Abstract

Os tumores de células oncocíticos são caracterizadas pelo acúmulo de mitocôndrias morfologicamente anormais em suas células, sugerindo um papel para mitocondrial anormal biogênese na transformação de células oncocítico. Pouco se sabe sobre a razão para a dismorfologia de mitocôndrias acumulados. As proteínas que regulam a morfologia das mitocôndrias, as proteínas “-shaping mitocôndrias”, pode modular a sua dimensão e número; No entanto, nada se sabe até agora sobre um possível envolvimento da dinâmica mitocondrial na transformação de células oncocítico em tumores. O nosso objectivo era avaliar o estado da morfologia mitocondrial e o seu papel na transformação celular oncocítico. Portanto, foram avaliados o padrão de expressão das principais proteínas de fusão e de fissão mitocondriais de uma série de amostras de tumor de células da tiróide, bem como em linhas celulares de tumores da tiróide, com e sem características celulares oncocíticas. A expressão da fusão mitocondrial (OPA1, Mfn1 e MFN2) e cisão (Drp1 e Fis1) proteínas foram avaliados por imuno-histoquímica (IHC) em uma série de 88 tumores da tiróide humana.

In vitro

estudos, para fins de comparação e para aprofundar o estudo, foram realizadas utilizando TPC1 – um carcinoma papilar da tiróide derivados line-e celular XTC.UC1, uma linha de células oncocítico folicular da tiróide derivados de carcinoma. Ambos IHC e

in vitro

proteína análises mostraram um aumento global dos níveis de proteínas “-shaping mitocondriais” em tumores da tiróide oncocíticas. Além disso, a sobre-expressão da proteína Drp1 pró-fissão foi encontrado para ser associado com tumores da tiróide oncocíticas malignas. Curiosamente, o bloqueio genética e farmacológica da atividade Drp1 foi capaz de influenciar a capacidade de migração /invasão célula cancerosa “, uma característica de malignidade do tumor. Neste estudo, mostramos que a dinâmica mitocondrial desequilibradas caracterizar as características malignas de tumores de células oncocíticas da tireóide, e participar na aquisição do fenótipo migração

Citation:. Ferreira-da-Silva A, Valacca C, Rios E, Pópulo H, Soares P, Sobrinho Simões-H, et al. (2015) mitocondriais Dynamics Protein Drp1 é abundante em oncocíticos da tiróide Tumores e regula a migração de células cancerígenas. PLoS ONE 10 (3): e0122308. doi: 10.1371 /journal.pone.0122308

Editor do Academic: Marc Liesa, da Escola de Medicina da Universidade de Boston, Estados Unidos

Recebido: 01 de outubro de 2014; Aceito: 19 de fevereiro de 2015; Publicação: 30 de março de 2015

Direitos de autor: © 2015 Ferreira da Silva et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e a sua arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este estudo foi parcialmente financiado pelo projecto PIC /IC /83037/2007 (a VM), a MFAG-12120 projeto desde AIRC e GR-2011- 02351643 do Ministério da Saúde italiano (para SC). Mais financiamento foi obtido a partir do projeto ‘Microenvironment, metabolismo e câncer “, com base no IPATIMUP e parcialmente suportado pelo Programa Operacional Regional do Norte (ON.2-O Novo Norte), no âmbito do Quadro de Referência Estratégico Nacional (QREN), e através da Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER). IPATIMUP é um Laboratório Associado do Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior Português e é parcialmente financiado pela Fundação Português para a Ciência e Tecnologia (FCT). O estudo também foi FCT através de uma bolsa de doutoramento para o AFS (Ref .: SFRH /BD /39104/2007)

CONFLITO DE INTERESSES:. O co-autor Luca Scorrano não é mais um membro do Conselho Editorial PLOS ONE, uma vez ele renunciou antes da data de apresentação dos autores. Assim, nada altera a aderência dos autores a PLOS ONE políticas e critérios editoriais.

