Abstract

Fundo

Semaforinas (Semas) consistem de uma grande família de proteínas secretadas e ancorado à membrana que são importantes no pathfinding neuronal e orientação axônio em áreas selecionadas do desenvolvimento do sistema nervoso . Destes, SEMA7A foi reportado ter uma actividade quimiotáctica em neurogénese e ser um imunomodulador; No entanto, pouco se sabe sobre a relevância da SEMA7A nos comportamentos de carcinoma de células escamosas oral (CCEO).

Métodos

Nós avaliamos a expressão SEMA7A em linhas celulares CCEO derivados e amostras de CCEO primários usando quantitativa da reacção de transcriptase inversa-polimerase em cadeia, imunotransferência, e imuno-histoquímica semiquantitativo (sQ-IHC). Além disso, as células (células knockdown SEMA7A shSEMA7A) foram utilizados para experiências funcionais, incluindo a proliferação celular, capacidade de invasão, migração e ensaios. Analisamos também a correlação clínica entre SEMA7A status e clínicos comportamentos em pacientes com CEB

Resultados

mRNA SEMA7A e proteína foram up-regulada de forma significativa (P 0,05). Linhas celulares em CCEO derivadas em comparação com queratinócitos humanos normais orais. As células shSEMA7A mostraram diminuição do crescimento celular por paragem do ciclo celular na fase G1, resultante do aumento da regulação dos inibidores da quinase dependente da ciclina (p21

Cip1 e p27

KIP1) e para baixo-regulação das ciclinas (ciclina D1 , ciclina e) e cinases dependentes de ciclina (CDK2, CDK4, CDK6 e); e diminuição da capacidade de invasão e actividades de migração por redução da secreção de metaloproteases de matriz (MMPs) (MMP-2, proMMP-2, Pro-MMP-9), e expressão do tipo membrana MMP 1- (MT1-MMP). Nós também descobrimos inactivação dos extracelulares da cinase AKT e 1/2 vias reguladas, uma molécula a montante da paragem do ciclo celular na fase G1, e reduzida secreção de MMP em células shSEMA7A. sq-IHC mostraram que a expressão SEMA7A nas epidermóide estudados primários foi significativamente (P = 0,001) maior do que em vias normais e foi correlacionada com o tamanho primário tumoral (P = 0,0254) e linfonodos regionais metástase (P = 0,0002).

Conclusão

Nossos dados fornecem evidências para um papel essencial de SEMA7A no crescimento tumoral e metástases em CCEO e indicou que SEMA7A pode desempenhar um potencial alvo /terapêutica de diagnóstico para uso em pacientes com CEB.

Citation: Saito T, Kasamatsu A, Ogawara K, Miyamoto I, Saito K, Iyoda M, et al. (2015) Promoção Semaphorin7A do crescimento tumoral e metástase no câncer oral humana por regulação do ciclo celular G1 e Matrix metaloproteases: Possível Contribuição para Tumoral Angiogenesis. PLoS ONE 10 (9): e0137923. doi: 10.1371 /journal.pone.0137923

editor: Chih-Hsin Tang, China Medical University, TAIWAN

Recebido: 01 de junho de 2015; Aceito: 23 de agosto de 2015; Publicação: 17 de setembro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Saito et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

financiamento:.. os autores não receberam qualquer financiamento específico para este trabalho

Conflito de interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Semaforinas (semas), secretada e proteínas associadas à membrana, fornecer estímulos ambientais para mediar diversos processos de desenvolvimento, incluindo a migração neuronal celular, orientação axônio, vasculogénese, ramificação morfogênese, e organogênese cardíaco [1]. anormalidades SEMA têm sido implicados na patogénese de perturbações neurológicas, tais como a degeneração e doença do neurónio motor de Alzheimer. Semas também são expressos em sistemas de resposta imune, incluindo as células B, células T, células assassinas naturais, macrófagos e, e têm sido implicados na regulação da organogénese, a angiogénese, a apoptose, e neoplasia [2].

