonizar em locais secundários para o estabelecimento do tumor metastático. Mas o mecanismo de metástase do câncer ainda é obscura e percepção da difusão do câncer como CTCs permanece um desafio. CTC são evasivas para detecção por causa da população extremamente raro na circulação dos doentes com cancro. Poderia ser tão poucos como apenas 1 ~ 1000s CTCs fora de bilhões de células do sangue em pacientes com câncer sintomáticos. Apesar da sua população rara, a quantidade de CTC no sangue mostrou correlacionar-se com o mau prognóstico de doentes com cancro metastático [2], e os resultados da quimioterapia no cancro da mama, da próstata, e doentes com cancro melanoma [1,3,4]. Estes estudos indicaram que o monitoramento da contagem CTC pode ser útil para a detecção precoce e acompanhamento da eficácia durante o tratamento.

Recentemente, novas evidências mostraram que a presença de circular microembolias tumor (CTM) é fortemente associa com metástases à distância. Em comparação com a presença de só CTC único, a presença de CTMs correlacionou bem com o mau prognóstico no cancro da mama metastático, próstata, e cancros de pulmão de células pequenas [5,6]. Tem sido proposto que os agregados de células, tais como as MC, proporcionar uma vantagem adesão célula-célula contra a tensão de corte na corrente sanguínea e activar a sinalização para o anti-apoptose e protecção contra a anoikis [5]. Evidência de movimento colectivo em células de tumor primário por meio de uma forma dependente da integrina-β1-fornece uma oportunidade de CTMs derramamento na corrente sanguínea [7]. O abandono da interacção célula-célula mediada por placoglobina resulta numa diminuição dos CTMs na corrente sanguínea e se correlaciona com melhor prognóstico [6]. Apesar do papel importante de CTCs, o papel das CTMs e as interações entre CTCs e do microambiente durante a progressão do câncer ainda é incerto. Enumeração e caracterização das identificadas /CTC purificado a partir de doentes com cancro irá descobrir o carácter dos CTC /CTMs na progressão do cancro. Estabelecimento de um sistema de captura de CTCs que permite alta sensibilidade, especificidade e viabilidade para ambas as CTCs e CTMs irá proporcionar grande benefício para o diagnóstico e tratamento de pacientes com câncer clínicos.

Várias tecnologias têm divulgado CTCs enriquecimento e identificação com base em princípios diferentes, incluindo o isolamento imuno-magnética [8-14], células-size filtração baseada [15,16], dispositivos microfluídicos funcionalizados com anticorpos [17-21], tecnologia de digitalização de matriz de fibra óptica [22], dieletroforese, célula passiva triagem [23], a selecção negativa [24,25], conjunto-decisão ranking de alíquota [26], superfície de adesão nano-rugosa [27], o revestimento termo-sensível polímero [28], ou combinações dos anteriores [29,30] . Algumas dessas tecnologias apresentou melhor sensibilidade do que outros, incluindo estudos anedóticos em doenças não-metastáticos [31]. No entanto, quase nenhum provou utilidade clínica na detecção de rotina de CTCs, para todas as fases de câncer, pois isso requer uma plataforma altamente sensível e específico para isolar e preservar CTCs derivado do paciente para posterior investigação.

De toda a afinidade métodos baseados, dispositivos microfluídicos estão emergindo como ferramentas promissoras para isolar eficientemente células raras, incluindo CTCs e as células-tronco [18,32-34]. O principal desafio para esta plataforma promissora é liberar e recuperar as células alvo isoladas com atividade biológica [35]. Através da utilização de digestão enzimática, a libertação das células capturadas pode romper a membrana celular, degradar marcadores de superfície, e alterar tanto fenotípica e informação funcional do CTC, limitando assim as análises a jusante de células [34,36]. Além disso, embora a separação celular induzida pelo fluxo mostra boa eficiência de recuperação de 60% para 90% [37-39], a 50 a 200 dines /cm

2 de alta tensão de corte é necessária para separar as células por quebrar o anticorpo- títulos de antigénio da superfície das células [40]. Tal força forte é conhecido por alterar a expressão genética e, eventualmente, levar a mudanças fenotípicas e morte celular [32,41,42]. descolamento induzida por bolha de glóbulos adsorvido por afinidade, que tiram partido da tensão interfacial ar-líquido exercida sobre a célula adere a arrancá-lo a partir da superfície com 90 a 100% de eficiência de libertação em canais rectos livre de microestrutura. No entanto, a baixa viabilidade celular e as taxas de recuperação inconsistentes não foram devidamente abordados [43-45].

