Abstract

Fundo e visa

cancro colorectal (CRC) desenvolvimento esporádica é um processo sequencial mostrando idade-dependência, descontrolada proliferação epitelial e diminuição da apoptose. Durante a proliferação celular e o crescimento juvenil apoptose são bem equilibrado, o qual pode ser perturbado durante o envelhecimento. Nosso objetivo foi correlacionar as atividades de proliferação e de apoptose no envelhecimento epitélio do cólon humano e cancro colorectal. Nós também testamos a biologia molecular subjacente relativo à proliferation- e alterações de expressão gênica reguladoras da apoptose.

Materiais e Métodos

biópsias colorretais de crianças saudáveis ​​(n

1 = 14), saudável adultos (n

2 = 10), adenomas adultos (n

3 = 10) e CRCs (N

4 = 10) em adultos foram testados para o Ki-67 imuno-histoquímica e ensaio de apoptose de TUNEL. Mitosis- e expressão de genes relacionados com a apoptose também foi estudado em crianças saudáveis ​​(n

1 = 6), adultos (n

2 = 41) amostras e em CRC (n

3 = 34) em HGU133plus2. 0 plataforma de microarray. alterações medidos foram confirmadas por RT-PCR com ambos em conjuntos de amostras dependentes e independentes (N

1 = 6, N

2 = 6, N

3 = 6).

Resultados

índice mitótico (IM) foi significativamente maior (p 0,05) em juvenis intacta (MI = 0,33 ± 0,06) e as amostras de CRC (MI = 0,42 ± 0,10) em comparação com amostras de adultos saudáveis ​​(MI = 0,15 ± 0,06). Em contraste, índice apoptótico (IA) foi diminuída em crianças (0,13 ± 0,06) e significativamente inferior no cancro (0,06 ± 0,03) em comparação com amostras de adultos saudáveis ​​(0,17 ± 0,05). Oito proliferation- (por exemplo MKI67, CCNE1) e 11 genes associados a apoptose (por exemplo TNFSF10, IFI6) tinha alterado a expressão de ARNm tanto no decurso do envelhecimento normal e carcinogénese, principalmente da indução da proliferação e redução da apoptose comparados com os adultos saudáveis. Oito genes associados à proliferação incluindo CCND1, CDK1, CDK6 e 26 genes reguladoras da apoptose (por exemplo SOCS3) foram diferentemente expressas entre os grupos juvenis e de câncer de apoio na maior parte do crescimento celular pronunciado no CRC.

Conclusão

amostras colorrectais de crianças e pacientes de CRC pode ser caracterizada por um aumento semelhante proliferativa e diminuiu as actividades apoptóticas em comparação com amostras de cólon saudáveis ​​de adultos. Portanto, alterações cinético de células durante o desenvolvimento do câncer colorretal mostrar rejuvenescimento descontrolada em oposição ao crescimento celular controlado no epitélio do cólon juvenil

Citation:. Leiszter K, Galamb O, Sipos F, Krenács T, Veres G, Wichmann B, et ai. (2013) esporádica Desenvolvimento Câncer Colorretal Mostra Rejuvenescimento Quanto epitelial proliferação e apoptose. PLoS ONE 8 (10): e74140. doi: 10.1371 /journal.pone.0074140

editor: Ming Tat Ling, Universidade de Tecnologia de Queensland, Austrália |

Recebido: 19 Março, 2013; Aceito: 29 de julho de 2013; Publicação: 03 de outubro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Leiszter et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por húngaro Fundo de Investigação Científica (Országos Tudományos Kutatási Alapprogram /OTKA-K /) 105530. os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito.

Conflito de interesses: os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a renovação celular normal do epitélio do cólon saudável leva cerca de 5 dias, por meio de proliferação, diferenciação e apoptose.. A localização dos diferentes tipos de células epiteliais nas criptas é muito típica. As células em proliferação residir principalmente na base das criptas, células diferenciadas, na zona média, enquanto que as células apoptóticas são perto da superfície luminal. Várias vias moleculares desempenham papel importante na auto-renovação fisiológico das células epiteliais do intestino grosso humano [1] – [4].