SEMA1 -8 são caracterizados pela presença de um domínio conservado SEMA grande (-500 aminoácidos) ao domínio N-terminal e diferenciadas pela sua extremidade C-terminal [3]. SEMA1 SEMA2 e são encontrados em invertebrados, SEMA3-7 são encontrados em vertebrados, e SEMA8 é encontrado nos vírus [4]. SEMA4-7 existem principalmente como formas ligadas à membrana, ao passo que SEMA3 é segregado como uma molécula solúvel. Difusível semas pode induzir sinalização autócrino /parácrino, enquanto os membros da família ligados à membrana podem mediar sinais juxtacrine de curto alcance.

Embora as células cancerosas normalmente expressam níveis anormais de semas, o papel de SEMA7A na progressão do cancro é em grande parte desconhecida. SEMA7A, uma nova proteína ancorada-glycosylphosphatidylinisotol transmembrana, foi identificado pela primeira vez no sistema imunitário em células mielóides e linfóides da linhagem [5-7] e as funções por meio de p-integrinas em sistemas múltiplos [8]. Nós apresentamos os resultados de uma análise abrangente dos subtipos moleculares /celulares de SEMA7A em carcinoma de células escamosas oral (CCEO) que estão ligadas funcionalmente e contribuir clinicamente para a progressão tumoral e prognóstico em carcinoma epidermóide estudados.

Materiais e Métodos

declaração ética

o Comitê de Ética da Faculdade de Medicina da Universidade de Chiba (número de aprovação, 236) aprovou o protocolo do estudo, que foi realizado em conformidade com os princípios da declaração de Helsinki. Todos os pacientes forneceram consentimento informado por escrito.

linhas celulares derivadas do CCEO e amostras de tecido

linhas de células humanas CCEO derivados (HSC-2, HSC-3, HSC-4, Sa3, Ca9- 22, SAS, KOSC-2, HO-1-L-1, e Ho-1-N-1) foram obtidas a partir da pesquisa da ciência Banco de Recursos Humanos (Osaka, Japão) ou a Bioresource Centro RIKEN (Ibaraki, Japão) através Projeto Nacional de Bio-Recursos do Ministério da Educação, Cultura, Desporto, Ciência e Tecnologia do Japão. perfis de repetição tandem curtas confirmou a identidade celular. queratinócitos humanos cultivados primárias normais orais (HNOKs) foram obtidas a partir de amostras da mucosa do epitélio bucal saudáveis ​​coletadas de pacientes jovens no Hospital Universitário de Chiba. Três HNOKs independentes foram primárias cultivadas e mantidas em meio de queratinócitos oral (ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, EUA) composta por 5 ml de suplemento de crescimento de queratinócitos oral (ScienCell Research Laboratories) e 5 ml de solução de penicilina /estreptomicina (ScienCell Research Laboratories) [9-12]. Todas as células CCE-derivados foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) (Sigma-Aldrich) e 50 unidades /ml de penicilina e estreptomicina (Sigma-Aldrich).

cem e cinquenta amostras de CCEO primárias e epitélio normal pareados por paciente foram obtidos durante cirurgias realizadas no Hospital Universitário de Chiba. Os tecidos ressecados foram fixados em solução de formol tamponado a 20% para o diagnóstico patológico e imuno-histoquímica coloração (IHC). Foi realizada diagnóstico histopatológico de cada amostra CCEO de acordo com os critérios da Organização Mundial de Saúde no Departamento de Patologia da Chiba University Hospital [13]. Os estágios clínico-patológicas foram determinados com base na classificação TNM da União Internacional contra o Cancro [14].

expressão de mRNA análise

O RNA total foi isolado usando Trizol Reagente (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA ), de acordo com as instruções do fabricante. O ADNc foi gerado utilizando ReverTra Ás qPCR Mistura Mestre RT (Life Science Toyobo, Osaka, Japão) de acordo com as instruções dos fabricantes. Em tempo real de reacção quantitativa da cadeia de polimerase-transcriptase reversa (qRT-PCR) foi realizada num volume de reacção de 20 uL usando o Thunderbird mistura SYBR qPCR (Toyobo) no aparelho LightCycler 480 (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemanha), de acordo com o o protocolo do fabricante. Realizaram-se as condições gerais de amplificação tal como descrito anteriormente [15-18]. Os iniciadores foram concebidos utilizando o iniciador 3Plus (software livre on-line, https://primer3plus.com/~~number=plural), que especifica o conjunto mais adequado. As sequências dos iniciadores utilizados para qRT-PCR foram:

SEMA7A

, para a frente, 5′-TGTGTATTCCCTCGGTGACA-3 ‘; reverso, 5’-GAGTGGAACAATGGCGTCTT-3 ‘; e

gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase

(

GAPDH

), para a frente, 5′-AACATCATCCCTGCCTCTACTGG-3 ‘; reverso, 5’-TTGAAGTCAGAGGAGACCACTG-3 ‘; e

MMP2

, para a frente, 5′-CCCCAAAACGGACAAAGAG-3 ‘; reverso, 5’-CTTCAGCACAAACAGGTTGC-3 ‘; e

MMP9

, para a frente, 5′-GAACCAATCTCACCGACAGG-3 ‘; reverso, 5’-GCCACCCGAGTGTAACCATA-3 ‘; e

tipo de membrana 1- MMP

(

MT1-MMP

), para a frente, 5′-GCCTTGGACTGTCAGGAATG-3 ‘; reverso, 5’-AGGGGTCACTGGAATGCTC-3 ‘. A quantidade de transcrição SEMA7A foi estimada a partir das respectivas curvas padrão e normalizados para os

GAPDH

quantidade transcrição determinada em amostras correspondentes.

imunotransferência análise

As células foram lavadas três vezes com fosfato frio solução salina tamponada (PBS) e suavemente e brevemente centrifugado. Os sedimentos celulares foram incubadas a 4 ° C durante 30 minutos num tampão de lise (ureia 7 M, 2 M tioureia, 4% w /v de CHAPS, e Tris 10 mM, pH 7,4) com um cocktail inibidor de proteinase (Roche Diagnostics). A concentração total de proteínas foi medida utilizando um método de ligação de corante com base no ensaio de Bradford com o Bio-Rad Protein Assay Dye Reagente Concentrate (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EUA).

Os extractos de proteína foram sujeitos a electroforese 4-12% de gel de Bis-Tris e transferidos para membranas de nitrocelulose (Invitrogen) e bloqueadas durante 1 hora à temperatura ambiente com bloqueio Um (Nacalai Tesque, Inc., Kyoto, Japão). As membranas foram lavadas três vezes com 0,1% de Tween-20 em solução salina tamponada com Tris (TBS-T) e incubadas com o rato purificado por afinidade anti-SEMA7A anticorpo monoclonal (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA), anti-coelho GAPDH anticorpo policlonal (Santa Cruz Biotechnology), de coelho anti-ciclina D1 anticorpo policlonal (Santa Cruz Biotechnology), de coelho anti-ciclina anticorpo policlonal E1 (Santa Cruz Biotechnology), de coelho anti-p21

anticorpo policlonal Cip1 (Santa Cruz Biotechnology) , de coelho anti-AKT anticorpo policlonal (Santa Cruz Biotechnology), coelho anti-fosforilada-AKT (pAKT) anticorpo policlonal (Santa Cruz Biotechnology), tipo-1 de coelho membrana anti-metaloproteinases da matriz (MT1-MMP) anticorpo monoclonal (Cell Signaling Technology , Danvers, MA, EUA), de coelho anti-extracelular quinase regulada por sinal (ERK) 1/2 (Cell Signaling Technology), de coelho anti-fosforilado-ERK1 /2 (pErk1 /2) (Cell Signaling Technology), anti-coelho p27