Entre esses estudos, no entanto, efeitos de superfície têm sido negligenciados. Conceptualmente, um “não-incrustação” superfície, isto é, uma superfície com um mínimo de interacção física com células, pode reduzir a tensão de corte necessária para lavar afastado células não-aderentes e especificamente proporcionar uma oportunidade para reduzir a força necessária para a dessorção de células. Além disso, um revestimento projetado com ligação fraca para a superfície, como fisisorção poderia fornecer non-perturbando pontos de clivagem (os elos mais fracos) quando exercendo tensão interfacial (tais como bolhas de ar). A capacidade para interromper o revestimento de superfície impede a clivagem directa de ligações de receptores de membrana celular, que mais frequentemente resultam em danos celulares. Nesta comunicação, descreve-se um revestimento inteligente em uma plataforma microfluídica que fornece propriedade “não sujar” para aumentar a rejeição de materiais indesejados no sangue e os “elos mais fracos” para a liberação celular. Aqui nós relatamos a bicamada lipídica suportado (SLB) revestido sistema microfluídico, a plataforma CMx ( “células capturadas no máximo”), e revelar-se altamente sensível e específico para a captura de ambas as CTCs individuais e CTMs e recurso com easy-to-release plataforma para adquirir CTC viáveis; todos requer apenas 2 mL de sangue total. Um estudo clínico envolvendo enumeração de ambas as CTCs e CTMs com base em 9 dadores saudáveis ​​confirmado por colonoscopia e 54 pacientes com estágios I a IV do câncer colorretal (CRC) confirmou ainda mais a sensibilidade superior e utilidade clínica da plataforma revestida fluídico lipídico. Concomitante cultura e mutação análise CTC derivado do paciente, melhorou ainda mais a viabilidade e utilidade tanto para a pesquisa básica e tratamento clínico da plataforma CMx.

Materiais e Métodos

Microfluidic Chip Preparação e superfície de revestimento

a fabricação de costume revestido de anticorpos conjugados com SLB (Ab-SLB) chips microfluídicos, a plataforma CMx, é descrito como se segue: a CO comercial

2 riscador laser (Epilog Helix 24, golden, CO) é utilizado para criar micropadrões sobre o poli (metacrilato de metilo) corrediça (PMMA) (tamanho = 76 mm x 25,4 milímetros, espessura = 1,5 mm). O laser também é usada para gravar uma fita adesiva dupla-face 63 mm de espessura (8018PT; 3M Corp, Maplewood, MN) para esculpir as fronteiras que cercam os padrões microfluídicos na PMMA. Os padrões microtrenched e microestruturas sobre a corrediça de PMMA foram desenhados usando Corel Draw (Corel, Ottawa, Canadá) e, em seguida, transferido para o riscador laser para maquinagem directa sobre o substrato. Neste estudo, seis tipos de chips estavam preparados. Os chips foram gravadas ligados com a lâmina de vidro tratada a plasma colocando o esculpido fita adesiva 3M (colada) entre o topo (PMMA corrediça) e uma lâmina de vidro sobre a parte inferior de modo a formar canais fechados. A preparação de vesículas lipídicas, a biotinilação do anticorpo de EpCAM, EpAb4-1, e a preparação sequencial de revestimento de camada dupla de lípido de anti-EpCAM-suportada no chip de microfluidos foram descritos anteriormente [46]. Em resumo, as paredes interiores dos canais de microfluidos foram tratados com vesículas lipídicas constituídas por 1-palmitoil-2-oleoyl-

sn-glicero

-3-fosfocolina (POPC) e 1,2-dipalmitoil

sn-glicero-

3-fosfoetanolamina-N-cap-biotinil (b-PE) em razões molares de 95/5 para formar SLB. Para fluorescência conjugado SLB (Texas Red-SLB), os canais de microfluidos foram revestidos por vesículas lipídicas constituídas por POPC, b-PE, e o Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (Texas Red-DHPE; ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) em razão molar de 94,5 /5 /0,5 seguir os mesmos procedimentos em lípidos vesículas preparação. Após a remoção do excesso de lípidos, neutravidina ™ (NA), foi conjugado com a PE-b na SLB através do reconhecimento de NA-biotina, seguido de conjugação de EpAb4-1 biotinilado (b-EpAb4-1) à AN para completar a formação de superfície .