No entanto, a regulamentação dos mecanismos de proliferação e de apoptose pode alterar durante o envelhecimento normal e colorretal carcinogênese. O envelhecimento é um mecanismo fisiológico que começa após a concepção. Ela afeta quase todas as células do organismo com a possível exceção de células estaminais e células tumorais. alterações macroscópicas e microscópicas estão presentes no tracto gastrointestinal de envelhecimento, incluindo o intestino grosso [5] – [6]. Alterações na actividade proliferativa, no decurso do envelhecimento ter sido analisados ​​em modelos animais em estudos anteriores [7] – [8]. De acordo com os resultados de

Mandir et al

, a regeneração epitelial mais intenso (de proliferação e apoptose) foi comprovada em ratos jovens.; e os autores concluíram que as mudanças dramáticas na jovem epitélio do cólon pode estar relacionado ao desenvolvimento intestinal. No entanto, o envelhecimento gastrointestinal normal, não tem efeito sobre a renovação epitelial [7]. Pelo contrário, em populações animais envelhecidos aumento da proliferação celular e diminuição da apoptose em epitélio do cólon foi observada e considerada para facilitar a proliferação celular descontrolada e a tumorigénese, o que pode explicar a maior incidência de cancro colorrectal nos humanos idosos [8].

Além disso, algumas destas alterações, pode também estar relacionado com a carcinogénese colorectal. Alterações no crescimento de células epiteliais e da morte celular programada também foram anteriormente estudadas em diferentes fases da carcinogénese colorectal, mas os resultados não são concordantes. A proliferação celular e apoptose pode tornar-se desregulado ea produção e célula perda desequilibrada determinar o comportamento do pré-malignas ou malignas distúrbios e crescimento do tumor [9] – [12]

A taxa de detecção de adenomas ea incidência de avançado. adenomas colorretais e câncer continuamente elevar após a idade de 40-50, mostrando forte dependência dos idosos [13] – [14]. cancros do cólon esporádicos vir principalmente na população idosa semelhante a inúmeras lesões neoplásicas e pré-cancerosas. De acordo com o modelo Vogelstein [15], se desenvolve cancro colorrectal a partir de adenoma epitélio normal através de pré-malignas em um processo multi-passo que leva vários anos. Além dos genes (por exemplo, APC, KRAS, DCC e TP53) tradicionalmente implicados neste modelo de progressão do cancro, recentemente novos genes com alteração da expressão de mRNA também têm sido sugeridos para ser contribuir para a transformação maligna de epitélio colorrectal [16] – [18].

Existem várias alterações genéticas e epigenéticas que possam demonstrar uma possível relação entre envelhecimento e carcinogênese colorretal. A acumulação de mutações no DNA e danos, hipermetilação do promotor, alterações na reparação do DNA, a atividade da telomerase e metabolismo celular pode afetar cada vez mais populações idosas que levam à proliferação celular elevada e diminuição da apoptose, que pode culminar com a transformação maligna e proliferação descontrolada de células [19].

ao mesmo tempo, vários estudos em humanos e animais revelaram a regulação oposta de algumas vias moleculares durante o envelhecimento normal e carcinogénese. Ao contrário de envelhecimento normal, as células cancerosas proliferam mostram um aumento no metabolismo, caracterizado por actividade proliferativa contínua e desdiferenciação, eles podem produzir proteínas embrionárias e são potencialmente imortais por escapar apoptose [20]. Em particular, as proteínas reguladoras da apoptose mostram a expressão distinta em células senescentes e cancerosas existentes pela regulação negativa do tumor proteína indutora de apoptose supressor p53 [21] e a proteína Fas /CD95 [22] e a sobre-expressão de anti-apoptótica do proto-oncogene Bcl-2 no cancro, em oposição às células normais envelhecimento [23] – [25]. Os oncogenes Ras, tais como, por exemplo, factores de transcrição receptores de tirosina-quinase Myc e crescimento sinal de transdução-relacionadas por exemplo membros da família de EGFR são regulados positivamente em alguns tipos de cancro, enquanto regulados negativamente em células senescentes [26] – [28]

desenvolvimento do cancro pode ser considerado como um local “rejuvenescimento”, não controlada utilizando as mesmas vias moleculares. mas com oposição regulamentação. Desregulados proliferação celular e apoptose vias pode permitir vantagens de sobrevivência para as células cancerosas contra células senescentes adjacentes, devido à capacidade perdida de câncer para o envelhecimento normal [20]. O aumento da proliferação de células epiteliais no tracto gastrointestinal pode ser visto não só para o cancro colorectal, mas também no desenvolvimento embrionário e juvenil. Uma via essencial que desempenha um papel fundamental tanto no desenvolvimento do intestino e em cânceres colorretais esporádicos ou familiares é o Wnt /β-catenina sinalização [29] – [30].