Introdução

As células cancerosas são conhecidos a sofrer uma mudança em suas vias metabólicas basais, um processo muitas vezes descrito como o “

Warburg efeito

“, segundo o qual, mesmo sob alta tensão de oxigênio que produzem a maior parte do ATP pela glicólise [1]. Esta mudança no metabolismo tem sido relatado para ser acompanhada por uma alteração na morfologia e tamanho mitocondrial, embora os pormenores moleculares que acompanham as alterações morfológicas associadas com o efeito Warburg permanecem inexplicados, também desde que pouco é conhecido sobre como morfologia mitocondrial é regulado [2,3 ]. Nos últimos anos temos visto a identificação dos principais componentes da máquina dinâmica mitocondrial, um grupo crescente de proteínas que, entre outras funções celulares, regulam a fusão mitocondrial e fissão. disfunção dinâmica mitocondrial tem sido progressivamente revelado em um grande número de patologias, especialmente as doenças neurodegenerativas e câncer [4].

Um grupo particular de tumores incomuns tem sido relatada em praticamente todos os órgãos, com maior frequência em tireóide e rim [5,6]. Tais tumores têm células com uma distinta altamente eosinofílica, citoplasma granulado e inchado, com núcleos grandes e nucléolos proeminentes [7,8,9,10]. A microscopia eletrônica mostrou que essa aparência inchada é devido a um acúmulo anômalo de mitocôndrias exibindo morfologia anormal [11,12,13]. Estes tumores são descritos como oncocytic-, oxyphilic-, eosinofílica, “célula de Hürthle (quando se referir ao tiróide) tumores” ou como “oncocitomas”. Por uma questão de simplicidade, vamos designar como “eles oncocitomas” ou “tumores de células oncocítico” [10]. Na prática clínica atual, os critérios para o diagnóstico das variantes celulares oncocíticas de carcinoma papilar da tiróide (PTC) e carcinoma folicular (FTC) incluem características nucleares, sinais de capsular e /ou invasão vascular, que são compartilhados com os tumores de células não-oncocíticas do mesmo tipo, bem como a proliferação mitocondrial típica para tumores de células oncocíticas [5,6,7]. Na verdade, essa ideia de que a transformação oncocítico ocorre em cima de tumores “convencionais” é apoiado pelas alterações genéticas semelhantes de carcinomas oncocíticas e os seus homólogos não-oncocíticas, que apresentam uma incidência comparável das várias anormalidades genéticas, como o RET /PTC rearranjos e mutações BRAF V600E [6,14,15,16,17,18]. Embora as primeiras recomendações considerados todos os tumores da tiróide oncocíticas maligna, estudos posteriores demonstraram que, enquanto os casos foram corretamente estratificados de acordo com as suas características clínico-patológicas, tais como a idade dos pacientes, estadiamento dos tumores e cirúrgico Procedimento: o prognóstico dos pacientes com célula de oncocítico PTC e FTC variantes é semelhante ao de pacientes com carcinomas respectivos convencionais, não-oncocíticas [3,5,17,19].

as principais diferenças entre tumores oncocíticas e não oncocíticas residir no frequência de variações encontradas no DNA mitocondrial (mtDNA) e genes de ADN nucleares que codificam proteínas mitocondriais [2,5,20,21]. Destes, uma grande deleção 5kb, muitas vezes referida como a “eliminação comum” que elimina uma série de genes mitocondriais e interrompe a replicação do mtDNA e a transcrição, é frequentemente encontrada em tumores da tiróide oncocíticas e está associada com um aumento da massa mitocondrial [20, 22,23,24].

os dados no registro sugerem que mutações no fosforilação oxidativa (FOX) genes, nomeadamente em genes do complexo I, podem resultar em comprometimento do sistema OXPHOS e pode levar ao acúmulo de mitocôndrias anormais [ ,,,0],20,25]. Usando ferramentas de bioinformática, que demonstraram recentemente que as mutações do mtDNA alta patogenicidade, nomeadamente em genes para Complexo I, levar ao fenótipo oncocítico [21].

As variantes do translocase de Inner Membrana Mitocondrial 44 homólogo (TIMM44) que é parte do sistema de importação da proteína mitocondrial, também foram descritos em formas familiares de tumores da tiróide oncocíticas; isso sugere que a desregulação da maquinaria mitocondrial de importação e, consequentemente, da função mitocondrial estão associados a biogênese mitocondrial anormal [26].