linha celular usado e Cultura celular

A linha de células de cancro colo-rectal humano HCT116 e linha de células de adenocarcinoma ductal pancreático AsPC1 foram adquiridos da coleção Bioresource e Centro de Pesquisa (BCRC, Taiwan) e usado como linha celular positiva EpCAM. As células foram mantidas em Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM para HCT116; Gibco, Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) ou RPMI-1640 (para AsPC1; Gibco) com 1% de antibiótico-antimicótico (ThermoFisher Scientific) e soro bovino fetal a 10% ( FBS; Gibco) sob 5% de CO

2 atmosfera húmida. As células cancerosas HCT116 foram pré-corados com CellTracker verde CMFDA corante (Life Technologies, Carlsbad, CA) ou expressão ectópica de proteína fluorescente vermelha (RFP) antes enriquecidas. O meio de esfera de cultura (meio SPH) foi formulado como 10 ng /de factor de crescimento epidérmico mL (EGF, Gibco), /factor de crescimento de fibroblastos a 10 ng ml (FGF; BD Biosciences, San Jose, CA), 10 ng /ml de insulina (Sigma Aldrich, Saint Louis, MO), e B27 (Gibco) em meio DMEM isento de soro. As células viáveis ​​eluídas foram então cultivadas quer em meio completo ou meio DMEM com SPH normal, placa de cultura de fixação (Corning, Corning, NY), ou cultura em suspensão, utilizando uma placa de fixação ultra-baixo (Corning). Mortos vivem ensaio /(Life Technologies) foi realizada seguindo as instruções do fabricante. A pele derivada HS68 linha celular de fibroblastos humanos não tumorigénica foi mantida em meio DMEM de baixa glicose (Gibco) com 1% de antibióticos e 10% de FBS. Para as linhas celulares utilizadas neste manuscrito, o HCT116 e AsPC1 foram adquiridos da coleção Bioresource e Research Center (BCRC, Taiwan).

teste de eficiência de captura da Plataforma CMx

A eficiência de captura da plataforma CMx foi caracterizado utilizando a linha de células de câncer colorretal humano HCT116. As células individuais HCT116 pré-corados com CellTracker verde CMFDA (Life Technologies) foram inoculadas em poços com fundo de vidro (diâmetro: 6 mm, Altura: 5 mm) e 10 min foi permitido para as células a se acalmar. Os fundos também foram fotografadas antes e depois as células foram transferidas para todo o sangue coletado de indivíduos saudáveis ​​por microscopia de fluorescência (Leica AF 6000 fluorescência avançada sistema Imaging) para garantir contagens precisas. O número real de células fortificado foi definida como (número de células no poço antes da transferência) menos (número de células remanescente no poço após transferência). Após mistura adequada, suave, a mistura de células de sangue foi vertido através do microcanal funcionalizados sob a taxa de fluxo de 1,5 mL /h. Depois disso, o microcanal foi lavada com 0,5 ml de solução tamponada com fosfato (PBS), sob 4 mL taxa de fluxo /h e coradas com 0,3 ml de solução de Hoechst (1 ug /ml em PBS) por mancha núcleos. O canal foi fotografado sob microscópio de fluorescência (Leica DM16000B) para enumerar o número total de células capturadas no canal. As células cancerosas que capturam o desempenho definida como a razão entre o número de células HCT116 ligados no chip para o número de células a ser enviados para o chip. Para o ensaio de captura e libertação eficiência das células de fragmentação, as células HCT116 incompleta digeridos foram seleccionados por micromanipulador sob microscópio como previamente descrito [6] e foram directamente cravado na plataforma CMx. Tanto para linha de células e validação amostras clínicas, CTCs e CTMs foram capturados nas mesmas condições experimentais com taxa mesma injeção em fluxo (1,5 mL /h) e taxa de purificação PBS (4 mL /h).