Como sabemos, não há nenhum estudo com foco na regulação da proliferação e apoptose no epitélio colorrectal humano juvenil em relação ao envelhecimento normal e carcinogênese. O objectivo deste estudo foi analisar a actividade proliferativa e apoptose em epitélio do cólon humano, no decurso do envelhecimento normal e carcinogénese colorectal tanto no nível de expressão da proteína e do gene. biópsias colorectal que representam a fase de crescimento controlado juvenil, o estado de saúde de adultos e o desenvolvimento do câncer colorretal descontrolada foram testados para possíveis correlações.

Materiais e Métodos

Pacientes e amostras

Depois consentimento informado, amostras de biópsia colorretais foram tomadas durante a intervenção endoscópica de rotina no 2º Departamento de Medicina interna e 1º Departamento de Pediatria, Universidade Semmelweis, em Budapeste, Hungria. Ao todo, 44 ​​amostras de tecidos foram analisados ​​no estudo imuno-histoquímico (14 crianças saudáveis, 10 adultos saudáveis, 10 adenomas de adultos e 10 CRCs de adultos); 81 amostras de biópsia foram analisados ​​na análise de microarray (6 crianças saudáveis, 41 adultos saudáveis ​​e 34 CRCs de adultos); e 36 amostras de biopsia estavam envolvidos na validação de PCR em tempo real (12, 12 crianças saudáveis ​​adultos saudáveis ​​e 12 CRCs de adultos). Setenta e cinco microarrays (as amostras de adultos) foram hibridizadas mais cedo; os seus ficheiros de dados foram utilizados numa estudos anteriormente publicados utilizando comparações diferentes [31] – [32] e está disponível na base de dados Gene Expession Omnibus (número de acesso série: GSE10714 e GSE37364). Os conjuntos de dados dos recém-hibridizaram 6 microarrays são registrados no número de acesso de série GSE37267. crianças do grupo controle foram encaminhados ao ambulatório com sangramento retal, constipação ou dor abdominal crônica. Ileocolonoscopia era parte de seu procedimento de diagnóstico (excluir a doença orgânica) e as amostras de biópsia mostrou aspecto macroscópico normal e histologia. Cada espécime foi verificada por histopathologists.

Para imunohistoquímica amostras de biópsia colorretais foram rotineiramente fixado em formol e embebido em cera de parafina. Para os estudos de mARN, as amostras foram armazenadas em colonoscopia RNAlater Reagent (Qiagen Inc., Germantown, EUA) a -80 ° C antes da extracção do ARN total para análise de expressão génica e Taqman estudo por RT-PCR. aprovações éticas (Nr .: 69/2008 e 202/2009) para este estudo foram emitidas pelo Comitê Institucional de Ciência Regional e Ética e Pesquisa da Universidade de Semmelweis (Budapeste, Hungria). consentimento informado por escrito foi obtido com antecedência de todos os participantes adultos e para os familiares, cuidadores, ou responsáveis ​​sobre o nome dos menores /crianças aprovados pelos comitês de ética. especificação correlação clínica detalhada das amostras dos pacientes estão resumidos na

Table 1 | e

Tabela 2

.

Imuno-histoquímica para a proliferação de células

amostras arquivadas de 14 biópsias de cólon histologicamente normais de crianças, 10 biópsias normais do cólon de adultos, bem como 10 adenomas adultos e 10 CRCs foram coletados durante a endoscopia de rotina. 1 núcleos mm de diâmetro foram perfurados a partir de blocos de parafina de amostras de adultos e reunidas em microarrays de tecido (TMA). Quatro mm de espessura de corte tanto da TMA e de crianças individuais amostras de biopsia foram desparafinados e re-hidratadas para a imunocoloração.