Uma característica marcante das mitocôndrias acumulados em tumores de células oncocíticas é a sua ultra-estrutura anormal e morfologia. Isso indica uma desregulamentação também nas proteínas que controlam dinâmica mitocondrial, as proteínas “-shaping mitocôndrias”, um processo dependente de fusão mitocondrial e fissão e indissociavelmente ligada à biogênese mitocondrial, distribuição, sinalização e a apoptose [27,28,29]. Curiosamente, desequilíbrio do fenótipo mitocôndrias para a fragmentação orquestra a capacidade migratório em células onde a migração representa uma função fisiológica importante, tais como linfócitos de células T e de células tumorais metastáticas [30,31]. Na verdade, a fim de fazer o movimento possível, mitocôndria precisa ser fragmentado para favorecer a sua relocalização e ao recrutamento para regiões subcelulares específicos. No caso de células tumorais, uma correlação directa foi demonstrada entre o grau metastático e a fragmentação dependente de Drp1 de mitocôndrias no cancro da mama [31]. fissão mitocondrial requer a dynamin citosólica proteína relacionada 1 (Drp1) e seus receptores mitocondriais fissão 1 (Fis1), fator de fissão mitocondrial (QFP) e divisão mitocondrial (Mid) 49 e 51. Por outro lado, o mitofusin membrana externa (NMF) 1 e 2 e a membrana interna atrofia óptica proteína dynamin-like 1 (OPA1), mediar a fusão mitocondrial [32,33]. Apesar das alterações morfológicas mitocondriais conhecidos observados em tumores de células oncocíticas, o conhecimento sobre os níveis eo papel destas proteínas mitocôndrias-shaping é escasso. Por isso, começaram a investigar se dinâmica mitocondrial é alterada em tumores de células da tiróide oncocíticas. Nossos dados indicam que as proteínas de fissão mitocondrial Drp1 e Fis1 são sobre-expressos em tumores de células oncocíticas, e que os níveis de expressão Drp1 se correlaciona com a malignidade do tumor de células oncocítico

ex vivo

e com a capacidade de migração de uma linha de células de tumor da tireóide oncocítico

in vitro

. Curiosamente, o bloqueio genética e farmacológica de Drp1 reduz a migração da linha de células de tumor oncocítico, oferecendo uma nova abordagem terapêutica para combater tumores de células oncocíticas metastáticos.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

o presente estudo foi realizado sob a lei ética e reguladora nacional para o uso de espécimes biológicos. O material utilizado neste estudo vem do “Banco de Tecidos e Tumores” (tumores e tecidos Bank) do Hospital de São João, Porto, que recolhe todas as amostras mediante consentimento informado por escrito dos pacientes, ou de seus responsáveis ​​em caso de menores. Para ter acesso a estas amostras, os pesquisadores devem apresentar um projecto ao Comité do Hospital de São João de Ética para aprovação. Nosso projeto foi aprovado.

A seleção dos pacientes

Uma série de 88 tumores da tiróide foram recuperados dos arquivos do Departamento de Patologia do Hospital S. João (HSJ), Porto. amostras de tireóide foram obtidas de pacientes com idades variando de 15 a 83 anos de idade. A histologia de todas as amostras de tumor foi revisto de forma independente por dois patologistas (ER e MSS) e a classificação final foi feita de acordo com os critérios da OMS [34]. O diagnóstico de tumores da tiróide foram os seguintes: adenoma da tiróide folicular (FA, n = 19; 12 oncocítico e 7 não oncocítico), carcinoma da tiróide folicular (FTC, n = 7; 1 oncocítico e seis não-oncocítico), variante folicular de carcinoma de tireóide papilar (FVPTC, n = 30; 8 oncocítico e 22 não-oncocítico), carcinoma papilar da tireóide convencional (CPTC, n = 32; 9 oncocítico e 23 não-oncocítico).

Devido ao curto acompanhamento dos casos incluídos nesta série e ao número limitado de eventos consequente morte, a sobrevida global não foi analisada. O presente estudo foi realizado sob a lei ética e reguladora nacional para o uso de espécimes biológicos.

Tissue Microarray (TMA)

áreas representativas de diferentes lesões foram cuidadosamente selecionados em hematoxilina e eosina-manchadas secções e foram marcadas em blocos de parafina individuais. Dois fragmentos de tecido (3 mm de diâmetro cada) foram obtidos a partir de todos os espécimes foram seleccionados e precisamente depositado em duplicado blocos TMA parafina receptor utilizando um instrumento de tecido-matriz (Beecher Instruments, Silver Spring, MD) como descrito noutro local [35]. Em cada bloco tissue microarray, áreas de tecido tireoidiano não-neoplásica também foram incluídos como controles. Várias 3 mm secções foram cortadas a partir dos blocos de TMA e transferido para ultrafrost slides.

