sugeriu

Sumário

evidências recentes de que activadores de AMPK pode ser aplicado como drogas terapêuticas em suprimir o crescimento de células de cancro. No entanto, o mecanismo molecular da sua função supressora de células cancerosas ainda não é clara. Aqui nós mostramos que ativadores de AMPK prejudicar o crescimento de células de câncer do colo do útero através da redução de DVL3, um regulador positivo na Wnt /β-catenina sinalização e um jogador oncogênico na tumorigênese do câncer cervical. Por western blot e análise de imuno-histoquímica, demonstramos que DVL3 foi frequentemente regulada e significativamente associada com níveis elevados de β-catenina (

P

= 0,009) e CyclinD1 (

P

= 0,009) expressões em câncer cervical . expressão forçada de DVL3 elevado β-catenina e aumentada crescimento de células de câncer cervical, verificando que DVL3 mediada Wnt activação /β-catenina está envolvida na oncogênese câncer cervical. Por outro aspecto, observou-se que o crescimento das células do cancro do colo do útero foi notavelmente suprimida por ativadores de AMPK e tal inibição do crescimento celular foi em simultâneo com a redução do nível de proteína DVL3 em modos da dose e dependente do tempo. Além disso, a atividade de sinalização mTOR prejudicada também reduziu a expressão DVL3. Em contraste, a co-tratamento com o Composto C (inibidor da AMPK) pode revogar significativamente redução induzida DVL3 metformina. Além disso, a co-tratamento com AM114 ou MG132 (inibidores proteossomal) pode restaurar parcialmente a expressão DVL3 sob o tratamento de metformina. Além disso

in vivo

ensaio de ubiquitinação revelou que a metformina poderia reduzir DVL3 pela degradação ubiquitina /proteossómica. Para nosso conhecimento, este é o primeiro relatório que mostra os mecanismos moleculares prováveis ​​de que os ativadores de AMPK suprimir o crescimento de células de câncer do colo do útero, ao alterar a síntese de proteínas DVL3 via AMPK de sinalização /mTOR e /ou parcialmente promovendo a degradação proteossómica de DVL3.

Citação: Kwan HT, Chan DW, Cai PCH, Mak CSL, Yung MMH, Leung THY, et al. (2013) AMPK ativadores Repressão do cancro do colo do Crescimento Celular através da inibição da DVL3 Mediated Wnt /β-catenina Sinalização Atividade. PLoS ONE 8 (1): e53597. doi: 10.1371 /journal.pone.0053597

editor: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japão

Recebido: 22 de Agosto de 2012; Aceite: 30 de novembro de 2012; Publicação: 02 de janeiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Kwan et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado por Wong Verifique Ela Charitable Foundation. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer cervical é um dos cancros ginecológicos mais comuns em todo o mundo. Até à data, a causa mais bem conhecido de cancro cervical é a infecção pelo vírus do papiloma humano (HPV). infecção persistente por HPV promove o desenvolvimento de lesões pré-cancerosas para câncer cervical [1]. No entanto, a infecção por HPV por si só não é suficiente para transformar células hospedeiras de células cancerosas epiteliais. Assim, outros factores, tais como a sobre-regulação de oncogenes e a activação aberrante de vias de sinalização relacionados, podem estar envolvidos na carcinogénese cervical [2]. Evidências recentes têm mostrado que a activação aberrante de sinalização de Wnt /β-catenina é crucialmente envolvido no desenvolvimento do cancro [3], [4], [5]. A acumulação de β-catenina é a marca em causar a activação aberrante de sinalização de Wnt /β-catenina, que está intimamente associada com a carcinogénese do colo uterino [6], [7], [8], [9], e particularmente no invasiva carcinomas cervicais [10]. Assim, esta via de direccionamento pode ser uma abordagem promissora na terapia molecular desta doença.

da proteína quinase ativada por AMP (AMPK) é o principal regulador do sistema de energia celular [11]. atividade AMPK Activado prejudica mTOR (mTOR) e sua sinalização da cinase p70S6 correspondente e actividade 4E-BP1 [12], inibindo assim a síntese de proteínas [13], [14] e o crescimento celular. Portanto, não é surpreendente que a baixa atividade da AMPK favorece carcinogênese [15], [16]. Para este fim, numerosos activadores de AMPK farmacêuticas, tais como A23187, A769662, 5-aminoimidazol-4-carboxamideribonucleoside (AICAR) e metformina foram recentemente demonstrado exercer efeitos anti-tumorais em vários cancros humanos [17], [18], [19 ], [20], [21], [22], [23]. Em particular, a metformina tem sido utilizada em vários ensaios clínicos em curso [24], [25], [26], [27]. No entanto, os mecanismos moleculares para os efeitos anti-tumorais destes activadores de AMPK não foram ainda claramente elucidadas.