Depois de recuperação de antigénios em uma média de 9,0 tampão de tris-EDTA pH utilizando um forno de microondas a 900 W durante 10 min e em seguida, a 370 W, durante 40 min, o bloqueio da peroxidase endógena em peróxido de hidrogénio a 1% dissolvido em metanol e de sítios de ligação não específica usando 1% de albumina de soro de bovino durante 20 min cada, foram realizados. As lâminas foram incubadas com anticorpo monoclonal anti-Ki-67 anticorpo (clone: ​​MIB-1, 1:100, Dako, Glostrup, Dinamarca) durante 60 minutos numa câmara humidificada e em seguida com IgG anti-rato F (ab ‘)

2 Alexa Fluor 546 conjugado (1:200, Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) durante 30 min.

detecção de apoptose utilizando a TDT-mediada dUTP Nick End Labeling (TUNEL) ensaio

após a digestão com proteinase-K (20 ug /ml, 20 min), 50 ul de TUNEL (TUNEL In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein, Roche, 11684795910) mistura reaccional (enzima TdT 5 ul + 45 ul de dUTP) foi adicionado à cortes de tecido e slides do TMA. Em seguida, as amostras foram incubadas no escuro numa câmara humidificada a 37 ° C durante 120 minutos. os núcleos das células foram coradas com Hoechst (5 ul corante Hoechst + 10 ml de TBS, 1 min, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA).

Contagem de mitótico e índice de apoptose em lâminas digitais

amostras de biópsia manchado e lâminas TMA foram digitalizadas com um scanner digital de alta resolução (Pannoramic digitalização, 3DHISTECH Ltd. Budapeste, Hungria), utilizando a digitalização fluorescente multicamadas com uma abertura numérica elevada (0,8) × 20 lente objetiva e uma alta faixa dinâmica AxioCam mrm Rev.3 câmera preto-e-branco conectado ao scanner. lâminas digitais foram acessadas através de um monitor de computador e analisados ​​utilizando o software Pannoramic Viewer (versão 1.11.43.0). O módulo de software de marcador Contador resultando em anotações permanentes sobre as células contadas foi utilizado para estimar a proporção relativa de células proliferativas, apoptóticas e normais.

Ki-67, TUNEL e Hoechst positividade nuclear apareceu toda a rotulagem tão forte na slides. Dependendo do tamanho da amostra, 500-1000 células epiteliais foram contadas no longitudinais criptas bem orientadas. Nós determinamos a razão proliferativa-apoptótica (PAR: proporção de células de proliferação e de apoptose em criptas), o índice mitótico (IM: a proporção de células proliferativas e totais contadas células em criptas) eo índice de apoptose (AI: a proporção de apoptose e células totais contadas em criptas).

ARNm microarrays análise de expressão

o ARN total foi extraído utilizando RNeasy Mini Kit (Qiagen Inc., Germantown, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Quantidade de ARN isolado foi caracterizado medindo a absorvância (NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer, NanoDrop Technologies, Inc., Wilmington, EUA). Qualidade de ARN isolado foi testado com electroforese em gel capilar (2100Bioanalyzer e RNA 6000 Pico Kit /Agilent Inc., Santa Clara, CA, EUA /). As sondas de ARNc foram sintetizados biotinilado de 1 a 8 ug de ARN total e fragmentado utilizando o alvo de um ciclo de etiquetagem e de controlo Kit (https://www.affymetrix.com/support/downloads/manuals/expression_s2_manual.pdf), de acordo com a Affymetrix Descrição. Vinte microgramas de cada amostra de ARNc fragmentado foi hibridada em HGU133 Plus2.0 matriz (Affymetrix) a 45 ° C durante 16 h. As lâminas foram lavadas e coradas utilizando Fluídica Estação 450 e método de coloração de amplificação anticorpo de acordo com as instruções do fabricante. sinais fluorescentes foram detectadas por GeneChip Scanner 3000 (Affymetrix).

TaqMan RT-PCR

Depois de análise de expressão gênica por microarrays, os resultados foram comparados com outros dados definidos disponíveis no banco de dados Omnibus Gene Expression (http : //www.ncbi.nlm.nih.gov/geo; número de acesso série é GSE18105). TaqMan reacção em cadeia com polimerase foi utilizada para medir a expressão de ARNm de 12 genes seleccionados, participam na regulação do ciclo celular, proliferação ou apoptose, em originais (6 crianças histologicamente intactas, 6 adulto histologicamente intacta e 6 amostras de adultos CRC) e conjuntos independentes de amostras ( 6 crianças histologicamente intactas, 6 adultos histologicamente intacto, 6 amostras adultos CRC). 18S RNA ribossomal e GAPDH foram usados ​​como referência.

