Abstract

activação RET persistente é um evento frequente em carcinoma papilar da tiróide (PTC) e carcinoma medular da tiróide (MTC). Nestes tipos de câncer, RET ativa a ERK /MAPK, as vias PI3K /AKT /mTOR ea JAK /STAT3. Aqui, testamos a eficácia de um inibidor JAK1 /2-, AZD1480, no

in vitro

e

in vivo

crescimento de linhas celulares de cancro da tiróide que expressam RET oncogênico. linhas celulares de cancro da tiróide abrigar

RET

/PTC 1 (TPC-1),

RET

M918T (MZ-CRC1) e

RET

C634W (TT) alterações, bem como TPC-1 xenotransplantes, foram tratados com inibidor JAK, AZD1480. Este inibidor conduziu à inibição do crescimento e /ou apoptose da célula do cancro da tiróide linhas

in vitro

, bem como a regressão do tumor de xenoenxertos TPC-1, em que a activação da STAT3 bloqueou eficientemente em células tumorais e do estroma. Esta inibição foi associada com a proliferação diminuída, a diminuição da densidade de vasos de sangue, juntamente com o aumento da necrose. No entanto, AZD1480 reprimido o crescimento de STAT3- deficiente células TPC-1

in vitro

e

in vivo

, demonstrando que os efeitos nesta linha celular foram independentes da STAT3 nas células tumorais. Em todas as linhas celulares, o inibidor de JAK reduziu os níveis de fosfo-Y1062 RET, e mTOR efectora fosfo-S6, enquanto JAK1 /2 regulação negativa por siARN não afectar o crescimento celular, nem RET e activação S6. Em conclusão, AZD1480 bloqueia eficazmente a proliferação e o crescimento tumoral de linhas celulares de cancro da tiróide RET activada, provavelmente por inibição directa RET em células cancerosas, bem como pela modulação da micro-ambiente (por exemplo, através da inibição de JAK /fosfo-STAT3 em células endoteliais). Assim, AZD1480 deve ser considerado como um agente terapêutico para o tratamento de cancros da tiróide RET activado

citação:. Couto JP, Almeida A, G Daly, Sobrinho-Simões H, Bromberg JF, Soares P (2012) AZD1480 bloqueia o crescimento e Tumorigênese de RET ativado linhas celulares de cancro da tiróide. PLoS ONE 7 (10): e46869. doi: 10.1371 /journal.pone.0046869

editor: Alfredo Fusco, Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR), Itália |

Recebido: 18 de junho de 2012; Aceito: 06 de setembro de 2012; Publicação: 02 de outubro de 2012

Direitos de autor: © Couto et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiada pela Fundação Português para a Ciência e Tecnologia (FCT). Joana P. Couto é apoiado por uma concessão SFRH FCT /BD /40260/2007. Ana Almeida é suportado por uma concessão SFRH FCT /BD /79135/2011. J. Bromberg é suportado por R01-CA87637-06, U54: CA148967, Marjorie e Charles Holloway Foundation, Fundação Lerner, Família do fundo Sussman e Astra Zeneca. IPATIMUP é um Laboratório Associado do Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior Português, que é parcialmente suportado pela FCT. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Jacqueline Bromberg recebeu financiamento para pesquisa da AstraZeneca. Ela teve um papel consultivo na AstraZeneca e Mediummune e recebeu Honória para palestras. Não existem patentes ou produtos em desenvolvimento ou produtos comercializados a declarar. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

Os rearranjado durante a transfecção (RET) codifica proto-oncogene para um dos primeiros receptor tirosina-quinases (RTKs), que se verificou estar envolvido no cancro [1]. ligandos RET pertencem à família neurotrófico derivado da glia cell- (GDNF) e, em cima do engate com RET, induz a autofosforilação de resíduos de tirosina intracelulares, a que se ligam vários adaptadores [2]. Estes adaptadores de mediar a activação de múltiplas vias, incluindo a proteína quinase ativada por mitógeno (MAPK) de sinalização, o fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K), a N-terminal de quinase (JNK) via c-jun, a via de p38, SRC, ERK5, PLC-γ e transdutor de sinal e ativador de transcrição (STAT) 3 [3].

o primeiro papel oncogênico dos RET foi descrito no câncer endócrino mais comum, carcinoma papilar da tiróide (PTC) [4] , como resultado de rearranjos genómicos que levam a sua activação constitutiva e a um aumento da sobrevivência da célula, a proliferação e motilidade [5].