Imunofluorescência Coloração

as células capturadas, libertados a partir do chip sobre a membrana de filtro, foram fixadas com 4% de paraformaldeído, permeabilizadas com 0,1% de triton X-100 em PBS 1X, e bloqueadas com albumina de soro bovino (Millipore, Bedford, MA). Subsequentemente, as células foram coradas com citoqueratina coelho anti-humano 20 (CK20; Abcam, Cambridge, Reino Unido) e de rato anti-CD45 humano (Abcam) durante a noite a 4 ° C e seguida por lavagem com PBS. Após lavagem em PBS, as células foram incubadas com o anticorpo de cabra conjugado com FITC anti-rato IgG (Abcam) e o

® 568 anticorpo Alexa Fluor anti-IgG de coelho (Life Technologies) durante 1 h à temperatura ambiente, os anticorpos em excesso foram, em seguida, removido por lavagem em PBS e fotografado por microscópio de fluorescência (Leica DM16000B). Para a imunocoloração de células de fibroblasto, actina de músculo liso-α (α-SMA, DAKO, Dinamarca) e receptor do factor de crescimento de fibroblastos (FGFR, Abcam) foram utilizadas como marcadores de fibroblasto.

declaração de ética e clínicas Amostras Recolha

As amostras de sangue periférico foram obtidas a partir de 54 pacientes de CRC, com fases I (n = 11), II (n = 13), III (n = 12) e IV (n = 18) sem terapia de cancro antes e cólon doadores livre de doença (n = 9) como controlos negativos foram incluídos em um cego, estudo prospectivo duplo (31 do sexo feminino e 32 do sexo masculino). Um total de 2 mL de amostra de sangue foram recolhidos por tubos de etileno-diamina-tetra-acético (EDTA) vacutainer (BD Biosciences) a partir de cada paciente e foi utilizado tanto para a captura do CTC e CTM na nossa plataforma para análise posterior. Os pacientes com CCR foram aceitos neste estudo não ter tratamentos de câncer anteriores, recebendo sangue desenhar antes da cirurgia, no mesmo dia ou um dia antes da cirurgia. Os doadores saudáveis ​​foram confirmadas por exame de colonoscopia sem doença cólon e recebeu coleta de sangue antes do procedimento. Média de idades dos pacientes e doadores saudáveis ​​são 62 e 47 anos, respectivamente. Os pacientes foram recrutados de junho a outubro de 2012, em Chang Gung Memorial Hospital, Linkou, Taiwan. Todas as amostras foram processadas em Academia Sinica, Taipei, Taiwan. O estado clínico e os resultados da CTC foram duplo-cego. O protocolo do estudo, incluindo design experimental e realização deste estudo foram claramente descritos e foi revisado e aprovado pelos Institutional Review Boards de Academia Sinica (AS · IRBOI-12040) e Chang Gung Memorial Hospital (100-1023B). O consentimento informado foi obtido de todos os pacientes, incluindo voluntários saudáveis ​​e pacientes com CCR antes do estudo.

Análise Molecular

Total de 7 hotspots de mutação do KRAS (G12V, G12D), p53 (R248W, R175H , R248Q) e APC (E1309fs * 4, 1556fs * 3) estado de mutação foram detectados pelo teste disponível comercialmente TaqMan® detecção de mutações (Life Technologies) seguindo as instruções do fabricante. Em resumo, o ensaio utiliza TaqMan específico para o alelo (tecnologia castPCR) por PCR competitiva. Cada tipo selvagem ou ensaio de alelo mutante foi composta de um iniciador directo, sonda TaqMan ® específica para um local específico para o alelo modificados ou não modificados, lócus iniciador de sentido reverso específico, e bloqueador MGB específico de alelo. Cada amostra de teste foi executado com um ensaio de alelo mutante (s) e o ensaio de referência gene correspondente. Os resultados foram analisados ​​com a versão do Sistema de Detecção Seq 2.3 para gerar os valores de CT

alvo e CT

referência. O valor de corte ΔCT detectado foi usado para determinar o limite da mutação por cento numa amostra que o ensaio pode detectar o alelo mutante. A fórmula de conversão entre% e ΔCT é de 2

– (ΔCT) × 100%. A sensibilidade do ensaio alelo mutante foi de 0,1%. Portanto, o valor de ΔCT ≤ 9,96 é considerado como positivo e o valor de ΔCT 9,96 como negativo.

Análise Estatística

Captura de eficiência foi relatado como média ± desvio padrão. Os meios de grupo foram comparadas por um teste t independente. As diferenças foram consideradas significativas ao nível de confiança de 95% (

p Art 0,05).