Neste estudo, mostrou que DVL3 foi significativamente regulada positivamente e foi correlacionado com a actividade /β-catenina em Wnt câncer cervical. Mais importante, nós somos os primeiros a fornecer evidências de que os activadores de AMPK inibir o crescimento de células de câncer do colo do útero através prejudicando a sinalização /β-catenina Wnt DVL3 mediada em células de cancro do colo do útero. Mostrámos que a inibição da síntese de proteínas AMPK /mediada por mTOR e o aumento da degradação proteossómica foram os mecanismos moleculares na redução de DVL3 exibida pelos activadores de AMPK. Nossas descobertas implicam a importância de DVL3 na oncogênese câncer cervical e destacar o valor terapêutico de alvejar DVL3 por ativadores de AMPK no tratamento do cancro do colo do útero.

Materiais e Métodos

cultura celular

Cinco linhas celulares de cancro do colo do útero (American Type Culture Collection, Rockville, MD) (HeLa, SiHa, C33A, CaSki e C41) (de autenticação linhas de células foi realizado por análise de STR ADN perfis in-house) e duas linhas de células epiteliais do colo do útero imortalizadas ( NC104 e NC105) [6] (a partir de Prof. presente George. Tsao, Departamento de anatomia, The University of Hong Kong) foram utilizados neste estudo. Todas as linhas celulares foram cultivadas a 37 ° C em 5% de CO2 em meio essencial mínimo ou meio de Eagle modificado por Dulbecco (Gibco-BRL, Gaithersburg) com 10% de soro fetal bovino (Gibco) e 1% de Penicilina-Estreptomicina (Gibco).

os plasmídeos de células e transfecção

o-DVL3 GFP construção que expressa foi usada para a expressão da proteína GFP /DVL3 [28], enquanto que o plasmídeo pEGFP-C1 foi usado como controlo negativo. O pCMV2-Flag /DVL3 foi utilizado para o ensaio repórter da luciferase para cima /FOP, enquanto ambas as construções e pSuper8XTOPFlash pSuper8XFOPFlash foram gentilmente fornecidas pelo Dr. R. lua (Universidade de Washington, Washington, EUA). LipofectAMINE

TM 200 (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) foi utilizado para transfecção de células de acordo com os protocolos do fabricante. Para o estabelecimento de GFP-DVL3 que expressam estavelmente as células, as células transfectadas foram seleccionadas com G418 durante 2 semanas e verificado por análise Western Blot.

extracção de ARN e quantitativa da transcriptase reversa-PCR

O ARN total foi extraiu-se por o reagente TRIzol (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. DNA complementar foi sintetizada utilizando kit de reagentes de transcrição reversa (Applied Biosystems, Foster City). A expressão de

DVL3

foi avaliada por ensaios de expressão de genes Taqman® transcriptase-PCR (Q-PCR) num sistema ABI PRISM ™ 7500 (Applied Biosystems) utilizando reversa quantitativa; humana