KIP1 anticorpo policlonal (Cell Signaling Technology), coelho-anti-ciclina dependente de quinase (CDK) anticorpo monoclonal 2 (Cell Signaling Technology), anticorpo de coelho anti-CDK4 monoclonal (Cell Signaling Technology), e coelho anti CDK6-monoclonal anticorpo (Cell Signaling Technology) durante a noite a 4 ° C. A membrana foi lavada com TBS-T e incubadas com peroxidase de rábano conjugado com anti-coelho ou anti-IgG de rato como anticorpo secundário (Promega, Madison, WI, EUA), durante 1 hora à temperatura ambiente. Finalmente, as membranas foram detectados utilizando substrato Super-Signal West Pico Chemiluminescent (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, EUA), e imunotransferência foi visualizado por exposição das membranas a sistema ChemiDoc XRS Plus (Bio-Rad Laboratories). As intensidades de sinal foram quantificados usando o sistema Image Lab (Bio-Rad Laboratories). dados de proteínas densitométrica SEMA7A foram normalizados para os níveis de proteína GAPDH.

A transfecção com shRNA plasmídeo

células derivadas de CEs (SAS e KOSC-2) foram transfectadas com SEMA7A shRNA (shSEMA7A) ou controlo shRNA ( shMock) vetores (Santa Cruz Biotechnology) com Lipofectamine 3000 e Plus Reagentes (Invitrogen), de acordo com as instruções do fabricante. Após a transfecção, as células foram isoladas por meio de cultura contendo 1 ug /ml de puromicina (Invitrogen). Várias semanas após a transfecção, uma pequena colónia era viável. As colónias de células foram colhidos, transferidos para placas de seis poços, e expandir gradualmente a placas de 10 cm. Para avaliar a eficiência de SEMA7A knockdown, realizamos qRT-PCR e immunoblotting.

crescimento celular

Para avaliar o efeito da SEMA7A knockdown na proliferação celular, analisamos o crescimento celular em células shSEMA7A e shMock . Estas células foram semeadas em placas de 6 cm a uma densidade de 1 × 10

4 células viáveis. Nos pontos de tempo indicados, as células foram tripsinizadas e contadas em triplicado utilizando um hemocitómetro.

Invasividade ensaio

Para avaliar o efeito do knockdown SEMA7A na invasividade, um total de 2,5 x 10

5 células ressuspensas em meio isento de soro foram semeadas no Matrigel

®-revestido Transwell

® inserções (8 um poros) (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, EUA). Na câmara inferior, 2 ml de DMEM com 10% de FBS foi adicionado como um quimioatractor. Depois as células foram incubadas durante 48 horas a 37 ° C, a pastilha foi lavada com PBS, e as células na superfície superior do inserto foram removidos com cotonetes de algodão. As células que aderem à superfície inferior da membrana foram fixadas com metanol e coradas com violeta de cristal. O número de células que invadiram através dos poros em cinco campos aleatórios foram contadas usando um microscópio de luz a 100 × ampliação.

Migração ensaio

As células foram semeadas em placas de seis poços com 10% FBS /DMEM até uma monocamada confluente formada. Utilizando uma ponta de micropipeta, uma ferida foi criado no meio de cada placa. Incubámos as placas a 37 ° C em 5% de dióxido de carbono com meio isento de soro. Os resultados foram visualizados por medição da área da ferida que estava livre de células utilizando o software Lenaraf220b (https://www.vector.co.jp/soft/dl/win95/art/se312811.html). O valor médio foi calculado a partir de dados obtidos a partir de seis poços.

Cell-ciclo de análise

Os transmutants foram tratados com 200 ng /ml nocodazole (Sigma-Aldrich) durante 16 horas para sincronizar as células a a transição G2 /M [19-21]. Dezasseis horas após o tratamento com nocodazol, as células foram colhidas, lavadas com PBS, e sondaram-se com o kit de reagente de ADN CycleTEST Plus (Becton-Dickinson). determinação de citometria de fluxo do conteúdo de DNA foi analisado usando o BD Accuri

TM C6 Citómetro de fluxo (Becton-Dickinson).

zimografia

Para detectar as MMPs secretadas a partir de células shSEMA7A e shMock, foi realizado um ensaio de zimografia de gelatina (de células primárias, Sapporo, Japão), de acordo com as instruções do fabricante com pequenas modificações. Os meios condicionados foram misturadas com um tampão de amostra SDS e separadas em géis de gelatina. Após a lavagem, os géis foram incubados durante 32 horas a 37 ° C no tampão de reacção enzimática. Os geles foram em seguida corados com azul brilhante de Coomassie e descorado numa /solução de metanol ácido acético com agitação suave numa placa de agitação. As MMPs foram identificados pela presença de bandas claras no fundo com uma coloração uniforme.