Resultados

Estratégia de CTCs e CTMs Capture, Purificação, e Release

a captura, a purificação, e a estratégia de libertação aproveita SLBS incorporar proteínas de estado nativo [46-53] e actuar como uma interface entre a parede interna do chip de microfluidos e anticorpo. Os SLBS biomiméticos inerentemente cria uma camada de lubrificação rejeitar componentes do sangue ( “non-incrustação”) e apoiar a mobilidade do anticorpo para formar uma plataforma de captura celular excelente. Neste trabalho, uma camada de anticorpos para moléculas de adesão de células epiteliais (anti-EpCAM), clonar EpAb4-1, é conjugado com as SLBS para capturar CTC selectivas [46]. Estudos anteriores demonstraram que SLBS proteína conjugada pode criar uma excelente separação de células e uma plataforma de cultura; Além disso, a fluidez lateral do SLBS permite a agregação de proteínas, aumentando assim a afinidade de ligação e especificidade para as células alvo [47,49]. Além disso, a natureza zwitteriónico das moléculas de lípidos na SLB minimiza ainda mais a proteína não-específica e /ou adsorção da célula [48,49,54-56], reduzindo assim a incrustação da superfície de sangue periférico. Nós incorporamos a superfície anti-EpCAM-SLB em um chip microfluídico com padrões gravados concebidos para melhorar a mistura caótica [57]. Ao controlar os parâmetros de fluxo do fluido, que primeiro capturar CTC sobre a superfície e, em seguida, aumentar a taxa de fluxo de tampão para diminuir glóbulos adsorvida não específicas sem deslocar qualquer um dos CTC ligados (Figura 1A). Finalmente, CTC purificadas são eluídos a partir do chip através de perturbar a montagem SLB, não a membrana da célula ou locais de ligação de proteína, por uma raspagem suave de espuma de ar. Esta estratégia combinada é capaz de realizar a captura e purificação dos CTC, subsequentemente, permitindo-lhes ser libertado suavemente para outras análises moleculares a jusante ou cultivo. A visão geral e a definição do plarform CMx foram mostrados na figura 1B. Estratégias

(A) para captar, purificar e liberar CTCs da plataforma CMx. Na linha superior, o sangue flui através de um canal microfluídico revestidas com anti-EpCAM conjugado com NeutrAvidin que é aderida a uma camada de SLB em substrato. Ligação selectiva do CTC para o anti-EpCAM é reforçar os efeitos de anticorpos de agrupamento através da mobilidade da camada fluidificada SLB, enquanto outras células sanguíneas são facilmente descarga para longe da superfície de fluidos. A linha inferior mostrou o processo de libertação, na qual introduziu bolhas de ar perturbar os elos mais fracos entre substrato e a camada SLB permitindo CTCs intactas eluir para a recolha fora do chip microfluídico. (B) Visão de plataforma CMx e resumo do fluxo de trabalho plataforma CMx. Cerca de 2 ml de inteiros amostras de sangue obtidas de fresco a partir de pacientes de CRC foram carregados igualmente em cada CTC dispositivos de captura. Todas as fichas foram através da captura de células, purificação, e lançado para várias aplicações a jusante, incluindo imunofluorescência, contagem de células, a análise molecular,

ex vivo de cultura de células

e /ou cryobanking.

eficiência da célula alvo e de ligação de captura

as paredes interiores dos canais de microfluidos foram modificados por vesículas lipídicas constituídas por POPC e b-PE e conjugados de b-EpAb4-1 através do reconhecimento-biotina de NA [46]. Uma série de fichas de microfluidos com diferentes caminhos de fluxo, as dimensões e microestruturas foram seguidas com a mesma modificação de superfície (Fig 2A). Humano HCT116 linha de células de cancro colo-rectal pré-corados com CellTracker verde CMFDA foram então cravado em 1 mL de sangue total colhido de indivíduos saudáveis, em tubos de EDTA para captura de célula-alvo em um microcanal funcionalizado e seguiu com a purificação PBS e coloração nuclear Hoechst. A quantidade total de células cancerosas capturados pelo chip foram então fotografadas e enumerado sob um microscópio de fluorescência. As células duplamente positivo com ambos CellTracker verde e mancha nuclear foram identificadas como células cancerosas. células As células só de mancha nucleares positivas individuais foram identificados como não especificamente ligadas brancas do sangue (leucócitos). O desempenho de captura foi definida como a razão entre o número de células HCT116 ligados no chip para o número total de células cravado no chip [21].