RET

/rearranjos PTC são a segunda alteração genética mais comum em PTC, encontrado em 30% dos casos [6].

mutações pontuais RET

também foram encontrados em carcinoma medular da tiróide (MTC) [7], [8], sendo responsável por quase todos os casos hereditários e cerca de 50% do CMT esporádico [9].

oncogénica RET tem sido implicado na mediação da inflamação associada ao tumor, como formas mutantes de RET induziu a expressão de IL-8 [10] e outras moléculas inflamatórias [11]. Além disso, RET /PTC upregulated um conjunto de genes relacionados inflammation- em tireócitos [12], [13] muitas das quais pertencem à /via IL-6 JAK /STAT3 [14]. IL-6 /sinalização /STAT3 JAK é accionado por meio de acoplamento de IL-6 ao seu receptor complexo, que compreende um receptor para IL-6 (IL-6R) e o componente de transdução de sinal, gp 130 [15]. fosforilação subsequente de JAK associadas ao receptor medeia a fosforilação da tirosina de estatísticas, particularmente STAT3. Adicionalmente, a IL-6 ativa as ERK /MAPK e PI3K /AKT [16]. Desregulada de JAK /STAT sinalização (hiperactivação) tem sido descrito em uma variedade de doenças, incluindo o cancro [17] – [20]. Os inibidores selectivos da JAK1 /2 pequenas moléculas que têm sido desenvolvidos para tratar JAK- mutado doenças reumáticas [21], [22] estão actualmente em ensaios clínicos para uma variedade de cânceres. AZD1480 é um potente de molécula pequena JAK1 /2 de inibidor [23] que é no âmbito da Fase I de ensaios clínicos para o tratamento de doenças mieloproliferativas. Foram investigados os efeitos de AZD1480 na produção de IL-6 /JAK e sinalização dependente de RET (STAT3, ERK /MAPK e PI3K /AKT), bem como os seus efeitos biológicos em modelos de cancro da tiróide humana (linhas celulares e num modelo de xenoenxerto). AZD1480 eficiente inibiu o crescimento e tumorigênese de linhas celulares de cancro da tiróide que abrigam oncogênico

RET

alterações, provavelmente através da inibição da sinalização PI3K /AKT, apoiando o uso deste inibidor para pacientes com câncer de tireóide, particularmente aqueles com MTC avançado, para os quais não há opções terapêuticas eficazes.

resultados

blocos AZD1480 o crescimento de linhas celulares de cancro da tiróide que abrigam

RET

alterações oncogênicos

neste estudo , determinou-se a sensibilidade das linhas celulares de cancro da tiróide abrigar formas oncogênicos de

RET

a JAK1 /2 inibidor, AZD1480. Especificamente, analisamos PTC-derivado TPC-1 (

RET

/PTC1 rearranjo), MTC-derivado MZ-CRC1 (

RET

M918T mutação) e TT (

RET

mutação C634W) linhas celulares. Como comparação, tratado as mesmas linhas de células com um inibidor de MEK1 /2, AZD6244, que tem sido demonstrado que têm baixa eficácia em

células RET

-mutated [24], em contraste com

BRAF

células -mutated. Em conformidade, usamos duas outras linhas celulares de cancro da tiróide, K1 (PTC-derivada) e C643 (anaplásico carcinoma- tireóide derivados) que abrigam

BRAF V600E

e

HRAS

G13R mutações, respectivamente, como controlos de eficácia AZD6244. As células foram tratadas durante 5 dias consecutivos com AZD6244, AZD1480 ou uma combinação de ambos os fármacos, e a densidade celular foi determinada.

AZD1480 inibiu o crescimento de todas as

RET

-mutated /linhas celulares após rearranjados 1 (MZ-CRC1, TT) e 2 dias (TPC-1) de tratamento (p 0,0001; Fig. 1A) e minimamente diminuiu o crescimento de C643, não tendo qualquer efeito sobre K1 (Fig S1.). Observou-se que AZD6244 diminuiu minimamente o crescimento de C643 e MZ-CRC1 depois 4/5 dias de tratamento (p 0,001; Fig. 1A e S1), não teve efeito sobre o crescimento de TT (Fig. 1A) e diminuiu TPC- um crescimento de 50% após 5 dias de tratamento. Em contraste, AZD6244 eficientemente inibiu o crescimento de

BRAF

– linha celular K1 mutante (Fig. S1). Não se observou qualquer efeito aditivo ou sinérgico de inibição combinada de MEK e JAKs. AZD1480 não inibiu o crescimento de uma linha celular de rato da tiróide não-maligno, PCCl3 (Fig. 1A). A IC50 de AZD1480 para foram determinadas como sendo na gama alta nM (~200-450 nM) para estas linhas de células (Fig. 1B e S2), e uma redução, em função do tempo (48 e 72 horas), o que sugere um efeito citostático (Fig. 1B).