A análise imunohistoquímica

Análise imuno-histoquímica (IHQ) foi realizada em secções 3 um formalina-fixados, embebidos em parafina. As secções foram desparafinadas e re-hidratadas numa série de concentrações decrescentes de soluções de etanol. Desparafinadas espécimes individuais, bem como secções TMA foram sujeitos a induzida pelo calor de recuperação de antigénio, quer em 10 mM de pH 6 tampão de citrato (citrato de sódio) ou em 1 mM pH 8 tampão de ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA) (LabVision Corporation, Fremont, CA, EUA), numa microondas fixado em 300watts durante 10 minutos.

Depois de soluções de recuperação ter arrefecido, os tecidos foram sujeitos durante 10 minutos para bloquear a peroxidase endógena de actividade e de ligação não específica com 3% de H

2O

2 e com o grande volume ultra V Bloco reagente (Thermo Scientific /Lab Vision, Fremont, EUA), dependendo do sistema de detecção utilizado.

as secções foram então incubadas numa câmara humidificada com os seguintes anticorpos primários e consequentemente com as especificações do fabricante: anticorpo policlonal de coelho específico para Fis1 (1: 100) Ref. ALX-210-907 de Alexis Biochemicals, agora Enzo Life Sciences (Farmingdale, Nova Iorque, EUA), anticorpo monoclonal específico para Drp1 (1: 100) ref. 611.112 e o anticorpo monoclonal de ratinho específico para OPA1 (1: 100) Ref. 612.607, ambos da BD Biosciences (Franklin Lakes, New Jersey, EUA), anticorpo policlonal de coelho específico para Mfn1 (1: 250) Ref. SC-50330 (Santa Cruz Biotechnology Santa Cruz, EUA), anticorpo monoclonal de ratinho específico para MFN2 (1: 400) Ref. 9927-M03 de Abnova, (Jhongli City, Taiwan). Como um controlo para o anticorpo policlonal de ratinho específica para o conteúdo mitocondrial SdhA (1: 2000) ref. MS203, de Mitosciences, Abcam agora (Cambridge, Reino Unido) foi utilizada. Foram incluídos controlos positivos previamente testados de tiróide, mama e músculo para todos os anticorpos da série. Os controlos negativos foram realizados substituindo o anticorpo primário com soro não imune rato.

A técnica de imuno-histoquímica foi realizada utilizando um sistema de estreptavidina-biotina marcado com detecção de imunoperoxidase (Thermo Scientific /Lab Vision, Fremont, EUA) ou o L Envision /2 Sistema /AP (K5355, Dako, Dinamarca) de acordo com as instruções do fabricante.

para MFN1 e SdhA a coloração imuno-histoquímica foi desenvolvida com DAB (3,3′-diaminobenzidina) substrato. Para os restantes anticorpos a imunocoloração foi realizada com ou o /2 Sistema Envision L /PA (K5355, Dako, Dinamarca), e as amostras foram desenvolvidas com um cromogénio vermelho permanente.

A imunocoloração foi cegamente semi-quantitativamente avaliada por dois observadores (VM e AFS) sem conhecimento de qualquer informação clínica dos casos; uma pontuação IHC foi obtida através da soma da intensidade de coloração (0- ausente; 1- fraco; 2- moderada; 3- forte) pela extensão das células tumorais coradas (1-0 a 25%; 2-25 a 50% ; 3-50 a 75%; 4- 75%). A avaliação da percentagem de células imunorreactivas para todos os anticorpos foi feita pela contagem de 300 células de tumor em campos aleatórios. Em todos os casos discrepantes foi alcançado um consenso. Como marcador mitocondrial, e como um meio para avaliar a quantidade de mitocôndrias, os níveis de expressão foram SdhA acedida e utilizada para normalizar os resultados. Em cada amostra, foi comparada a expressão das proteínas de interesse, tanto em tecido normal e de tumor, contra as manchas SdhA. Assim, para cada caso, que foram capazes de avaliar de um modo individual e precisa as alterações na expressão da proteína no estudo, independentemente da quantidade de mitocôndrias, indicados pela expressão SdhA.