(A) A geometria e os padrões de 6 modelos diferentes de canais de microfluidos (esquerda) e a eficiência de captura destas plataformas microfluídicos (direita), conforme definido pela divisão células capturadas sobre o total de células cravado. (B) As imagens recortadas fluorescentes (5,5 mm x 5,5 mm) no interior do canal de fluxo e a enumeração de HCT116 (verde) e glóbulos brancos (azul) na revestidos Ab-silano chips de Tipo E Ab-SLB ou. (C) a eficiência da célula descolamento (%, eixo Y) contra as taxas de fluxo (ml /h, menor para o eixo x) e a tensão de cisalhamento correspondente (X-eixo superior). As taxas de fluxo são geralmente mantida abaixo de 4 ml /h para evitar qualquer perda potencial de CTCs capturados. captura (D) Altamente CTM e eficiência de recuperação do chip revestido com Ab-SLB. A taxa de eficiência e recuperação de captura de microêmbolos tumorais HCT116-RFP gerados foram mostrou no painel direito. Os liberados aglomerados HCT116-RFP CTC com coloração DAPI foram apresentados no painel da esquerda. *:

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p Art 0,01.

Figura 2A ilustra a geometria e padrões de 6 projetos de canais microfluídicos diferentes (tipos A a F). O tipo A representa forma micro-canal linear, sem micro-padrões, tipo B representa a forma micro-canal linear com micro-padrões dispostas linearmente, Tipo C representa forma micro-canal linear com duas fileiras dispostas linearmente micro-padrões, tipo D representa linear moldar micro-canal com permutação alternativo micro-padrões lineares, Tipo e representa U micro-canal com permutação alternativo micro-padrões lineares, e Tipo F representa microfluídico de quatro canais com permutação alternativo micro-padrões lineares. trabalhos relativos foram oficialmente concedida em setembro 2014 pelo US Patent and Trademark Office (US 20140255976 A1). Os canais retas com padrões simples sob mesma velocidade linear representam um desempenho muito baixo de captura devido ao tempo de retenção limitada e falta de mistura padrão de fluxo: O desempenho captura de Tipo Um chip = 1,2 ± 0,6% e chip Tipo B = 4,5 ± 2,2%. Quando o número de micro padrões aumenta para criar uma mistura eficiente, a eficiência de captura de aumentar substancialmente: Chip de Tipo C = 17,9 ± 3,0% e chip Tipo D = 33,5 ± 6,6%. Além disso dobrando o comprimento do canal aumentou apenas ligeiramente a eficiência para 37,0 ± 10,5% (Type E), enquanto que 4 canais paralelos melhorou ainda mais a eficiência de captura para 93,7 ± 8,9% (Tipo F). Os números de células foram spiking mais reduzido para a gama de 5 ~ a ~ 100 por 2 mL de sangue para confirmar a linearidade do desempenho de captura no chip de Tipo F (Fig S1A).

Não-incrustante da Propriedade SLB revestido e superfície do alvo celular purificação

Para melhor avaliar o efeito de superfície, um chip de tipo e foi revestido com anti-EpCAM convencional com fio de silano (Ab-silano) ou anti-EpCAM conjugado SLB (Ab-SLB). Fig 2B mostraram que o desempenho de captura de HCT116 é de cerca de 15% sobre o chip revestido com Ab-silano, com mais de 2000 leucócitos ter de se sujeitar no chip não especificamente. Em comparação, o chip revestido com Ab-SLB melhorado significativamente a eficiência de captura e reduzida não específica WBC no chip

.

A pureza das células capturadas pode ser melhorada simplesmente aumentando a taxa de fluxo do tampão PBS nivelada num chip revestido com anticorpo-SLB. Como a taxa de fluxo de PBS aumentada, a percentagem de glóbulos brancos retidos diminuiu significativamente. No nosso estudo, a tensão de corte elevada para remover 55 ~ 80% dos glóbulos brancos ao reter mais de 90% HCT116 requer 4-8 ~ dines /cm