(a) CPT-1, as linhas celulares MZ-CRC1 e TT foram tratados com AZD6244 (1 uM), AZD1480 (1 uM), e uma combinação de ambos os fármacos (1 uM cada) durante o tempo indicado. A ratings derivado linha não maligna de células da tireóide, PCCl3, foi tratado com AZD1480 (1 M) ou controlar DMSO. O crescimento foi determinado pelo ensaio de sulfo-rodamina B. (B) As linhas de células foram tratadas durante 48 ou 72 horas com diferentes concentrações de AZD1480 (0,1, 0,5 e 1 uM) e a densidade celular foi determinada. Os dados são apresentados como média ± DP de três experiências independentes. *** P . 0,0001

Dada a sensibilidade do

RET

-mutated /reorganizados linhas celulares para AZD1480, analisamos ainda mais o perfil do ciclo celular de TPC-1, MZ- CRC1 e TT tratado durante 72 horas com AZD1480 (Fig. 2a). O inibidor de JAK levou a uma paragem em G1 em TPC-1 (94% em comparação com 79% no controlo, p = 0,01). Nas três linhas celulares, a percentagem de células na fase S foi diminuída após o tratamento AZD1480 (TPC-1: 2% vs 8% no controlo, p = 0,01; MZ-CRC1: 4% vs 11%, p = 0,004; TT: 6% vs 11%, p = 0,09). Do mesmo modo, a percentagem de células em G2 /M foi também diminuiu em TPC-1 As células tratadas com o inibidor de JAK (1% versus 13% no controlo, p = 0,01). Em MZ-CRC1 e TT, um aumento significativo na população subG1 (indicativa de morte celular por apoptose) foi detectado (18% vs. 2%, em tratados com DMSO, p = 0,04 e 11% vs 0.6%, p 0,0001 , respectivamente), após 72 horas de tratamento AZD1480. Para confirmar o efeito de AZD1480 em apoptose, as linhas celulares foram tratadas com AZD1480 durante 48 horas e corados com o reagente TUNEL, revelando um aumento no número de apoptótica MZ-CRC1 (p = 0,02) e TT (p = 0,1), as células comparado DMSO para células tratadas (Fig. 2B). Como esperado, AZD1480 não induziu a apoptose em qualquer TPC-1 (Fig. 2B). Paralelamente, observou-se aumento dos níveis do inibidor de quinase dependente da ciclina, p27, e diminuição dos níveis de ciclina D1 e da proteína anti-apoptótica, BCL-2, em células AZD1480- tratados (Fig. 2C).

(a) CPT-1, MZ-CRC1 e TT foram tratados com AZD1480 (1? M; +) durante 72 horas. As células foram submetidas a análise do perfil de ciclo por citometria de fluxo. Os resultados são representativos de três experiências independentes (média ± EP). (B) As células foram tratadas com AZD1480 (1 uM) durante 48 horas e morte celular por apoptose foi determinada pelo método TUNEL. (C) AZD1480 induz upregulation p27 e ciclina D1 e Bcl-2 downregulation em linhas celulares de cancro da tiróide. TPC-1, as linhas celulares MZ-CRC1 e TT foram tratados com AZD1480 (1 uM) durante 24 horas. Os lisados ​​celulares foram sondados com os anticorpos primários indicados, por western-blotting. * P 0,05; *** P . 0,0001

AZD1480 induz a regressão da TPC-1 xenotransplantes

Os efeitos do inibidor JAK no

in vivo

crescimento de TPC- 1 foram avaliadas através de injecção subcutânea nos flancos de ratinhos nus. Quando os tumores atingiram -0,5 cm