DVL3

(Ensaio ID: Hs00610263_m1). O ser humano

18S rRNA

(Ensaio ID: Hs99999901_m1) foi utilizado como um controlo interno

extração de proteínas, Western blot e imunohistoquímica (IHC) analisa

lisado de proteína foi extraída. lisando as células sedimentar com tampão de lise 1x (10X tampão de lise (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EUA), 1:100 PMSF, o inibidor de protease e de água destilada). Para análise de Western blot, amostras contendo uma quantidade fixa de proteína foram separadas por SDS-PAGE e electrotransferidas para membranas Hybond-P (Amersham Pharmacia Biotech, Cleveland, OH, EUA). As membranas foram, então, colocados a hibridar com 5% de leite desnatado durante 30 minutos e incubadas com anticorpos primários; anti-pp70S6kinase, anti p70S6-quinase, anti-pAMPKα, anti-AMPKα, anti CyclinD1-(celular tecnologia de sinalização), anti-DVL1, anti-DVL2, anti-DVL3, anti-GFP (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA , EUA) e anti-β-catenina (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA) durante a noite a 4 ° C. Anti-rato ou um anticorpo secundário anti-coelho conjugado com peróxido de rábano (Amersham Pharmacia Biotech, OH) foi usado e visualizados por quimioluminescência aumentada (Amersham). Para a análise imuno-histoquímica, array câncer cervical tecido (CXC1021) (5 casos de colo do útero normais /cervicite e 97 casos de cânceres cervicais) (Pantomics Inc, CA, EUA) foram utilizados para a coloração imuno-histoquímica para DVL3, β-catenina e CyclinD1. As secções foram imunocoradas com anticorpo primário anti-DVL3 (1:200 diluição) (NB110-59941, Novus Biologicals, Littleton, CA EUA), anti-β-catenina (BD Biosciences) (1:200 diluição) e anti-CyclinD1 (1 :100 diluição) (H-295, Santa Cruz Biotehcnology). A incubação com solução salina tamponada com Tris foi utilizado como controlo negativo. Os níveis de expressão foram marcados manualmente através da multiplicação da percentagem da proporção de área de coloração imuno (0-100%) e a intensidade da coloração (1, fraco; 2, moderada; 3, intensa; e 4, muito intensa ). A mudança de dobragem de cada gene foi calculado dividindo-se o seu nível de expressão de cada amostra de cancro por o valor médio do seu nível normal colo /cervicite expressão. O ponto de corte (número de dobras) de cada gene foi então determinada pelos seus níveis de expressão e a significância estatística. Todos secção de tecido foram examinados e teve independentemente por dois investigadores.

Luciferase Reporter Assay

células HEK293 foram transfectadas transitoriamente com 0, 50, 100, e 200 ng de pCMV2-Flag /DVL3 bem tanto como um pSuper8XTOPFlash ou pSuper8XFOPFlash construção repórter de luciferase. Todas as transfecções foram normalizados com pcDNA3.1 (+) do vetor. A actividade de luciferase foi determinada utilizando o Repórter Dual-Luciferase Assay System (Promega). eficiências de transfecção foram normalizados com o

Renilla

atividade luciferase. Todos os experimentos foram realizados em triplicado e em 3 experimentos independentes.

In Vivo

Ubiquitination Ensaio

O procedimento foi descrito como anteriormente [29]. Resumidamente, as células C33A ou Hela foram semeadas em placas de cultura de 100 mm. O pcDNA-HA (Ub)

8 era transiente transfectado para os tipos de células acima, respectivamente, utilizando Lipofeactamin kit de transfecção 2000 (Invitrogen). O lisado celular foi colhida usando tampão de lise líquido (50 mM Tris, pH 7,4, NaCl 150 mM e EDTA 5 mM) com NP40 a 1%, pH 8,0, 0,1 mM de PMSF, e 1 mM de cocktail completo TM inibidor de protease (Roche)) no sedimento celular. Um mg de lisado celular foi incubada com 1 ug de ratinho anti-IgG e anti-DVL3 (Santa Cruz) a 4 ° C. Após a incubação, 40 ul de proteína A /G Plus grânulos-agarose (Santa Cruz) foram adicionados a cada amostra e misturou-se por rotação durante a noite a 4 ° C. Após centrifugação, as contas foram lavadas quatro vezes com tampão de lise NET, seguido pela adição de tampão de amostra contendo DTT e fervidas durante 10 min antes da electroforese. Os inibidores de proteassoma MG132, e AM114, foram obtidos de Calbiochem (La Jolla, CA).

A viabilidade celular ensaio

kit de proliferação celular (XTT) (Roche) foi usada para medir a viabilidade das células para 5 dias de acordo com o protocolo do fabricante. Três experiências independentes foram realizados em triplicado.

clonogénicas ensaio

As células foram deixadas crescer durante 2 semanas. Após 2 semanas, o meio foi removido, seguido por incubação com metanol durante 30 minutos e, em seguida, coradas com violeta de cristal durante 1 hora. Após a coloração, as células foram lavadas com PBS. Triplicação de cada amostra e três experimentos independentes foram realizadas eo número de células foi contado pelo sistema de Gel-Doc.