As linhas celulares

linhas celulares de cancro da tiróide: TPC1 (gentilmente cedidas pelo Dumont JE e Mareel M-National cancer Research Institute Center, Tóquio, Japão), uma linha de células PTC-derivada, e XTC.UC1 (de Wong MG e Savagner F- Serviço de cirurgia, Veterans Affairs Medical Center, San Francisco, Califórnia), uma linha celular obtida a partir de uma variante de oncocítico carcinoma folicular, foram utilizados neste estudo. Ambas as linhas celulares tinham sido anteriormente caracterizados ao nível molecular e genotípica [36,37]. células TPC1 foram cultivadas com meio RPMI com Glutamax suplementado com 10% (v /v) de soro fetal de bovino (FBS), 1% (v /v) Pen Strep e 0,5% (v /v) de fungizona (todos da GIBCO, Invitrogen, Carlsbad, EUA); XTC.UC1 foi mantida com DMEM /F12 (Gibco, Invitrogen, Carlsbad, EUA) suplementado com 10% (v /v) de FBS, insulina em 10 ug /ml, 10 mU de TSH em /ml (Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA ), 1% Pen Strep (v /v) e 0,5% (v /v) de fungizona. Ambas as linhas celulares foram autenticados por meio de análise de perfis de ADN, obtidas com o sistema PowerPlex 16 (Promega, Madison, EUA), de acordo com os perfis de ADN disponíveis em American Type Culture Collection e Saúde Ciência Research Resource Bank.

Constrói e transfections

citoplasmática GFP (ctGFP), direccionado para as mitocôndrias dsRed (mtRFP), direccionado para as mitocôndrias YFP (mtYFP) e plasmídeos pcDNA3.1-HA-K38A-Drp1 foram descritos anteriormente e eram um presente de T. Pozzan (Venetian Instituto de Medicina Molecular, Pádua, Itália) [33]. O pcDNA3.1 vazio foi obtido de Clontech e BD-geração plasmídeo pcDNA3.1-HA-K38A Drp1 foi previamente descrito [33]. XTC.UC1 linhas celulares foram transfectadas transientemente por electroporação utilizando o Sistema de Transfecção de néon (Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA). Em co-transfecções experimentos, 1.5μg da transportadora marcador (ctGFP em transpo� experimentos) mais 3 ug de pcDNA 3.1 ou pcDNA3.1-HA-K38A-Drp1 foram usados ​​por 2,0×10

6 células. A combinação específica de plasmídeos transfectados em cada experiência é indicado nas legendas das figuras. Após 24 horas, as células transfectadas foram classificadas por FACS e usado para experimentos 24h depois.

Quantitative PCR

Para a preparação de cDNA, 1 ng de RNA total foi de transcrição reversa utilizando o kit de síntese de cDNA da primeira cadeia RevertAid ( Fermentas, Burlington, ON, Canadá). produtos de transcrição reversa foram amplificadas para todos os genes acima mencionados por qPCR utilizando TaqMan PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). Para análise dos dados

actina

e

hCyclophilin

foram usados ​​como controles endógenos (dados mostrados apenas para actina). Os dados são expressos como a expressão relativa de cada gene indivíduo normalizados para os controlos correspondentes.

O ABI Prism 7500 Sequence Detection System rápida (Applied Biosystems) foi utilizado para detectar o nível de amplificação e foi programado para um passo inicial de dois min a 50 ° C, 10 min a 95 ° C, seguido de 45 ciclos de 95 ° C durante 15 seg e 60 ° C durante 1 min. 50 ng de cDNA para cada uma das amostras foi usada e todas as amplificações foram realizadas em triplicado. A quantificação relativa de genes alvo foi determinada utilizando o método ΔΔCT, que foi previamente validado por Linear Método de Livak Regressão (slope¼0.0696) (Detector Sequence Boletim usuário 2; Applied Biosystems).