Total de controles de extração de RNA, qualidade e quantidade foram realizados conforme descrito anteriormente. Utilizando o ADNc de Alta Capacidade Transcrição Reversa Kit com RNase Inhibitor, 1 ug de ARN total por amostra foi transcrito de forma reversa (Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA). A qualidade do ADNc foi verificada por SdhA-PCR em tempo real (F. Hoffmann-La Roche Ltd., Basileia, Suíça). Então modelo de cDNA 16,7 ng por amostra foi utilizada para análise dos genes selecionados com Gene Expression TaqMan Mestre Mix (Life Technologies) expressão. A medição foi realizada em 480 LightCycler (Roche) com formato de detecção Mono Hidrólise Sonda /UPL sonda. Após desnaturação a 95 ° C durante 10 min, 40 ciclos de PCR foram realizadas (de amplificação a 95 ° C durante 15 seg, e a 60 ° C durante 1 min).

A avaliação estatística

para a análise estatística do Ki-67 imunocoloração e TUNEL resultados foram aplicados o teste ANOVA e Tukey HSD pós-teste. Em ambos os critérios de significância métodos foi de p . 0,05

Para a expressão de mRNA perfis das matrizes de expressão Affymetrix foram principalmente pré-processado pelo método de correção de fundo GCRMA com normalização quantil e sumarização polonês mediana. Análise SAM foi aplicado para determinação de genes proliferation- e reguladoras da apoptose com alteração da expressão do mRNA. Foram utilizados os seguintes critérios SAM: LogFC≥abs 1, valor-p 0,05. Todos estes genes foram comparados e os diferencialmente expressos foram adicionalmente investigadas. A expressão de cada gene seleccionado entre os diferentes grupos da amostra foi ainda analisada por ANOVA e pós-teste de Tukey HSD

Os conjuntos de dados estão disponíveis no banco de dados Omnibus Gene Expression (http:. //www.ncbi.nlm.nih .gov /geo /), números de acesso da série:. GSE10714, GSE37364 e GSE37267

Para a validação de PCR em tempo real, 12 amostras foram analisadas em cada etapa (crianças, saudáveis ​​/adultos normais e adultos CRCs). Para a normalização, 18S ARN ribossomal foi usado como controlo interno. Para a análise estatística foram aplicados ANOVA e teste de Tukey HSD pós-teste. Foram utilizados os seguintes critérios: Dobre change≤0.5 ou Fold change≥2 e valor de p 0,05

Resultados

proliferação e apoptose em juvenil, adulto normal, amostras de carcinoma de adenoma colorretal e

células epiteliais em proliferação foram predominantemente localizada na base das criptas, enquanto as células em apoptose foram próximas à superfície luminal na mucosa do cólon normal,

(

Figura 1 |

)

. rácio proliferativa-apoptótica (PAR: proporção de células epiteliais proliferativas e apoptóticos em criptas) e MI foram significativamente maiores em crianças (PAR = 3,51 ± 2,49; MI = 0,33 ± 0,06) e as amostras de CRC (PAR = 9,83 ± 7,72; MI = 0,42 ± 0,10) do que em amostras de adultos saudáveis ​​(RAP = 0,88 ± 0,22; IM = 0,15 ± 0,06) (p 0,05). Eles mostraram aumento contínuo no decurso da sequência de adenoma-carcinoma (ACS). PAR foi 3,99 vezes maior em crianças saudáveis ​​do epitélio do cólon e 11,17 vezes maior no CRC, em comparação com o epitélio adulto saudável; e PAR foi 2,8 vezes superior no CRC em contraste com as amostras juvenis. Com base em nossos resultados immunhistochemical, MI foi 2,2 vezes maior em crianças e 2,8 vezes maior em comparação CRC que a normal e saudável, e 1,27 vezes maior em CRC em contraste com amostras juvenis. A maior PAR e MI foram encontrados em amostras de câncer colorretal

(

Figura 2

)

.

pontos azuis representam os núcleos de células inativas. As imagens foram tiradas com microscópio digital: tecido normal criança (CH), tecido adulto normal (N), adenoma (Ad) e carcinoma (CRC) em adultos. atividade mitótica diminui durante o envelhecimento e aumenta durante a ACS em contraste com a atividade apoptótica.