A análise dos dados

O teste t de Student (dados paramétricos) eo Mann Whitney (para dados não-paramétricos) foram usadas para análise. A análise clínico-patológica entre a expressão de DVL3, β-catenina, CyclinD1 e parâmetros clínicos foi analisada por Crosstabs e Pearson Chi-Quadrado teste utilizando o software SPSS 13.0 (SPSS, Chicago, IL). Todos os dados foram expressos como média ± DP. A

P

-valor inferior a 0,05 foi considerado como significativo.

Resultados

DVL3 é frequentemente regulada em células cancerosas cervicais

evidências emergentes têm mostrado DVLs que são capazes de regular positivamente β-catenina e promover o crescimento celular no cancro colorrectal [30], mesotelioma pleural maligno [31] e o cancro do pulmão de células não pequenas, [32], etc. Nós portanto, examinaram o padrão de expressão DVLs ( DVL1, DVL2 e DVL3) em linhas celulares de cancro do colo do útero por análise de western blot. Nossos dados demonstram que DVL3 mas nem DVL1 nem DVL2 foi significativamente sobre-regulada em um painel de linhas celulares de cancro do colo do útero (Hela, SiHa, CaSki, C33A e C41), quando comparado com linhas de células do colo do útero imortalizadas (NC104 e NC 105) (Figura 1A ), sugerindo que é predominantemente DVL3 regulada positivamente em células de cancro do colo do útero. A seguir, examinou o nível de mRNA de

DVL3

nestas linhas celulares por PCR em tempo real transcrição reversa quantitativa (q-PCR). Da mesma forma, o

DVL3

níveis de mRNA foram significativamente mais elevadas em linhas de células do cancro do colo do útero, em comparação com as linhas celulares normais imortalizadas de colo (Figura 1B). Colectivamente, estes resultados indicam que DVL3 é a principal isoforma da DVLs freqüência-regulada em células de câncer cervical.

(A) análise de Western blot mostrou que apenas o nível de DVL3 mas não DVL1 e DVL2 foi significativamente para cima reguladas em linhas celulares do cancro do colo do útero quando comparados com as linhas de células do cérvix normais. (B) em tempo real q-PCR revelou o mRNA de

DVL3

era, obviamente, maior entre as linhas celulares de cancro do colo do útero, quando comparado com as linhas de células do colo do útero normais. O valor de NC105 foi utilizada para normalizar as outras linhas celulares. (C) A análise imuno-histoquímica mostrou que tanto DVL3 e β-catenina foram regulados positivamente em tecidos de cancro do colo do útero quando comparados com amostras de cérvix normais. DVL3 foi distribuído na região citoplasmática Considerando β-catenina foi localizada em ambas as regiões citoplasmática e nuclear. (Ampliação: 20x) ensaio (D) repórter luciferase revelou que a transfecção transiente de DVL3 expressando plasmídeo poderia aumentar a atividade transcricional β-catenina em células HEK293

A superexpressão de DVL3 e β-catenina em câncer cervical.

Para estudar o significado da DVL3 e β-catenina em câncer cervical, nós examinamos as expressões de DVL3 e β-catenina em uma matriz de tecido de câncer cervical (CX1021) usando análise imuno-histoquímica (IHQ). A imunorreactividade de DVL3 só foi observada no citoplasma Considerando β-catenina localizada em ambos os núcleos e regiões citoplasmáticas de ambas as células cancerosas normais e cervical (Figura 1C). análise IHC demonstraram que o aumento notável das expressões DVL3 e β-catenina foram observados em secções de tumor do colo do útero, em comparação com as secções do cérvix normais (Tabelas 1 e 2). A análise estatística mostrou que a alta expressão de DVL3 (classificação 5 dobras) foi significativamente correlacionada com alto nível de β-catenina (classificação 7 dobras; p = 0,009) (Tabela 1). No entanto, não houve associação significativa entre a expressão DVL3 e outros parâmetros clínicos, como estágios de tumor (

P

= 0,369), classificação (

P

= 0,658), metástase (

P

= 0,243), β-catenina (

P

= 0,009) e CyclinD1 (

P

= 0,009). Por outro lado, o aumento da regulação do β-catenina (classificação 7 dobras) foi significativamente associada com tumores de alto grau (

P

= 0,049) e sobre-expressão de CyclinD1 (

P

= 0,009), mas não houve correlação significativa com os estágios de tumor (

P

= 0,189) e metástases (

P

= 0,345) (Tabela 2). Tomados em conjunto, estes resultados indicam que o aumento da expressão de DVL3 está correlacionada com β-catenina, que está envolvida no desenvolvimento do cancro cervical.