3, os ratinhos foram tratados com veículo, AZD1480 ou AZD6244 durante 16 dias consecutivos (Fig. 3A). Os tumores dos murganhos de controlo e murganhos tratados AZD6244- continuaram a crescer até ao dia 9 e, devido ao seu grande tamanho, os murganhos foram sacrificados. Em contraste, os ratinhos tratados AZD1480- mostraram evidências de regressão do tumor, após 4 dias e, depois de 16 dias, mediram ~ 23% da sua dimensão inicial (Fig. 3A). a coloração imuno-histoquímica de secções de tumor representativos mostraram significativa downregulation fosfo-STAT3 por AZD1480 em células tumorais e de células do estroma (células endoteliais). O inibidor de MEK, AZD6244 reduzida fosfo-ERK1 /2 níveis em tumores (Fig. 3B). Histologicamente, a maioria da massa do tumor (90%) a partir de tumores tratados AZD1480- foi composta de tecido necrótico, enquanto a maioria das células de tumores dos grupos de controlo e de AZD6244 eram viáveis ​​e activamente em proliferação, como pode ser visto por coloração de Ki67 (Fig. 3C) . A caracterização adicional destes tumores revelou uma redução nas células endoteliais (MECA-32) após o tratamento AZD1480, comparado com o controlo e grupos de AZD6244 (p = 0,06 e p 0,0001, respectivamente; Fig. 3C). Não foram detectadas diferenças significativas no número de células apoptóticas (TUNEL), cuja percentagem era baixo ao longo dos tumores.

(A) As células TPC-1 (10

6) foram injectados subcutaneamente nos flancos de ratinhos nus. Seguindo o enxerto do tumor (~ 0,5 cm

3), os ratos foram distribuídos em quatro grupos (n = 5 /grupo) com volumes de tumor médios semelhantes. Os grupos foram tratados com o veículo do fármaco (não tratado), AZD6244, a 25 mg /kg, uma vez por dia, ou AZD1480, a 30 mg /kg, bi-diária. Os volumes tumorais foram determinados a cada duas semanas (média ± EP). (B) e AZD1480- AZD6244- tratada TPC-1, secções de tumor foram imunocoradas para a fosfo-STAT3 e expressão de fosfo-ERK1 /2, respectivamente. células estromais-fosfo-STAT3 positiva são contornadas com uma linha pontilhada (ampliação: 400x). (C) JAK inibidor diminui a proliferação e vasculogénese de TPC-1 xenotransplantes. H E coloração de TPC-1 tumores tratados com veículo da droga (controle), AZD6244 ou AZD1480. secções de tumor representativos foram coradas para a proliferação (Ki67), a angiogénese (Meca-32) e a apoptose (TUNEL) marcadores. ampliação original: 200x. A quantificação é representado graficamente. ** P 0,001; *** P . 0,0001

AZD1480- inibição do crescimento mediada é independente da STAT3

JAK são os principais mediadores da IL-6 /gp130 de sinalização /STAT3 e, em vários câncer modelos, efeitos anti-tumorigénica inibidores de JAK ‘são mediadas por STAT3. A fim de determinar se a STAT3 foi necessário para JAK inibidor mediado por paragem do crescimento, que reduzida de forma estável STAT3 em células TPC-1 utilizando um gancho de cabelo curto, tal como determinado por Western-blot e imuno-histoquímica (Fig. 4A, C2). As células foram tratadas com AZD1480 durante quatro dias consecutivos, e

In vitro o crescimento de células foi monitorizada

, revelando inibição significativa do crescimento das células shSTAT3 TPC-1 (p 0,0001; Fig. 4B).

In vivo

crescimento foi avaliada por injecção das células shSTAT3 por via subcutânea e, ao atingir ~ 0,5 cm

3, os ratinhos portadores de tumores foram tratados com veículo ou AZD1480, durante 21 dias. O grupo de controlo foi sacrificado ao fim de 8 dias, devido ao grande tamanho dos tumores. tratamento AZD1480 regressão induzida (volume do tumor foi ~24% do seu tamanho inicial; p 0,0001) de tumores TPC-1 shSTAT3 (Fig 4C1.). A fosfo-STAT3 foi confirmado para ser reduzida em células de tumor dos ratinhos tratados com veículo, mas não em células do estroma, enquanto tumor-stromal- e fosfo-STAT3 foram significativamente reduzidos em ratinhos tratados com AZD1480- (Fig. 4C2).

(a) STAT3 foi knockdown em células TPC-1 por um curto hairpin. Fosfo-STAT3 e STAT3 downregulation foram confirmados por Western-blot. (B) TPC-1 shSTAT3 células foram tratadas com DMSO ou AZD1480 (1 uM) e inibição do crescimento foi determinada pelo ensaio de SRB. Os resultados são a média ± DP de três experiências independentes. (C) As células TPC-1 shSTAT3 foram injectadas subcutaneamente em ambos os flancos de ratinhos nus. Quando os tumores atingiram -0,5 cm