PAR e diminuição MI durante o envelhecimento e aumento durante a carcinogênese, ao contrário do AI.

AI foi diminuída em amostras de crianças saudáveis ​​(0,13 ± 0,06) e significativamente inferior em amostras de cancro colorectal (0,06 ± 0,03) do que nas amostras histologicamente adultas intactas do cólon (0,17 ± 0,05) (p 0,05). AI mostrou diminuição contínua em paralelo com a ACS colorectal. índice apoptótico foi comprovada 0,76 vezes menor em crianças, e 0,35 vezes menor no CRC em comparação com amostras normais saudáveis; e foi 0,46 vezes menor em comparação com amostras de CRC juvenis. A menor AI foi detectado em amostras de câncer colorretal

(

Figura 1 |

–

2

).

As alterações significativas na atividade proliferativa não foi encontrado entre o adulto saudável mucosa do cólon (PAR = 0,88 ± 0,22; MI = 0,15 ± 0,06) e as amostras de adenoma (PAR = 1,45 ± 0,89; MI = 0,13 ± 0,05); enquanto que a AI verificou-se ser significativamente inferior em amostras de adenoma (Normal AI = 0,17 ± 0,05; Adenoma AI = 0,10 ± 0,04) (p 0,05).

A expressão de genes proliferation- e reguladoras da apoptose em juvenil , amostras normais adultos e colorectal carcinoma

expressão de mRNA de 117 genes que regulam a proliferação foram estudados em microarrays HGU133 Plus2.0. a expressão do gene de 5 sondas (pertencente a 4 genes) alteradas no decorrer do envelhecimento sozinho mucosa do cólon em histologicamente intacta; expressão de mRNA de 18 sondas (pertencentes a 13 genes) foram alterados durante a carcinogênese colorretal; e 11 sondas (pertencentes a 8 genes /BRCA1, CCNB1, CCNE1, CDC20, CDK1, CDKN2B, MKI67 e TFDP1 /) foram diferentemente expressas em ambos os grupos de amostras (

Figura

3A). Do mesmo modo, a expressão do gene de 534 genes reguladoras da apoptose também foi analisada neste estudo. a expressão de ARNm de 15 sondas (genes pertencentes a 9) alterados no decurso do envelhecimento sozinho na mucosa do cólon histologicamente intacta; 46 sondas (pertencentes a 32 genes) mostraram alterações durante carcinogênese colorretal; e 12 sondas (pertencentes a 11 genes /ACVR1B, BRCA1, CHEK2, DYRK2, IFI6, SERPINB9, SFRP1, SOCS3, SST, TNFSF10 e ZAK /) foram diferencialmente expressos em ambos os grupos de amostras

(

Figura 3B

)

.

no mapa de calor, o aumento da expressão do gene é representado com linhas vermelhas, enquanto que a diminuição da expressão de verde. Os primeiros 6 amostras com luz genes aparecem em azul em crianças, o azul escuro são de adultos saudáveis, enquanto as últimas amostras em verde são de pacientes com câncer.

alterações de expressão gênica entre juvenis e amostras de CRC

Proliferation- e genes de regulação da apoptose foi investigado para encontrar genes com expressão de mRNA diferente que pode explicar as diferenças entre a proliferação celular controlada e não controlada. Doze sondas pertencentes a 8 genes controlam proliferação (BCL2, CDKN2B, RAD9A, BRCA2, CCND1, CDK1, CDK6 e RBL1)

(

Figura 4A

)

e 26 genes reguladoras da apoptose (AIFM2, AIFM3, BTK, CIDEB, CIDEC, DAPK2, MAL, NLRP1 (LOC728392), SFRP1, SIVA1, SPN, SST, TR53I3, TNFRSF25, ANXA1, CBX4, CASP4, INHBA, MYC, PLAGL2, PMAIP1, POLB, PROK2, SOCS3, TNFRSF10B e ZAK) com 39 sondas

(

Figura 4B

)

mostrou alteração significativa entre as crianças e grupos do cancro, de acordo com o valor-p .

no mapa de calor, o aumento da expressão do gene é representado com linhas vermelhas, enquanto que a diminuição da expressão de verde. As amostras azul escuro são de crianças saudáveis ​​mucosa do cólon (Ch) e a luz azul são a partir de amostras de câncer colorretal (CRC).