DVL3 aumenta a proliferação de células de cancro cervical

DVLs são importantes moléculas de transdução de sinal que medeiam a actividade de sinalização /β-catenina Wnt para controlar o crescimento celular. Para abordar se DVL3 poderia promover a actividade de sinalização de Wnt /β-catenina, foi realizado o ensaio de repórter de luciferase duplo. A transfecção do plasmídeo DVL3-expressar em células HEK293 que o aumento da actividade transcricional β-catenina de uma forma dependente da dose (Figura 1D), o que sugere que DVL3 é um regulador positivo da /β-catenina cascata de sinalização de Wnt. Em seguida, para investigar se DVL3 promove a proliferação celular através da activação de Wnt via /β-catenina em câncer cervical, duas linhas celulares de cancro do colo do útero (C33A e SiHa) com forma estável expressão de DVL3 foram estabelecidos utilizando DVL3 plasmídeo expressando GFP humanos. A análise por Western blot revelou que β-catenina foi significativamente elevados em clones estáveis ​​GFP-DVL3 em C33A (C-G25 e G28-C) e SiHa (S-G18 e G20-S) (Figura 2A). Funcionalmente, o ensaio de proliferação celular XTT revelou que a expressão ectópica de DVL3 aumentou significativamente a proliferação celular em clones estáveis ​​GFP-DVL3 de SiHa (

P

0,05) e C33A (

P

0,001) células (Figura 2B). Além disso, o ensaio clonogénico revelou que havia 2-3 vezes de aumento do número de colónias em células SiHa que expressam estavelmente GFP-DVL3 (S-G18 e G20-S) (

P

0,05) e C33A (células C-G25 e G28-C) (

P

0,05), respectivamente, em comparação com os controles de vetor (Figura 2C). Colectivamente, estes resultados sugerem que DVL3 aumenta a actividade de sinalização de Wnt /β-catenina e promove a proliferação de células de cancro cervical.

(A) Western blot mostrou que a forma estável sobre-expressando GFP-DVL3 elevada expressão de β-catenina em C33A (C-G25 e G28-C) e SiHa (S-G18 e G20-S). ensaio (B) de XTT revelou um aumento significativo da proliferação celular em células de cancro cervical com a expressão estável de GFP-DVL3 (C-G24 e G28-C;

P

0,05) (S-G18 e S- G20;

P Art 0,05). (C) ensaio clonogénico mostrou que duas vezes e três vezes o número de colónias foram encontrados em GFP-DVL3 ectopicamente expressa células C33A (C-G25 e G28-C) (

P

0,05) e células SiHa (S -G18 e S-G20) (

P Art 0,05) em comparação com os controles de vetor

ativadores de AMPK reduzir DVL3 em células cancerosas cervicais

numerosos. estudos têm demonstrado que os activadores de AMPK pode inibir o crescimento celular em cancros, particularmente no cancro do colo do útero

in vitro

[21], [33], [34]. Portanto, examinámos o efeito de activadores de AMPK na expressão da sua actividade relacionada com a sinalização de Wnt /β-catenina DVL3 e em células de cancro do colo do útero. AICAR tratamento resultou na redução significativa dos níveis de DVL3 em três linhas de células de cancro do colo do útero (Figura 3A). Um outro activador de AMPK, A23187, AMPK activa através da sua quinase a montante (CaMKK), aumentando o nível citosólico de cálcio [20], também reduziu a expressão em células C33A DVL3 SiHa e de uma forma dependente da dose (Figura 3C). A fim de avaliar o efeito do A23187 sobre a expressão DVL3, C33A e CaSki foram tratados com 1,25 uM A23187 e colhidas em diferentes pontos de tempo. Decremento de DVL3 foi observada após 10 e 12 horas em C33A e CaSki, respectivamente, e não DVL3 foi observada após 12 e 24 horas para ambas as linhas celulares (Figura 3D). Para avaliar ainda mais se a redução de DVL3 mediada por ativadores de AMPK é um processo universal, dois activadores de AMPK bem conhecidas, A769662 e metformina, foram usadas. A769662 é uma tienopiridona que activa a AMPK através de interagir com o α- e β-subunidade de AMPK. Após tratamento A769662, expressão DVL3 foi abolida de uma forma dependente da dose em SiHa e C33A (Figura 3B). Além disso, a metformina é um activador de AMPK muito comum, bem como um potencial medicamento anti-cancro [22]. No momento do tratamento de metformina, várias linhas celulares de cancro do colo do útero exibem respostas diferenciais aos metformina e mostrou esgotamento de DVL3 de um modo dependente da dose (Figura 3E), juntamente com qualquer alteração no nível de ARNm de