3, os ratos foram igualmente distribuídos em dois grupos: um foi o grupo de controlo (veículo) eo outro foi tratado com AZD1480 a 30 mg /Kg, bi-diária. (C1) O volume do tumor foi medido nos pontos de tempo indicados. Os resultados representam a média ± SE. (C2) representativas H E e imunocoloração fosfo-STAT3 de secções de tumores não tratados (veículo) ou AZD1480- tratada TPC-1 shSTAT3 tumores. As setas indicam células do estroma murino positivos fosfoazotados STAT3-. Ampliação: 200x. *** P . 0,0001

AZD1480 inibe RET Y1062 fosforilação e a jusante de PI3K /AKT /mTOR sinalização

Oncogênicos RET vias efetoras incluem ERK /MEK, PI3K /AKT e STAT3 [ ,,,0],3]. Dadas as ações de crescimento supressivos significativos do inibidor JAK na oncogênico

RET viajantes – transformado TPC-1 xenotransplante independentemente da STAT3, a hipótese de que AZD1480 pode ter um efeito direto sobre a sinalização mediada por RET. Foram tratados TPC-1, MZ-CRC1, TT (Fig. 5A), bem como um modelo de expressão de RET /PTC3 indutível em PCCL3 (Fig. 5B), com AZD1480 e /ou AZD6244, durante 24 horas. A expressão e fosforilação níveis de RET, bem como das principais efectores da JAK /STAT3, ERK /MAPK e PI3K /AKT, nomeadamente fosfo-STAT3 Tyr705, fosfo-ERK1 /2 Thr202 /Tyr204 e fosfo-AKT Ser473 /fosfo -S6 Ser235 /236, respectivamente, foram examinados por análise de western-blot. AZD1480 e AZD6244 eficazmente diminuiu os níveis dos seus alvos a jusante de fosfo-STAT3 e fosfo-ERK1 /2, respectivamente, em todas as linhas de células (Fig. 5A, B). MZ-CRC1 não expressaram fosfo-ERK1 /2 em níveis basais (Fig. 5a). Além disso, AZD1480 reduziu os níveis de fosfo-ERK1 /2 em PCCl3-RET /PTC3 e TT, bem como de fosfo-AKT, fosfo-S6 e fosfo-RET em todas as linhas de células (Fig. 5A, B). Em contraste, o tratamento com AZD6244 aumento de fosfo-STAT3 em células TPC-1, aumentou-fosfo AKT e fosfo-S6 em células MZ-CRC1 e aumento de fosfo-RET em PCCl3-RET /PTC3 células (Fig. 5A, B). Não há nenhuma evidência até agora demonstrando uma associação funcional entre RET e JAK. Para determinar se a diminuição da fosfo-RET foi devido a efeitos fora do alvo de AZD1480, que knockdown JAK1 expressão /2 em TPC-1, MZ-CRC1 e células T por interferência curto (Si) do ARN. Às 48 horas, os níveis de JAK1, JAK2 e fosfo-STAT3 foram regulados negativamente em todas as linhas celulares, com nenhum efeito sobre a fosfo-RET, fosfo-ERK1 /2 e fosfo-S6 (Fig. 6A). Em contraste com AZD1480, JAK1 /2 knockdown não diminuiu a proliferação de qualquer das linhas de células, como pode ser visto pela incorporação de BrdU (fig. 6B). Foi realizado um ensaio de cinase in vitro e verificou que AZD1480 diretamente inibiu a atividade RET quinase:. 40% de inibição a 0,001 mM, 90% de inibição a 0,1 mM e 99% em 1? M (Fig. S3)

(A ) TPC-1, MZ-CRC1, TT e uma (B) PCCl3-RET /PTC3 linha celular doxiciclina indutível foram tratadas durante 24 horas com AZD1480 (1 uM), AZD6244 (1 uM), ou uma combinação de ambos os fármacos. extractos de proteína total de células foram sondadas com anticorpos para os efectores indicados da JAK /STAT3, ERK /MAPK e PI3K /AKT vias de sinalização, bem como para fosfo-RET Y1062. No painel inferior da CPT-1, o DMSO (D) pista não é contíguo à AZD6444 (6244) pista, no mesmo gel. (C) TPC-1 secções representativas dos xenoenxertos foram sondadas para a activação da STAT3 (fosfo-STAT3), ERK /MAPK (fosfo-ERK1 /2) e PI3K /AKT (fosfo-S6) vias de sinalização. A quantificação é representada graficamente (média ± SE). * P 0,05; ** P . 0.001

(A) A expressão de JAK1 e /ou JAK2 foi regulada negativamente por siRNA em TPC-1, MZ-CRC1 e linhas de células T. Os níveis das proteínas indicadas e o seu estado de fosforilação foi determinada após 48 horas, por análise de Western-blot. proliferação (B) celular foi medida por incorporação de BrdU, 48 horas após a transfecção com uma combinação de siRNAs tendo como alvo tanto JAK1 e JAK2. Os resultados representam a média ± DP de três experiências independentes. * P . 0,05