fracionamento subcelular e immunoblotting

fraccionamento subcelular foi efectuada como descrito no Frezza

et ai. [38]. fracções mitocondriais e citosólicas foram obtidos e foram colocados a hibridar com um anticorpo monoclonal de ratinho anti-TOM20 (1: 5000) ref. FL-145 (Santa Cruz Biotechnology Santa Cruz, EUA) e um anticorpo policlonal de cabra anti-actina (1: 2000) sc1616 Ref (Santa Cruz Biotechnology Santa Cruz, EUA). As células foram lisadas em tampão RIPA, na presença de inibidores de fosfatase e protease. Quantidades semelhantes de proteína total foram resolvidas por SDS-PAGE e transferidos para uma membrana de nitrocelulose (GE Healthcare, Little Chalfont, Inglaterra). Foi utilizado como anticorpos primários, as já referidas na secção de imuno-histoquímica (todos a uma diluição de 1: 1000). Para a detecção da proteína, foram usadas um anticorpo conjugado com peroxidase de rábano-secundário (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, EUA) e um sistema de luminescência (Perkin-Elmer, Foster City, EUA). As membranas foram re-sondada com um anticorpo monoclonal de ratinho anti-TOM20 (1: 5000) ref. FL-145 (Santa Cruz Biotechnology Santa Cruz, EUA) para o controlo da carga de proteína. a expressão da proteína foi quantificada usando o Bio-Rad Quantidade Um software de análise 1-D.

A microscopia eletrônica

As células foram preparadas usando um procedimento de fixação de microscopia eletrônica convencional e imagens foram tiradas usando uma technai 20 ( FEI, Eindhoven, Holanda). As diferenças de tamanho entre mitocôndria linhas celulares foram calculados usando toda a área de superfície mitocôndrias. Um mínimo de 15 mitocôndrias foram medidos por célula e pelo menos 5 células diferentes por amostra foram usados ​​aleatoriamente para a medição de tamanho. Todos os experimentos foram realizados em triplicado.

imaging rede mitocondrial

Para quantificar a fragmentação da rede mitocondrial estrutural, as células foram cultivadas em placas com fundo de vidro, transfectadas com mitocondrial alvo proteína fluorescente amarela e vermelha, mtYFP e mtRFP respectivamente, e depois de 24h foram fixadas com gelada de 3,7% de formaldeído durante 30 minutos. As células que expressam mtRFP foram fotografadas com a Zeiss 510 META confocal a laser microscópio de varredura usando uma Plan-Apochromat objectivo 100 /1.46NA com um zoom digital 2x (excitação a 561 nm, emissão registrado acima 575nm. Para cada linha de células ou condição, pelo menos, 25 aleatoriamente células selecionadas foram fotografadas e quantificados de acordo com a sua rede mitocondrial. a Plan-Apochromat 100x (1.46NA) objetiva e zoom 2x foram usadas para células de imagem única. As imagens digitais foram processadas utilizando ImageJ 1,47 (US National Institutes of Health-NIH, Bethesda, MD, EUA).

ferida-scratch ensaio

As células foram cultivadas até perto confluência de 90% em 6 placas de poços. em condições assepticamente uma “ferida” fina foi introduzida por riscar com uma pipeta 10 ul células de ponta e destacados foram lavadas com PBS. usando um contraste de fase configurar e um 40x totais de ampliação fotos foram tiradas a cada 5 minutos para um total de 15 horas. cinco medidas diferentes por campo foram feitas usando as fotografias tiradas a 0, 3, 6 , 9, 12 e 15 horas usando software ImageJ. Informações mais detalhadas sobre esta metodologia foi publicado anteriormente [39]. As imagens foram processadas com o software ImageJ.

Ensaios

Migração /invasão

transfectadas transientemente TPC-1 e XTC.UC1 células foram ressuspensas em meio RPMI isento de soro e com DMEM /F12, respectivamente, com 0,1 % de FBS e semearam-se na câmara superior de um Transwell placa de 12 poços (Corning Costar). As placas Transwell foram pré-revestidas com 5 jig /mL de fibronectina (F2006-1MG, Sigma Aldrich) e incubou-se a 37 ° C, 5% de CO

2 durante 4 h. As placas foram então lavadas com PBS1x a pH 7,4 antes de adicionar as células 100.000 por poço. As câmaras inferiores foram cheias com o respectivo meio suplementado com FBS a 10%. Depois de 12 horas de ensaio, as membranas Transwell foram excisadas, invertida e coradas com DAPI numa lâmina de vidro. Os núcleos visíveis no lado voltado para baixo da membrana foram contadas. Um mínimo de 5 campos diferentes foram contados para cada slide e uma triplicado foi feito para cada configuração experimental. Mdivi1 inibidor foi utilizado a 50 uM com base em dados publicados anteriormente, e na ausência de alterações celulares tóxicos observáveis ​​ou stress [40]. Não foram encontradas diferenças entre as células tratadas com Mdivi1 do tempo zero ou 1 hora de pré-tratadas antes do início do ensaio.