DVL3

em C33A e HeLa (Figura 4A), sugerindo que a redução de DVL3 regulado por ativadores de AMPK foi associada com eventos pós-transcrição. Tomados em conjunto, estes dados significam que ativadores de AMPK pode reduzir DVL3 e tal efeito é um processo universal.

(A) Após o tratamento de AICAR, foi observada redução de aproximadamente 80% do nível de DVL3 entre C33A, C41 e CaSki. (B) Por tratamento de A769662 em doses diferentes (0, 50 e 100 uM), uma redução de 20-30% -100% e 80% de DVL3 em SiHa e C33A pode ser observado, respectivamente. (C) depois do tratamento com A23187 em doses diferentes (0, 1,25 e 2,5 uM) durante vinte horas, as células C33A e SiHa mostrou uma redução de 80-90% da expressão DVL3 de uma forma dependente da dose. (D) Por tratamento de 1,25 uM A23187, a redução de DVL3 pode ser observada após 10 e 12 horas em C33A e CaSki, respectivamente, enquanto que uma redução adicional de 100% de DVL3 foi observada após 12 e 24 horas para ambas as linhas celulares. (E) após o tratamento de metformina, redução de 60-80% de DVL3 foi observada em HeLa, SiHa, CaSki, C41 e C33A de uma forma dependente da dose.

(A) q- em tempo real a análise de PCR demonstrou que a metformina não teve efeito sobre a expressão de

DVL3

expressão de ARNm em células C33A e HeLa. (B) análise por Western blot revelou que o composto C pode diminuir o decremento de DVL3 mediada pela metformina. (C) de XTT ensaio de proliferação celular mostraram uma redução significativa da proliferação celular em C33A (

P

0,001), SiHa (

P

0,001) e células HeLa (

P

0,001), tratados com metformina de uma forma dependente da dose. (D) Ensaio clonogénico apresentaram uma redução notável do número de colónias formadas em células HeLa e C33A tratados com metformina de uma forma dependente da dose.

activação AMPK é crucial para a redução de DVL3 mediada por AMPK ativadores

Embora o principal papel dos ativadores de AMPK é ativar a atividade da AMPK, inúmeros relatos evidenciaram que alguns ativadores de AMPK pode exercer efeitos fora do alvo [35], [36]. Portanto, é de interesse para examinar se ativadores de AMPK redução mediada de DVL3 é dependente apenas da atividade de sinalização AMPK. Utilizou-se um inibidor potente da AMPK, composto C, para neutralizar o efeito da metformina sobre a activação da AMPK. Consistentemente, foi observada redução de DVL3 após o tratamento de metformina em C33A e SiHa (Figura 4B), no entanto, o decremento de DVL3 foi revogada com a adição do composto C (Figura 4B). Estes dados sugerem que a redução da DVL3 mediada pela metformina é principalmente através da atividade de sinalização AMPK.

ativadores de AMPK prejudicar a proliferação de células cancerosas do colo do útero através da redução da atividade /-sinalização β DVL3 e Wnt

Temos demonstraram que a expressão ectópica de DVL3 poderia melhorar a proliferação celular em células de cancro do colo do útero. Portanto, para obter mais conhecimentos sobre a função da DVL3 empobrecido em minimizar Wnt /sinalização de β-catenina e proliferação celular mediada por ativadores de AMPK, as células C33A, SiHa e HeLa foram tratadas com metformina e suas taxas de proliferação foram examinados por ensaio XTT. Nossos resultados demonstraram que a metformina reprimida significativamente a proliferação celular em C33A (

P Art 0,001), SiHa (

P Art 0,001) e as células HeLa (

P Art 0,001) (Figura 4C). Além disso, o ensaio clonogénico também revelou que o número de colónias foi reduzido em 20 e 50% em C33A e células HeLa, respectivamente (Figura 4D). Estes resultados evidenciam que as inibição do crescimento celular do cancro do colo do útero por ativadores de AMPK é atribuído à redução do DVL3.