Foram examinados os níveis de fosforilação de STAT3, ERK e S6 nos TPC-1 xenoenxertos tratados com veículo, AZD1480 e AZD6244. De modo semelhante ao que foi descrito em TPC-1 e as outras linhas de células activadas por RET

in vitro

, inibidor de JAK levou a uma diminuição significativa dos níveis de fosfo-STAT3 (p 0,001) fosfo-S6 e no tumor, enquanto nenhuma redução foi observada no veículo ou AZD6244- tumores tratados (Fig. 5C). níveis de fosfo-ERK não foram alteradas entre os grupos AZD1480 controle e e foram significativamente menores (p = 0,01) no grupo tratado AZD6244- (Fig. 5C).

Discussão

RET

alterações genéticas são oncogênicos “drivers” na patogénese do cancro de tiróide, particularmente na MTC e PTC. Oncogénica RET é um activador potente da ERK /MAPK e PI3K e podem induzir a expressão de mediadores inflamatórios, tais como CCL2, CXCL-1, GM-CSF, IL-1β e IL-6 [5], [25] – [ ,,,0],27]. Além disso, RET /PTC e RET mutante pode induzir fosforilação da STAT3 quer directamente, [14], [28] ou de um modo JAK-dependente [29]. JAKs são tirosina quinases que medeiam a activação de IL-6 dependente de STAT3, o que foi mostrado para promover a progressão do cancro em numerosos exemplos de tumores sólidos. Importante, JAK2 mutações de activação são crítico na patogénese de desordens mieloproliferativas e que tem levado ao desenvolvimento de inibidores de moléculas pequenas Jaks [22], [23]. Aqui, nós investigamos os efeitos biológicos de uma JAK1 inibidor /2, AZD1480, sobre o crescimento de PTC- e MTC- derivadas linhas celulares de cancro da tiróide abrigar ativando

RET rearranjos e

/PTC

RET

mutações, respectivamente. Observou-se que AZD1480 inibiu o crescimento de TPC-1, MZ-CRC1 e TT com IC

50 500 nM, o que é de 2 a 10 vezes menor que a relatada para outras linhas de células de cancro [23], [30]. O bloco do crescimento foi devida a uma paragem do ciclo celular G1 em células TPC-1, enquanto que na MZ-CRC1 e TT, a inibição JAK aumentou significativamente a apoptose. Por outro lado, um inibidor de MEK1 /2, AZD6244, não conseguiu alterar

In vitro o crescimento de

MZ-CRC1 e TT. Sem aditivos ou sinérgicos efeitos sobre

in vitro

crescimento foram observadas através da combinação de ambos os inibidores. Pelo contrário, AZD6244 (mas não AZD1480) inibiu o crescimento eficiente de um

BRAF

linha celular mutante V600E-, K1. Ambos AZD1480 e AZD6244 teve um efeito mínimo no crescimento de um

RAS

– linha de células mutante, C643. A insensibilidade da célula cancerosa activado-Ret a inibição de MEK foi anteriormente demonstrado, em oposição à alta sensibilidade de células de cancro da tiróide expressam

BRAF V600E

[31]. Esta resistência pode reflectir a capacidade de RET oncogénico para activar as vias de sinalização alternativas, particularmente a via PI3K /AKT /mTOR [32]. Além disso, a regulação positiva de AZD6244 causada fosfo-RET Y1062 no modelo PCCl3-RET /PTC3, bem como de efectores de mTOR, fosfo-S6 e fosfo-AKT, em MZ-CRC1. Sobreactivação da via mTOR em resposta à inibição de MEK pode possivelmente ser explicado por alívio de inibição de feed-back e foi previamente relatado noutros modelos de [33], onde medeia a resistência das células de AZD6244 [34], [35].