Ciclo-heximida (CHX) tratamento

CHX, um reagente comum para a inibição da síntese de proteínas, tem sido relatada a inactiva as MMPs funções. Uma vez que vários estudos mostraram que a Ki de CHX varia de 1 a 50 ug /ml [22-27], utilizou-CHX (WAKO, Osaka, Japão) a uma concentração de 1 ug /ml durante 48 horas. Após o tratamento, foram realizadas immunoblotting análise e zimografia

Transient-regulação em células SEMA7A knockdown

O estudo recente tem sido relatado que TGF-β

1 (R . D Systems, Minneapolis , MN, EUA) aumenta o nível de expressão de SEMA7A através de uma via /3-Smad2 independente [28]. Uma vez que, já tratados com células shSEMA TGF-β

1 a uma concentração de 1 ng /ml durante 12 horas. Após o tratamento, foram realizadas expressão de mRNA e análises immunoblotting.

Semiquantitativa IHC

Semiquantitativa IHC (SQ-IHC) das secções 4 mícrons de amostras clínicas de CCEO embebidos em parafina foi realizada. Resumidamente, após parafinização, hidratação, a activação de antigénio, peróxido de hidrogénio e de têmpera de bloqueio, as secções clínicos foram incubadas com anticorpo monoclonal de ratinho anti-SEMA7A (Santa Cruz Biotechnology) a 4 ° C numa câmara húmida durante a noite. Após a incubação com o anticorpo primário, as amostras foram lavadas três vezes com PBS e tratados com reagente Envision (DAKO, Carpinteria, CA, EUA), seguido por desenvolvimento de cor em tetracloridrato de 3,3′-diaminobenzidina (DAKO). Os slides, em seguida, foram contrastadas levemente com hematoxilina, desidratadas com etanol, limpas com xileno, e montadas. Para quantificar o estado da expressão da proteína SEMA7A em amostras clínicas, foram utilizados os sistemas de pontuação SQ-IHC descrito anteriormente [19, 29-33]. As percentagens médias de células tumorais positivas foram determinadas em pelo menos três campos aleatórios em cada secção, e a intensidade da SEMA7A-imunorreacção foi pontuado como se segue: 0+, nenhum; 1+, fraco; 2+, moderada; e 3+, intenso. A intensidade da coloração e os números celulares foram multiplicados para produzir um SEMA7A pontuação sq-IHC. Para determinar os pontos de corte dos SEMA7A pontuações sq-IHC, foram analisados ​​os escores sq-IHC de 150 pacientes em uso de curvas receiver operating characteristic (ROC) e o índice de Youden. Casos com uma pontuação superior a 69,5 foram definidos como SEMA7A-positivo. Dois patologistas independentes de Hospital da Universidade Chiba, nenhum dos quais tinha conhecimento do estado clínico dos pacientes, fez esses julgamentos. Para calcular a taxa de sobrevida em 5 anos, pesquisamos a vida de cada paciente e mês de morte.

A análise estatística

Para comparar os níveis de expressão SEMA7A, a significância estatística foi avaliada utilizando o teste de Mann-Whitney . As relações entre as pontuações de coloração SEMA7A sq-IHC e perfis clínico-patológicos foram avaliados usando o χ

2, teste exato de Fisher, t de Student e teste de Mann-Whitney. A taxa de sobrevida em 5 anos foi avaliada pelo teste de log-rank. P 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Os dados são expressos como a média ± o erro padrão da média (SEM).