AMPK actividade /mTOR é essencial para a depleção de DVL3

activadores de AMPK são capazes de ativar a AMPK e modular a sua cascata a jusante, tais como o controlo da tradução da síntese de proteínas através da inibição da mTOR [12], [13], [14]. Por isso, nós concluímos o bloqueio de actividade /mTOR AMPK pode imitar os efeitos de activadores de AMPK no decremento de DVL3. Um inibidor de mTOR (rapamicina) foi utilizado para inibir a actividade da mTOR. Rapamicina suprime as actividades de quinase de mTOR para inativar p70S6K, abolindo assim determinada tradução da proteína [37]. No momento do tratamento de rapamicina, DVL3 foi reduzida em linhas celulares de cancro do colo do útero (C33A, C41, CaSki, SiHa e HeLa) de uma forma dependente da dose. Além disso, foi observada a inactivação do p70S6K em simultâneo com a redução de DVL3 em células HeLa e SiHa tratados com 1 nM de rapamicina (Figura 5A). Tomados em conjunto, a redução da síntese de proteínas pode reduzir a expressão DVL3 em linhas celulares de cancro do colo do útero e que o decremento de DVL3 mediada por ativadores de AMPK é principalmente através da /cascata de sinalização mTOR AMPK.

(A) rapamicina inactivado p70S6 cinase actividade e a síntese de proteínas de DVL3 abortado em todas as linhas celulares de cancro do colo do útero (C33A, C41, CaSki, SiHa e HeLa) de uma forma dependente da dose. (B) inibidor proteossómica, AM114, restaurou a DVL3 reduzida mediada pela metformina em C33A. (C) inibidor proteossómica, AM114, não podia restaurar o DVL3 reduzida mediada pela metformina em SiHa e HeLa. (D)

In vivo

ensaio de ubiquitinação mostrou que DVL3 foi degradada como a proteína DVL3 ubiquitinada-poli ((Ub) n-DVL3) em modelo de células C33A. Células C33A foram transfectadas com pcDNA-HA (Ub)

8 plasmídeo. Ambos MG132 ou AM114 e metformina foram utilizados para aumentar a quantidade de produtos de proteína DVL3 polyubiquitinated ((UB) n-DVL3). Os lisados ​​celulares foram incubados com anti-DVL3, e os imunoprecipitados foram sondadas com anticorpos anti-HA. A mesma membrana foi re-sondado com anti-DVL3 para detectar a expressão de DVL3.

activadores de AMPK também promover a degradação de proteossómica DVL3

Várias linhas de evidência têm demonstrado que são DVLs regulado por mecanismos de degradação proteossomo em que a perda de fatores envolvidos nas vias de ubiquitinação leva ao acúmulo DVLs [28], [38]. Assim, argumentou que a degradação proteossómica pode servir como um mecanismo alternativo atribuído a ativadores de AMPK mediadas redução DVL3. Usamos AM114, um inibidor proteossómica, para suprimir ubiquitina degradação /proteossómica. Em caso de co-tratamento com AM114 e metformina, DVL3 expressão restaurada foi observada em C33A, mas não em células SiHa e HeLa (Figura 5B e 5C). O

In vivo

ensaio de ubiquitinação ainda demonstrado que DVL3 em células C33A pode ser degradada através de via da ubiquitina /proteassoma porque foi observada a formação de produtos DVL3-ubiquitinadas mediante tratamento de metformina e tais produtos DVL3-ubiquitinadas foram ainda melhorada quando co-tratamento com qualquer um ou AM114 MG132 (Figura 5D). Estes dados indicam que a degradação proteossómica também desempenha um papel na redução da DVL3 mediada por ativadores de AMPK.