Validação da expressão de genes utilizando TaqMan RT-PCR

expressão de mRNA de 10 genes, incluindo CDKN2B, MKI67, CDC2 /CDK1, CCNE1, ACVR1B, TNFSF10, DYRK2, SOCS3, IFI6 e SERPINB9 foram validados com TaqMan RT-PCR

(

Table 3

)

.

de acordo com os resultados da análise de microarray de genes que regulam a proliferação (CDKN2B, MKI67, CDC2 /CDK1 e CCNE1), alterações de expressão de mRNA significativas foram detectadas pelo valor do Dobre mudanças (FC≤0.5 ou FC≥2) ea ANOVA-teste (p 0,05) em crianças vs. normal e normal vs. comparações CRC; e estes resultados foram também confirmados com teste de Tukey-em caso de CDC2 /CDK1 e CCNE1. validação de PCR confirmou a tendência de alterações de expressão de genes em todos os casos em relação à regulação da proliferação. CDKN2B, MKI67, CDC2 /CDK1 e CCNE1 mostrou mudanças de expressão de mRNA significativas limítrofes nas comparações mencionadas anteriormente, de acordo com Dobre mudança. Tukey pós-teste recrutados alterações de expressão de genes durante o envelhecimento e carcinogênese colorretal em caso de CDC2 /CDK1 (p 0,05).

O número de genes de regulação da apoptose (ACVR1B, TNFSF10, DYRK2, SOCS3, IFI6 e SERPINB9) foram também analisados ​​por RT-PCR com. expressão gênica de ACVR1B, TNFSF10 e DYRK2 foi significativamente menor em crianças e amostras de CRC em relação ao adulto normal mucosa do cólon (FC≤0.5 ou FC≥2; p 0,05); e estes resultados foram validados por RT-PCR bem. De acordo com os resultados do estudo da Affymetrix, a expressão de ARNm de genes anti-apoptóticos, como SOCS3, IFI6 e SERPINB9, mostrou expressão significativamente mais elevada em crianças e amostras de CRC que, em comparação com amostras de cólon histologicamente intacta adultos. validação de PCR confirmou a tendência de alterações de expressão de genes entre crianças vs. adulto normal e adultos normais vs. CRC. ANOVA e teste de Tukey-análise dos resultados de RT-PCR tiver verificado estas alterações no caso de SOCS3 e IFI6 (p 0,05). mudanças de expressão dos genes escolhidos são resumidos no

Tabela 4

.

Discussão

O envelhecimento está associado com o aumento da incidência de neoplasias colorretais esporádicos, que é um dos principais causas de mortalidade nos países ocidentais [33]. O câncer colorretal é relacionado à proliferação celular descontrolada e apoptose desregulada. crescimento juvenil, por outro lado, caracteriza-se por um crescimento controlado, a proliferação celular e a apoptose [34].

Neste estudo, a actividade proliferativa e apoptose em epitélio colorrectal humano intacto a partir de crianças e adultos que em comparação com adenoma e cancro colorectal foi investigada. Expressão dos genes relacionados também foi testado em microarranjos de ARNm. Encontramos um aumento proliferativo e uma diminuição da atividade apoptótica em crianças e amostras de câncer em comparação com o epitélio adulto normal.

Estes resultados sugerem uma regulação molecular opostos de proliferação e apoptose durante o envelhecimento normal e carcinogênese colorretal. Reforçada a proliferação celular de células tumorais sem “envelhecimento” pode contribuir para a sua sobrevivência vantagem sobre as células senescentes adjacentes.