Resultados

Avaliação da expressão SEMA7A em CEB-linhas celulares derivadas

Para investigar o estado de SEMA7A expressão, foi realizada qRT-PCR e análises de imunotransf erência usando nove linhas de células derivadas de HSC (CEs-2, 3-HSC, HSC-4, SA3, Ca9-22, SAS, Kosc-2, HO-1-u -1, e Ho-1-N-1) e HNOKs.

SEMA7A

ARNm foi regulada de forma significativa (P 0,05) em todas as linhas celulares derivadas de CEB em comparação com os HNOKs (Fig 1A). Nós também realizado imunotransferência análise para investigar a expressão da proteína SEMA7A nas linhas celulares derivadas de CEs e os HNOKs (Fig 1B). Um aumento significativo na expressão da proteína SEMA7A foi observada em todas as linhas celulares derivadas de CEB em comparação com os HNOKs.

(A) Quantificação de

SEMA7A

expressão de ARNm em linhas de células derivadas de CEB-qRT- A análise de PCR. Significativo (

✽P 0,05, de teste t de Student) a sobre-regulação de

SEMA7A

ARNm é visto em sete linhas de células derivadas de CEB comparação com os HNOKs. Os dados são expressos como a média ± SEM dos resultados em triplicado. (B) Análise de imunotransferência de proteína SEMA7A em linhas celulares CCEO derivados e HNOKs. a expressão da proteína SEMA7A é sobre-regulada em linhas celulares derivadas de CEB-comparado com que nos HNOKs. dados de proteínas SEMA7A densitométricos são normalizados para os níveis de proteína de GAPDH. Os valores são expressos como uma percentagem dos HNOKs.

Estabelecimento de SEMA7A knockdown células

Desde frequente aumento da regulação do SEMA7A foi observado em células CCEO-derivados (Fig 1), nós transfectadas SEMA7A shRNA ou shMock em células de CCEO-derivados (SAS e Kosc-2). Para investigar SEMA7A ARNm e expressão de proteínas em células shSEMA7A, qRT-PCR e análises de imunotransferência foram realizadas (Fig 2A e 2B, respectivamente). O

SEMA7A

expressão de ARNm em células shSEMA7A foi significativamente (P 0,05) mais baixo do que em células shMock (Fig 2A). O nível de proteína SEMA7A nas células shSEMA7A também foi diminuída em comparação com células shMock (Fig 2B).

(A) A expressão de

SEMA7A

mRNA em shMock e células shSEMA7A (SAS e KOSC-2 transfectantes -derived).

SEMA7A

expressão de ARNm em células é significativamente shSEMA7A (

✽P 0,05, teste t de Student) menor do que nas células shMock. análise (B) Immunoblotting mostra que os níveis de proteína SEMA7A nas células shSEMA7A são também diminuiu acentuadamente em comparação com as células shMock.

análises funcionais de células SEMA7A knockdown

Para investigar o efeito de SEMA7A knockdown na proliferação celular, nós monitoramos o crescimento celular por 168 horas. o crescimento celular em células shSEMA7A diminuiu significativamente (P 0,05) em comparação com as células shMock (Fig 3A). Também realizamos ensaios de invasão e migração celular para avaliar os efeitos biológicos de células knockdown SEMA7A. Num ensaio de invasão, o número de penetrar células shSEMA7A significativamente (P 0,05) diminuiu em comparação com as células shMock (Fig 3B). No ensaio de migração, quando monitorizados visualmente a área das feridas uniformes em cultura de células confluentes, as feridas nas células shSEMA7A fechada significativamente (P 0,05) mais tarde do que aqueles em que as células shMock (Fig 3C). Portanto, as células shSEMA7A mostrou não só diminuiu a proliferação celular, mas também diminuiu de invasão e habilidades migratórias.