Discussão

Neste estudo, demonstrámos que DVL3 foi sobre-expresso de forma aberrante e significativamente correlacionada com o aumento da β-catenina em câncer cervical. Nossos dados também demonstraram que DVL3 poderia promover o crescimento do câncer do colo do útero através da activação /via de sinalização Wnt β-catenina. Mais importante ainda, dirigida a potencial utilização de activadores de AMPK na redução DVL3 e, consequentemente, inibir o crescimento de células de cancro do colo do útero. Além disso, este é o primeiro relatório mostrando os possíveis mecanismos moleculares de como activadores de AMPK prejudicar o crescimento de células de cancro do colo do útero através da diafonia entre AMPK e a sinalização de Wnt /β-catenina.

activação aberrante de sinalização de Wnt /β-catenina via tem sido documentado em vários cancros humanos, incluindo o cancro do colo do útero [39]. De facto, as evidências de montagem têm mostrado que DVLs que são reguladores positivos da via de sinalização /β-catenina de Wnt são frequentemente regulados positivamente em uma variedade de cancros humanos [32], [40], [41], [42], [43], [44], [45], [46]. Os DVLs overexpressed estão intimamente associados com o aumento da actividade /β-catenina Wnt em cancros humanos [31], [32], [47]. No entanto, muito pouco se sabe sobre os papéis funcionais de DVLs em câncer cervical. Aqui, observamos que DVL3, mas nem DVL1 nem DVL2, foi significativamente up-regulada e associada com a atividade de sinalização Wnt /β-catenina aumentada e crescimento de células de câncer cervical.

Numerosos estudos têm relatado que as cinases a montante de AMPK, como LKB1, é frequentemente mutado e eliminada no pulmão, mama e cancro do colo do útero, especialmente [21], [48], [49], diminuindo assim as atividades de AMPK para o crescimento de células cancerígenas. Na verdade, baixa atividade da AMPK é um evento comum favorecendo o crescimento de células de câncer [15], [16]. Assim, a AMPK é um alvo importante na terapia do cancro. Nós e outros grupos já demonstraram que vários ativadores de AMPK podem suprimir o crescimento de células de câncer [21], [22], [50]. No entanto, os mecanismos moleculares da repressão permanecer largamente inexplorado. Anteriormente, o grupo de Kohno mostrou que a metformina reduziu o nível de proteína de β-catenina através de regulação da sua degradação dependente de fosforilação [51]. Isso nos deu um indício de que a metformina pode regular os reguladores a montante do /β-catenina Wnt cascata de sinalização. Aqui, demonstramos que a redução notável de DVL3 poderia ser induzida por múltiplos activadores de AMPK, sugerindo que os activadores de AMPK universalmente reduzir DVL3. Em consonância com relatórios anteriores sobre o efeito anti-tumoral de metformina através do nível CyclinD1 no cancro da próstata e cancro da mama [52],-regulação para baixo [53], a redução de expressão DVL3 também é concomitante com a diminuição dos níveis de β- catenina e o seu alvo a jusante, CyclinD1, que é responsável pelo controlo do ciclo celular. Surpreendentemente, a metformina afeta apenas o nível de proteína de DVL3 mas não o seu mRNA, indicando que a regulação da DVL3 mediado por ativadores de AMPK se baseia na modificação pós-transcricional.

Como vários ativadores de AMPK poderia reduzir DVL3, nós especulamos que a AMPK atividade é essencial para essa regulamentação. A fim de testar se os activadores de AMPK exercem os seus efeitos sobre DVL3 através da activação de AMPK, um inibidor da AMPK, composto C, foi co-tratados com metformina em células de cancro do colo do útero para contrariar o efeito de activação de AMPK. Como esperado, composto C diminuiu a função de metformina em atenuar a expressão DVL3. Estas conclusões evidentes, a ativadores de AMPK poderia reduzir DVL3 através modulando a atividade da AMPK, e tal efeito não é devido a eventos pontuais direcionados ativadores de AMPK ‘. Com efeito,

In vitro Os ensaios de proliferação de células

também revelado que a utilização de activadores de AMPK (por exemplo metformina) pode reduzir a proliferação de células. Nós fornecemos evidências sólidas de que os activadores de AMPK, especialmente metformina, exercer um efeito de regulação para baixo em DVL3 e, consequentemente, reduzir os níveis de β-catenina e CyclinD1 de expressão e, por fim atenuar a proliferação celular. Mais importante, nós somos os primeiros a mostrar que ativadores de AMPK exercem o seu efeito anti-proliferativo através da redução da actividade de sinalização Wnt /β-catenina DVL3 e. ativação da AMPK desempenha um papel requisito em suprimir o desenvolvimento do tumor no câncer cervical.