Além disso, AZD1480 fortemente inibida a

in vivo

crescimento de TPC-1 xenotransplantes, resultando em regressão do tumor, enquanto que os tumores de AZD6244- ratinhos tratados cresceu ligeiramente mais do que os tumores de controlo, sugerindo que o tratamento

RET

-mutated cancros da tiróide com este inibidor pode promover o crescimento do tumor. Em TPC-1 tumores, e à semelhança dos efeitos

in vitro

, AZD1480 bloqueou a proliferação apesar de não afetar significativamente a apoptose. No entanto,

in vivo

, observou-se a regressão do tumor marcada, com tumores exibindo extensas áreas de tecido necrosado e uma redução significativa no número de vasos sanguíneos. Este último pode ter causado uma queda no fornecimento de nutrientes e oxigênio para os tumores, provavelmente explicando a necrose acentuada e, consequentemente, a redução do tumor. Tais efeitos sobre o crescimento do tumor foram anteriormente documentadas em outros modelos de cancro (pulmão, mama, próstata, cérebro) [23], [36], [37]. Nestes modelos, a inibição JAK era particularmente eficaz em linhas de tumores /células-fosfo-STAT3 positivo. No entanto, AZD1480 também foi mostrado para inibir o crescimento de linhas celulares de cancro independentemente da activação da STAT3, particularmente em doses elevadas [23], possivelmente devido a efeitos fora do alvo da droga. Em um relatório recente, AZD1480 bloqueada tanto JAK /STAT3 e FGFR3 sinalização em células de mieloma [30]. Para testar se os efeitos inibidores do crescimento de AZD1480 eram dependentes de STAT3 em nossos modelos, bateu-se STAT3 em células TPC-1. STAT3 deficiência nestas células não afectou a sua sensibilidade para inibição de JAK, em comparação com células de controlo. Além disso, AZD1480 foi igualmente eficaz no bloqueio do crescimento de STAT3- deficiente TPC-1, que xenoenxertos indicadas necrose extensa, semelhante a tumores parentais TPC-1 tratadas com AZD1480. Além disso, bateu-se JAK1 e JAK2 expressão em TPC-1, MZ-CRC1 e linhas de células de TT por siARN, que não teve nenhum efeito sobre a sua proliferação. Estes dados demonstram que AZD1480 inibe o crescimento de linhas celulares de cancro da tiróide ativada por RET

in vitro

e

in vivo

, independentemente da JAK /STAT3 sinalização em células cancerosas.

procurou-se identificar os mecanismos que explicam os efeitos inibidores de crescimento de AZD1480

in vitro

e

in vivo

. Em todas as linhas celulares, AZD1480 eficientemente reduzidos níveis de fosfo-STAT3, incluindo a linha celular de TT C634W mutante, embora esta forma oncogénica de Ret foi descrito como activação da STAT3 independentemente de JAK, através de dois locais de ligação no RET (Tyr752 e Tyr928) [28] . Sugerimos que os nossos resultados diferem devido ao uso de um inibidor JAK diferente, com diferentes potências, do que a usada por Schuringa

et

al

.

Até agora, nenhuma dados têm demonstrado um papel para a activação de JAK RET (Y1062 fosforilação) nem na activação dos seus MAPK e PI3K a jusante vias. Nós determinamos que AZD1480 bloqueado fosforilação RET Y1062 em TPC-1, MZ-CRC1, TT, bem como num modelo de condicional

RET /PTC3

expressão. Além disso, embora não AZD1480 inibir a via de ERK /MAPK, na maioria das nossas linhas celulares, que bloqueou a activação do AKT efectores PI3K e S6. Resultados semelhantes foram obtidos no AZD1480- tratada TPC-1 xenoenxertos, onde não há diferenças em níveis de ERK /MAPK foram detectados, e fosfo-S6 foi significativamente regulada negativamente. Nós demonstramos que estes efeitos eram independentes de JAK, tal como fosfo-RET, fosfo-ERK e de fosfo-S6 níveis não se alterou após a JAK1 /2 knockdown por siRNA. Nós demonstramos que AZD1480 inibe directamente a actividade de quinase de Ret recombinante de uma forma dependente da dose, o que provavelmente sublinha os efeitos inibidores específicos e mutante-Ret de AZD1480 sobre o crescimento ea sobrevivência de células de cancro da tiróide. Na verdade,

in vitro

ensaios de cinase de um relatório anterior demonstraram que AZD1480 pode inibir ~ 50% e 90% da actividade RET em 0.1 e 1 PM concentrações, respectivamente [23].