2 (correspondendo a taxas de fluxo de ~ 5-10 mL /h, a Fig 2C). A tensão de corte necessária para purificar células alvo é substancialmente menor do que o que foi relatado em estudos anteriores com base separação celular em superfícies silanizadas anticorpos convencionais e é considerado suficientemente baixo para ter pouco ou nenhum impacto sobre a viabilidade celular ou a expressão da proteína [40,58]. Pelo contrário, HCT116 permaneceu ligada ainda a 50 mL /h devido à forte interacção anticorpo-antigénio (S1 Filme). Para as amostras clínicas, escolhemos uma taxa de fluxo menor de 4 mL /h para evitar qualquer perda potencial de CTCs.

libertação de células alvo viável capturadas

Releasing CTCs viáveis ​​a partir dos chips microfluídicos é um passo crítico permitindo preservação conveniente de células, cultura de células, e a análise molecular jusante. As tentativas anteriores usando clivagem enzimática [34,36] ou forças mecânicas [40,58] para separar as células têm demonstrado quer liberação parcial ou morte celular inevitável, atribuído pela quebra de ligações antígeno-anticorpo ou ruptura da membrana. O SLB é uma montagem molecular lípido na interface sólido-água estabilizada por interacções hidrofóbicas-hidrofóbicas para dentro de longas cadeias de hidrocarbonetos de moléculas de lípidos e os grupos de cabeça hidrófilos para fora que interagem com superfícies de água ou óxido de silício hidrófilo (isto é, vidro). O conjunto de SLB pode ser facilmente desintegrada por introdução de um componente hidrófobo tão simples como bolhas de ar. Nós oferecido uma estratégia para liberar suavemente CTCs adesivas, sem perturbar as ligações antígeno-anticorpo através da injeção de espuma de ar contínuo para a microfluídica (S2 Filme). A solução espumosa foi criado por uma mistura de ar com meio de cultura celular e suavemente agitadas para a criação de espuma. A eficiência média de liberação usando 250 solução espumosa ul foi de 99,7% em 3 repetições (S1B FIG). A fim de validar a integridade da célula libertado a partir das lascas de microfluidos que utilizam espuma de ar, as células HCT116 foram pré-corados com CellTracker verde CMFDA e o Texas Red-SLB foram usadas para indicação revestimento de superfície. Após liberado pela espuma de ar, as células foram coradas com corante nuclear DAPI e fotografados em microscópio de fluorescência. Fig 3A mostrou que a célula fluido foi envolto por lipídeos, indicando liberação celular através descascando SLB por via aérea. ensaio Live /Morto foi realizada imediatamente após eluição celular; resultados mostraram 86% de células eluídas permanecem viáveis, em comparação com 0% de viabilidade a partir do convencionalmente revestidas anti-EpCAM chip de silanizada (Fig S2). Com a introdução de ar espumas hidrofóbicas, libertação suave das CTC capturados poderia ser realizado sem danificar as células. Como resultado, a superfície SLB não-incrustação preservada a morfologia celular intacto e ligado de células viáveis ​​para uma investigação mais aprofundada.

(A) As imagens fluorescentes das células HCT116 do cancro libertado do chip revestido com vermelho do Texas SLB. A célula foi envolvido com moléculas lipídicas Texas Red-SLB ao redor da membrana (azul: DAPI; verde: pré-coradas CellTracker verde CMFDA; vermelho: molécula de lipídio conjugado Texas Red). (B e C) Sobrepor imagens fluorescentes do single CTC liberado e CTM para caracterização de células. células eluídas a partir de amostras clínicas foram categorizados como CTC pelo tamanho, morfologia e imuno-histoquímica (DAPI + /CK20 + /CD45-). Glóbulos brancos foram identificados por DAPI + /CK20- /CD45 + imunocoloração (azul: DAPI; verde: CD45; vermelho: CK20).

Captura e libertação de CTMs

A fim de validar o capacidade de Ab-SLB revestido chip microfluídico para captura de CTMs e solte, a RFP HCT116 ectopicamente expressa foram utilizados. O

ex vivo

êmbolos tumorais foram simulados utilizando digestão incompleta pela tripsina e selecionados por micromanipulador sob o microscópio conforme relatado anteriormente [6]. números diferentes de êmbolos HCT116-RFP selecionados foram incrementadas nos chips microfluídicos para posterior captura e liberar testes de eficiência. Os êmbolos liberados foram então fotografadas ao microscópio fluorescente após a mancha nuclear DAPI (Fig 2D, painel esquerdo).