A análise estatística

A análise estatística dos resultados IHC foi realizada com VISTA STAT -J 5.0 (SAS Institute, Inc., Cary, NC). A relação entre o nível médio de expressão (score) dos marcadores imuno-histoquímica e da histopatologia dos diferentes casos foram avaliados por análise de variância; resultados foram considerados estatisticamente significativos quando p valor 0,05. Quando adequado, várias correções de comparação foram realizadas utilizando o teste post hoc de Bonferroni /Dunn e, após a indicação do programa, as comparações só foram considerados significativos quando p valor 0,0018.

cada

análise in vitro

foi realizada pelo menos em triplicado e a média obtida deste modo foi utilizado para o teste t de Student independente. Todos os dados são expressos como média ± SE, tal como indicado nas legendas das figuras.

Resultados

MFN2, OPA1, Drp1 e Fis1, são sobre-expressos em tumores de células oncocíticas e Drp1 superexpressão é associado a tumores de células malignas oncocíticas

os chamados “mitocôndrias-shaping” proteínas são fundamentais reguladores da forma mitocôndria e de sua dinâmica. A rede mitocondrial, na verdade, é definida pelo equilíbrio altamente regulada entre os processos de fusão e de cisão, dependendo das necessidades fisiológicas da célula. Entre os vários processos celulares e condições fisiopatológicas, as proteínas de formação de mitocôndrias também actuar sobre a homeostase do tamanho e número de organelos [4,28,29,32]. Uma vez que os tumores de células oncocíticas diferem dos não-ococytic por uma acumulação anormal de mitocôndrias com uma morfologia alterada no citoplasma da célula, a hipótese de que dinâmica mitocondrial pode ter um papel na definição fenotípica e oncocítico fisiológica [11,12,13] . Assim, temos realizado uma análise histológica dos principais níveis de proteína “mitocôndria-shaping” em várias amostras de tumores da tiróide humanos histológicas. Fig 1 mostra micrografias imunocoloração representativas das proteínas “mitocôndria-shaping” observados em diferentes tipos histológicos de tumores da tiróide, incluindo um carcinoma folicular da tiróide oncocítico (FTC), 6 não oncocítico FTC, 8 variante folicular oncocítico de carcinoma papilífero de tireóide (FVPTC) , 22 FVPTC não oncocítico, 9 oncocítico convencional carcinoma papilar da tireóide (CPTC), 23 não-oncocítico CPTC, 12 oncocítico adenoma folicular da tiróide (FA) e 7 não-oncocítico FA. IHC micrografias representante de uma lesão oncocítico benigna (OFA), uma lesão maligna oncocítico (OPTC) e uma lesão oncocítico não (o noFVPTC), os histotipos de interesse principal neste trabalho, são apresentados na Figura 1A, 1B e 1C. Uma vez que a expressão de proteínas de mitocôndrias “formar” no parênquima adjacente normal foi de zero, ou só podem ser detectados a seguir a pontuação 2, que omitida nos histogramas os níveis de expressão de tais proteínas no tecido normal. Com a excepção de Mfn1, identificamos um aumento nos níveis de expressão de outras proteínas estudados, os tumores de células em oncocíticas

vs. os não-oncocíticas e em todos os quatro histo-tipos analisados ​​(FVPTC, FTC, CPTC e FA) (Figuras 1 e 2A).

micrografias representativas mostrando imunocoloração de anticorpos Mfn1, MFN2, OPA1, Drp1 e Fis1 no tecido normal da tireóide (NT) e tecido tumoral de um oncocítico folicular adenoma-OFA) (a), um oncocítico papilar da tiróide carcinoma-OPTC (B) e uma variante folicular não-oncocítico de papilar da tiróide carcinoma-noFVPTV (C) em um ampliação total de 300x. setas pretas ilustrativos denotam manchado medida áreas tumorais com uma maior gradação de noFVPTV, a OFA e, finalmente, OFTC. “# Mfn1-Mitofusin 1, MFN2-Mitofusin 2, atrofia OPA1-Optic 1, Drp1-Dynamin proteína relacionada 1, fissão Fis1-mitocondrial 1 proteína.