(A) (transfectantes SAS e KOSC-2-derivados) ensaio de proliferação celular de células shMock e shSEMA7A. Para determinar o efeito de shSEMA7A sobre a proliferação celular, células shMock shSEMA7A e foram semeadas em placas de 6 cm a uma densidade de 1 × 10

4 células viáveis ​​/poço. O crescimento celular de células shSEMA7A é inibido significativamente, em comparação com as células shMock após 4 dias (96 horas). Os resultados são expressos como a média ± SEM de valores a partir de três ensaios (

✽P 0,05, teste t de Student). (B) ensaio de invasão das células e shMock shSEMA7A transfectantes (SAS e KOSC-2-derivado). Para avaliar o efeito da SEMA7A knockdown na invasão, foi semeado 2,5 × 10

5 células no meio sem soro de Matrigel

revestido ®-Transwell

® inserções (8 mm poros) e adicionou soro suplementado médio na câmara inferior como um quimioatractor. Após incubação a 37 ° C durante 48 horas, as células que penetraram através dos poros foram fixadas, coradas e contadas utilizando um microscópio de luz em × 100 de ampliação. O número de células shSEMA7A que penetram através dos poros é diminuída significativamente (

✽P 0,05, teste t de Student) comparativamente com as células shMock. O valor médio foi calculado a partir de dados obtidos a partir de três câmaras separadas. (C) ensaio de migração de células shMock e shSEMA7A (transfectantes SAS e KOSC-2-derivada). Para avaliar o efeito do knockdown SEMA7A sobre a migração, feridas uniformes foram feitas em culturas confluentes de células e shSEMA7A shMock e a extensão do fecho foi monitorizada visualmente a cada 6 horas durante 12 horas. O valor médio foi calculado a partir de dados obtidos a partir de três câmaras separadas. A área da ferida é diminuída significativamente (

✽P 0,05, o teste t de Student). Na cultura de células shMock depois de 12 horas, ao passo que uma lacuna permaneceu nas células shSEMA7A

Cell- análise do ciclo de células shSEMA7A

Uma vez que o crescimento celular do SEMA7A células knockdown diminuiu (Fig 3A), foi investigada a distribuição do ciclo celular por citometria de fluxo. A percentagem de células na fase G1 em células shSEMA7A foi significativamente (P 0,05) mais elevada do que nas células shMock (Fig 4A) .também avaliados os níveis de proteínas relacionadas de prisão-G1, tal como CDKIs expressão (p21

Cip1 e p27

KIP1), ciclinas e CDKs. Como esperado, os CDKIs foram supra-regulados, e ciclina D1, ciclina E, CDK2, CDK4, CDK6 e foram sub-regulada de forma significativa (P 0,05) nas células shSEMA7A (Fig 4B). Estes resultados indicaram que as células shSEMA7A inibiu a proliferação celular por paragem do ciclo celular na fase G1.

análise de citometria de (A) de fluxo foi realizada para investigar a progressão do ciclo celular nas células shSEMA7A e shMock (SAS e KOSC- transfectantes 2-derivado) após a sincronização na fase G2 /M para usar nocodazol. A percentagem de células na fase G1 nas células shSEMA7A é aumentado significativamente em comparação com as células shMock. (B) Imunoblotting análise mostra-regulação de p21

cip1 e p27

KIP1 e para baixo-regulação da ciclina D1, ciclina E, CDK2, CDK4 e CDK6 nas shSEMA7Acells (SAS e KOSC-2-derivados transfectantes ) em comparação com as células shMock.

Redução da secreção de MMPs e expressin de MT1-MMP em SEMA7A knockdown células

Uma vez que a capacidade de invasão e habilidades migratórias em células knockdown SEMA7A diminuiu (Fig 3B e 3C), avaliou-se MMP-mediadas proteólise matriz por qRT-PCR e um ensaio de zimografia de MMP.