Um aumento da proliferação celular detectado em crianças mucosa retal podem ser relacionados com o crescimento fisiológico do intestino grosso no entanto, o renovação celular diminui durante o envelhecimento normal no adulto intacto cripta do cólon histologicamente. A proliferação celular e regulação da apoptose entre o crescimento controlado na infância e crescimento descontrolado no CRC não foram correlacionados antes na mucosa do cólon. Aqui encontramos vários genes promovendo a proliferação incluindo ciclina B1 /CCNB1 /, ciclina E1 /CCNE1 /e quinase dependente de ciclina (CDK1) a ser regulada positivamente tanto em amostras jovens e cancerosas em comparação com a mucosa normal de adulto (

A Figura 3

). Estes resultados correlacionam-se bem com a nossa descoberta de proliferação significativamente maior de células fracções em crianças e secções de tecido de cancro em comparação com amostras de adultos normais. CDKs, de facto, têm papel crucial na regulação do ciclo celular e crescimento em células eucarióticas. complexos de CDK são uma família altamente conservadas de proteínas quinases Ser /Thr, consistindo de uma subunidade de CDK catalítica e de uma subunidade de ciclina activando. Diferentes CDKs podem controlar diversas partes do ciclo celular; Estes complexos podem ser activados por fosforilação, ligação de activadores ou inibidores ciclinas subunidades [35] – [36]. expressões CCNB1, CCNE1 e CDK1, que pode se correlacionam com uma actividade proliferativa aumentada, foram maiores em crianças e mucosa do cólon neoplásicas em comparação com a mucosa normal de adulto. Além disso, a ciclina D1 (CCND1), os níveis de ARNm de CDK1 e CDK6 foram significativamente mais elevados em comparação com amostras de CRC crianças normais, que podem ser relacionadas com a proliferação celular descontrolada no cancro (

Figura 4

). Ciclina D1 tem vários efeitos regulamentares em celular normal diferenciação, crescimento e metabolismo; No entanto, a sobre-expressão de CCND1 é uma da alteração mais vulgarmente observada em cancros humanos, como tem efeitos reguladores do ciclo celular na fase G1 [37]. De acordo com

Zhang et al.

Resultados, o anormal sobre-regulação da ciclina D1 pode ser um evento precoce na carcinogénese intestinal [38].

Sahl et al.

Investigaram a expressão de diferentes quinases dependentes da ciclina em câncer de cólon humano. Observou-se que a activação de CDK1, CDK2 e CDK6, que pode fosforilar a proteína do retinoblastoma, resultando na libertação a partir da inibição da progressão para a frente da fase G1, está em ligação com a carcinogénese colorectal humano [39].

Existem várias moléculas reguladoras que podem modular e bloqueiam a função de CKDs, chamados inibidores de quinase dependente de ciclina. Em nosso estudo, nós investigamos as alterações da CDKN2B expressão de mRNA nos processos de envelhecimento e carcinogênese colorretal. CDKN2B também é conhecido como supressor de tumor múltiplo de 2 (MTS2), quinases dependentes de ciclina 4 e 6 ou proteína p15-INK4b (p15) de ligação. CDKN2B está localizado adjacente ao CDKN2A supressor de tumores no cromossoma 9, que está frequentemente mutado e suprimido em uma ampla variedade de neoplasias. Este gene codifica um inibidor de quinase dependente de ciclina que podem produzir complexos com CDK4 e CDK6, inibição do crescimento celular ou do ciclo celular. Na análise de microarray uma expressão de mRNA moderado de CDKN2B foi encontrado em, amostras de biópsia bem controlados hiper-proliferativa do cólon, desde crianças em comparação com adultos histologicamente intacta mucosa do cólon, e uma redução de expressão de genes notável foi observada em amostras de CRC (

Figura 3

). De acordo com estudos anteriores, CDKN2B pode actuar como um gene supressor de tumor e uma efectora potencial de paragem do ciclo celular induzida por TGF-p [40].

Herman et al.

Certificou que o silenciamento do gene da p15 por CpG ilha hipermetilação pode causar doenças neoplásicas [41]. Uma perda significativa das funções destes genes podem contribuir para a proliferação celular descontrolada no CRC.

Na análise imuno-histoquímica, um moderadamente diminuição da actividade apoptótica foi encontrado em crianças saudáveis ​​amostras de biópsia colorrectais comparados com os adultos saudáveis ​​e foi dramaticamente reduzida em o curso da sequência adenoma-carcinoma. Alterações de expressão de mRNA de apoptose de indução ou -inhibiting genes analisados ​​em nosso estudo (por exemplo ACVR1B, TNFSF10, DYRK2, SOCS3, IFI6 e SERPINB9) podem explicar este fenómeno.