foi avaliada a imunocoramento Mfn1, MFN2, OPA1, Drp1 e Fis1, tendo em conta todos os tumores da tiróide (a e B), os tumores da tiróide oncocítico sozinho (C) ou a não tumores da tiróide -oncocytic sozinho (D). A expressão do antigénio média foi calculada como descrito em Material e Métodos. Os resultados são apresentados como pontuação média ± SEM. * P 0,05 (teste t desemparelhado). # Mfn1-Mitofusin 1, MFN2-Mitofusin 2, atrofia OPA1-Optic 1, Drp1-Dynamin proteína relacionada 1, Fis1-mitocondrial fissão 1 proteína.

MFN2 eo Drp1 pro-fissão são significativamente overexpressed em oncocytomas malignas

em uma análise mais profunda das amostras histológicas de tumores da tiróide humanos, Mfn1 foi a única proteína mitocôndrias-shaping para mostrar nenhuma diferença significativa nos níveis de expressão, independentemente do fenótipo ou tipos tumorais comparação (Fig 2A-2D). Um aumento global dos níveis de outras proteínas analisadas, independentemente da sua pró-fusão ou papel pro-fissão, foram todos significativamente maior nos tumores oncocíticas em comparação com em que os não-oncocíticas (4,2 ± 0,2

vs

2,9 ± 0,2, p 0,0001 para MFN2; 3,3 ± 0,3

vs

2,3 ± 0,2, p = 0,01 para OPA1;. 4,7 ± 0,2

vs

3,0 ± 0,2, p 0,0001 para Drp1; 4,9 ± 0,1

vs 3,5 ± 0,2, p . 0,0001 para Fis1), como mostrado na quantificação IHC da Fig 2A (Fig 2A). Em contraste, não houve diferença apreciável de qualquer destas proteínas, quando comparado maligna

vs. tumores benignos, sem distinção e agrupar as amostras em oncocítico ou não oncocítico (3,5 ± 0,2

vs

3,0 ± 0,3, p = 0,31 para MFN2;.. 2,8 ± 0,2

vs

2,3 ± 0,4, p = 0,28 para OPA1; 3,8 ± 0,2

vs

3,5 ± 0,4, p = 0,48 para Drp1;.. 4.1 ± 0.1

vs

3,9 ± 0,34, p = 0,71 para Fis1) (Figura 2B). Portanto, parece que a alteração da máquina responsável pela morfologia mitocondrial é estritamente relacionada com o fenótipo oncocítico, em vez de para a agressividade do tumor total. Além disso, dentro dos tumores não oncocíticas não foram encontradas diferenças nos níveis de proteínas dinâmica mitocondrial expressão entre tumores benignos e malignos (Fig 2D). No entanto, se considerarmos o grau de severidade do tumor, apenas no fenótipo oncocítico, curiosamente observamos que MFN2 Drp1 e são significativamente mais abundante em carcinomas em comparação com os das contrapartes adenomas benignos (4,5 ± 0,2

vs

. 3,4 ± 0,4, p = 0,012 para MFN2 e 5,1 ± 0,2

vs

. 4.0 ± 0,5, p = 0,038 para Drp1 (Fig 2C). de notar que estas diferenças não são relacionadas com diferenças no número mitocondrial ( S1 Fig). Isto sugere que, dentro de tumores de células oncocíticas, a dinâmica mitocondrial assumir um papel na definição de malignidade do tumor e agressividade.

Drp1 acumula activamente nas mitocôndrias e rede mitocondrial desequilíbrio à fissão

a fim de esclarecer e investigar em profundidade o papel da dinâmica mitocondrial alteração em tumores de células oncocíticas, nós transferido para

in vitro

experimentos em linhas celulares de cancro da tiróide dois: XTC.UC1, que é a única linha de células oncocítico disponível, com derivação de carcinoma, e TPC1, uma linha de células da tiróide não oncocítico, utilizados para fins comparativos. Em primeiro lugar, foi avaliada nas duas linhas de células ao nível das mesmas proteínas de fusão /fissão estudados nas amostras tumorais humanas expressão.

por análise Western blot, foram detectados, na linha celular oncocítico, a mesma tendência de As barras de erro representam SEM. * P