Concluindo, nós mostramos que o inibidor de JAK1 /2, AZD1480, pode bloquear o crescimento e induzir a morte celular de linhas celulares de cancro da tiróide abrigar formas distintas de oncogênico

RET in vitro

e

in vivo

. Nestas células, AZD1480 inibe provavelmente RET directamente, que conduz à consequente bloqueio da /AKT via PI3K /mTOR, que parece ser a força motriz preferencial oncogénica de células activadas por RET. Embora estes efeitos foram independentes da STAT3 em células de cancro da tiróide, AZD1480 eficazmente inibida fosfo-STAT3 no estroma, particularmente em células endoteliais. Na verdade, inibidores de JAK são conhecidos moduladores do microambiente através da inibição da angiogénese e a mobilização de células mielóides de um modo dependente STAT3- [36], [38]. Tendo em conta a diminuição significativa da vascularização de tumores tratados AZD1480- e consequente necrose tumoral, que sugerem que a inibição de fosfo-STAT3 no microambiente (células endoteliais) coopera com a inibição RET em células de cancro para induzir a regressão do tumor. Além disso, não se pode descartar que outras tirosina-quinases independente de RET (tais como FLT1, FGFR [23]) podem ser afectados por AZD1480, contribuindo para a paragem do crescimento de células de tumores e RET-activados.

Importante, MZ -CRC1, que abriga o RET M918

mutação associada à síndrome MEN2B, foi altamente sensíveis aos efeitos inibidores do crescimento de AZD1480. Pacientes com diagnóstico de MEN2B desenvolver MTC rapidamente progressiva, multifocal com metástases linfáticas, que geralmente necessitam de tireoidectomia total antes de 1 ano de idade [39]. A maior sensibilidade dos MZ-CRC1 de AZD1480 em comparação com o TT (que alberga a mutação C634W menos agressiva), pode ser explicado por diferentes capacidades de MEN2A- e MEN2B- RET mutantes para activar percursos a jusante, ou seja, a via PI3K /AKT [40]. Ao todo, estes resultados suportam o uso de AZD1480 para tratar formas agressivas de câncer de tireóide, especialmente MEN2B- MTC.

Materiais e Métodos

Ética declaração

Todos os procedimentos de animais pesquisa foram incluídos em um protocolo (número 0011091) aprovado pelo Comité de MSKCC Institucional animal Cuidado e Uso (IUAC), seguindo o Welfare Act Animais de laboratório, o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de laboratório e as diretrizes e políticas para a experiência de roedores.

cultura de células e drogas

TPC-1, K1, C643 (fornecida pelo Prof. Marc Mareel, Bélgica) e TT (adquirido a partir de American Type Culture Collection – ATCC) [29], [ ,,,0],41] As linhas celulares foram mantidas em meio RPMI, 10% de FBS, 1% de Penstrep. PCCl3-RET /PTC3 foi fornecida pelo Dr. James Fagin e foi cultivada como anteriormente descrito [13]. MZ-CRC1 (fornecida pelo Dr. Robert Hofstra, Países Baixos), [29] e 293T (ATCC) foram mantidas em DMEM, 10% de FBS, 1% de Penstrep. Todos os reagentes de cultura celular foram da GIBCO, Invitrogen, Carlsbad, EUA. AZD1480 [23] e AZD6244 [24] foram presentes de Dennis Huszar e Michael Zinda (AstraZeneca, London, UK).

infecções lentivirais e geração de linhas celulares estáveis ​​

O STAT3 shRNA construto lentiviral foi anteriormente descrito [42]. As partículas virais que transportam as construções foram gerados em células 293T. As partículas virais presentes no sobrenadante foram precipitadas utilizando uma solução de polietileno-glicol vírus precipitação (Sistema Biosciences LLC, Mountain View, CA, EUA). construções de lentivírus incluiu uma codificação cassete de transcrição reforçada proteína verde fluorescente [42], que permitiu a selecção de células, classificando.

extractos de proteínas de células inteiras e ocidentais blotting

As células foram lisadas em ensaio de radio-imunoprecipitação tampão, suplementado com inibidores da protease e da fosfatase (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EUA). As proteínas foram quantificadas utilizando um ensaio de Bradford modificado (BioRad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EUA), resolvidas por SDS-PAGE e transferido para Hybond ECL membranas (GE Healthcare, Little Chalfont, Inglaterra). Os anticorpos primários de fosfo-STAT3 (Tyr705), STAT3, fosfo-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204), ERK1 /2, fosfo-AKT (Ser473), AKT, fosfo-S6 (Ser235 /236), e S6 foram de Cell Signaling Technologies, Inc, Danvers, MA, EUA. anticorpo de ciclina D1 era de Neomarkers, Fremont, CA, EUA. anticorpo actina, fosfo-RET (Y1062), RET total (C-19), e p27 foram de Santa Cruz BT, Santa Cruz, EUA, BCL-2 de anticorpo foi da Dako, Glostrup, Dinamarca, e α-tubulina foi da Sigma Aldrich , St. Louis, MO, EUA. anticorpos secundários conjugados peroxidase eram de Santa Cruz BT.