MMP2

e

MMP9

expressões de ARNm nas células shSEMA7A foram significativamente (p 0,05) mais baixo do que nas células shMock (Fig 5A). Nas células shSEMA7A, secreção de MMP2, proMPM-2, e proMPM-9 diminuiu substancialmente em comparação com células shMock. CHX células tratadas shMock inibiu a secreção de MMP-2, proMPM-2, e pro-MMP-9. Os níveis de MMP secretado foram representados como o índice de secreção normalizada, que foi calculada como a percentagem de MMP secretada em relação à das células shMock (Fig 5B). Foram também avaliadas MT1-MMP por qRT-PCR e análises immunoblotting (Fig 6A e 6B, respectivamente). O

MT1-MMP

expressão de ARNm em células shSEMA7A foi significativamente (P 0,05) mais baixo do que em células shMock (Fig 6A). O nível de proteína de MT1-MMP em células shSEMA7A também foi diminuído em comparação com células shMock (Fig 6B). CHX células tratadas shMock inihibited também a expressão de MT1-MMP expressão. Estas descobertas sugerem fortemente que SEMA7A era uma molécula essencial para a secreção e a expressão ‘MMPs.

(a) (transfectantes SAS e KOSC-2-derivados) expressões de MMP-2 e ARNm de MMP9 em células shMock e shSEMA7A. expressões de MMP-2 e ARNm de MMP9 em células shSEMA7A são significativamente (✽p 0,05, teste t de Student) menor do que nas células shMock. (B) As secreções de MMP-2, proMPM-2, e proMPM-9 em células shMock shSEMA7A e foram analisados ​​por zimografia em gelatina. Nas células shSEMA7A, secreção de MMP2, proMPM-2, e proMPM-9 são claramente diminuiu em comparação com células shMock. Além disso, as células tratadas CHX shMock inibiu a secreção de MMP-2, proMPM-2, e pro-MMP-9. Densitométrica MMP-2, proMMP-2 e proMMP-9 níveis são normalizados para níveis shMock.

(A) A expressão de

MT1-MMP

mRNA em células shMock e shSEMA7A ( SAS e transfectantes KOSC-2-derivada).

MT1-MMP

expressão de ARNm em células shSEMA7A são significativamente (

✽P 0,05, teste t de Student) menor do que nas células shMock. Análise (B) de imunotransferência mostra que os níveis de proteína MT1-MMP em células shSEMA7A são também diminuiu acentuadamente em comparação com as células shMock. CHX células tratadas shMock inihibited também a expressão de MT1-MMP expressão. dados de proteínas densitométrica MT1-MMP são normalizados para os níveis de proteína GAPDH.

inativação das vias ERK1 /2 e AKT em SEMA7A knockdown células

Foram avaliados os níveis de fosforilação de ERK1 /2 e AKT em shSEMA7A análise por imunotransferência. Os níveis de pErk1 /2 e a proteína pAKT diminuiu significativamente (P 0,05) nas células shSEMA7A em comparação com células shMock (Figura 7A e 7B). Estes resultados sugerem que as vias de ERK1 /2 e AKT sinalização foram atenuadas frequentemente nas células shSEMA7A.

(A, B) Análise de imunotransferência mostra que SEMA7A knockdown resulta na diminuição dos níveis de pErk1 /2 e pAKT em comparação com o células shMock (transfectantes SAS e KOSC-2-derivados). Densitométrica pErk1 /2, ERK1 /2, pAKT, e dados de proteínas AKT são normalizados para os níveis de proteína GAPDH.

células expressão SEMA7A em SEMA7A knockdown após TGF-β

1 tratamento

Para investigar o efeito de TGF-β

1 na expressão SEMA7A, que trataram os transfectantes com TGF-β

1. O

SEMA7A

ARNm no TGF-β

1 shSEMA7A células tratadas foram significativamente regulada para cima em comparação com TGF-β

1 células não-tratadas shSEMA7A (Fig 8).

Os níveis de mRNA de

SEMA7A

em TGF-β

1 incubadas (SAS e KOSC-2) são aumentou significativamente (SAS, * P = 0,0022, ** P = 0,0021, † P = 0,0001, P = 0,0005 ††, teste t de Student) (KOSC-2, * P = 0,0003, ** P = 0,0003, P = 0,0029 †, †† P = 0,0045, teste t de Student) quando comparada com que em TGF -β

1 células shSEMA7A não incubados.

níveis de fosforilação de ERK1 /2 e AKT em SEMA7A knockdown células com /sem TGF-β

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