cancro do pulmão de células não pequenas

Abstract

abrigando mutações do receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) atinge uma resposta significativa aos inibidores de cinase de EGFR-tirosina (TKI). No entanto, a resistência adquirida ao EGFR-TKI poderia afetar os resultados a longo prazo em quase todos os pacientes. Para identificar os potenciais mecanismos de resistência, estabelecemos linhas celulares resistentes a EGFR-TKI do pulmão humano linhas celulares de cancro and11-18 PC9, que abrigava activação mutações de EGFR. Uma linha celular resistente a partir de erlotinib PC9 e duas linhas de células resistentes e erlotinib-duas linhas de células resistentes a gefitinib de 11-18 foram estabelecidos de maneira independente. perda quase completa do gene de EGFR mutante delE746-A750 foi observada nas células erlotinib resistentes isoladas de PC9, e perda parcial da cópia mutante do gene de EGFR L858R foi especificamente observado nas células erlotinib- e resistentes a gefitinib 11-18. No entanto, a activação constitutiva de sinalização a jusante de EGFR, PI3K /Akt, foi observada mesmo após a perda do gene de EGFR mutado em todas as linhas de células resistentes, mesmo na presença do fármaco. Nas células erlotinib-resistente de PC9, PI3K constitutiva /activação de Akt foi eficazmente inibida pela lapatinib (uma dupla TKI de EGFR e HER2) ou BIBW2992 (pan-TKI de proteínas da família do EGFR). Além disso, erlotinib ou com HER2 HER3 ou knockdown pelos ARNic cognatos também inibida de PI3K /Akt activação. A transfecção de ADN complementar activação do EGFR mutante restaurou a sensibilidade ao fármaco na linha celular resistente a erlotinib. Nosso estudo indica que a perda de dependência de mutante EGFR resultou em ganho de dependência de ambos HER2 /HER3 e PI3K /Akt sinalização para adquirir resistência ao EGFR-TKI

Citation:. Tabara K, Kanda R, Sonoda K, Kubo T, Murakami Y, Kawahara, A. et al. (2012) Perda de Ativação gene mutante EGFR contribui para a resistência adquirida a tirosina-cinase EGFR inibidores em células de câncer de pulmão. PLoS ONE 7 (7): e41017. doi: 10.1371 /journal.pone.0041017

editor: Yiqun G. Shellman, University of Colorado, Estados Unidos da América

Recebido: 21 de fevereiro de 2012; Aceito: 15 de junho de 2012; Publicação: 17 de julho de 2012

Direitos de autor: © 2012 Tabara et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta pesquisa foi apoiado por bolsas-in-Aid para a Investigação científica em Áreas prioritárias (Câncer) do Ministério da Educação, Cultura, Desporto, Ciência e Tecnologia do Japão e pela Research Controle 3º Período Integral para o cancro do Ministério da Saúde, Trabalho e Bem-estar, Japão. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) é uma das neoplasias malignas mais comuns e uma das principais causas de morte no mundo. O desenvolvimento de fármacos anti-cancerígenos que têm como alvo o receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) tem melhorado o tratamento de NSCLC. Dois inibidores de cinase de EGFR de tirosina-representativos (EGFR-TKI), gefitinib e erlotinib, têm uma estrutura comum de quinazolina e ter sido aprovado para o tratamento de NSCLC progressiva. Ambos erlotinib e gefitinib mostrar semelhante selectividade de inibição de quinase com base na análise quantitativa de pequena interação molécula-quinase mapas para 38 inibidores da quinase [1], e mostrar a eficácia terapêutica contra a pacientes com NSCLC progressivos [2] – [4].

os activadores mutações de EGFR mais comuns são deleção em enquadramento no exão 19 (delE746-A750) e a mutação de ponto a substituição de leucina por arginina no codão 858 de exon21 (L858R) [5] – [9]. Estes dois grandes mutações responsáveis ​​por 85-90% de todas as mutações e melhorar a eficácia terapêutica dos fármacos alvo EGFR [10] – [13]. Além disso, essas mutações ativadoras ganharam vício de EGFR em células de câncer de pulmão, resultando em maior susceptibilidade ao EGFR-TKI tais como gefitinib e erlotinib [6], [14] – [16].

Um problema sério com EGFR -tki tratamento é o aparecimento de tumores resistentes aos medicamentos. Para resistência adquirida, mutação secundária no gene de EGFR T790M [16] – [18] ou de activação alternativa independente-EGFR de vias de sinalização de crescimento celular, incluindo a activação de c-Met é bem conhecido [19], [20]. A perda de expressão de PTEN é um dos mecanismos de resistência adquirida, o que foi demonstrado pelo isolamento de mutantes resistentes a gefitinib a partir de células que abrigam PC9 mutação de activação do EGFR [21], [22]. Além das causas bem caracterizados de resistência aos medicamentos em pacientes com câncer de pulmão, elucidação de outro mecanismo de resistência adquirida é essencial para o desenvolvimento de novas drogas alvo-EGFR.

No presente estudo, erlotinib- e gefitinib linhas de células resistentes ao foram estabelecidas a partir de duas linhas celulares de cancro de pulmão humano, as células PC9 abrigar mutação delE746-A750 e 11-18 células abrigando mutação L858R, respectivamente. Surpreendentemente, foi observada a perda parcial ou completa da cópia do gene de EGFR mutante na erlotinib- e linhas de células resistentes a gefitinib. O significado clínico da perda de EGFR mutante é discutido em relação à sua estreita associação com a aquisição de resistência aos medicamentos para EGFR-TKI em pacientes com NSCLC.

Materiais e Métodos

Cultura de Células Reagentes e

linhas celulares de cancro de pulmão humano, PC9, QG56 e 11-18 foram cultivadas em meio RPMI suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS), como descrito anteriormente [14], [21]. PC9 e QG56 foram gentilmente cedidas pelo Dr. Yukito Ichinose (Organização Nacional Hospital Kyushu Cancer Center, Fukuoka, Japão) e 11-18 foi pelo Dr. Kazuhiko Nakagawa (Universidade Kinki, Osaka, Japão). Erlotinib foi gentilmente cedida por F. Hoffmann-La Roche Ltd, gefitinib foi pela AstraZeneca Inc. BIBW2992 foi comprado de Selleck Chemicals, SU11274 e wortmanina eram da Calbiochem, LY294002 foi de Cell Signaling Technology e lapatinib foi de Toronto Research Chemicals. Os anticorpos anti-HER2 e anti-fosfo-HER2 foram adquiridos a partir de Upstate Biotechnology, anti-fosfo-EGFR, anti-EGFR, anti-fosfo-HER3, anti-fosfo-c-Met, anti-fosfo-Akt, anti-Akt, anti-PTEN, anti-fosfo-ERK1 /2, anti-ERK1 /2 e específicos da mutação (L858R no exão 21 e eliminação E746-A750 em 19 exões) anticorpos foram de Cell Signaling Technology, anti-HER3 e anti-C -Met anticorpos eram de Santa Cruz Biotechnology, anticorpo anti-tubulina α era da Sigma-Aldrich, e anticorpo anti-GAPDH foi de Trevigen. DNAs complementar (cDNA) para EGFR e ativando EGFR mutante foram gentilmente cedidas pelo Dr. Willam Pao e Dr. Nishio. As células foram transfectadas com ADNc utilizando Lipofectamina LTX reagente PLUS e Opti-MEM (Invitrogen) de acordo com as recomendações do fabricante. EGF humano recombinante foi adquirido à Peprotech. Os pequenos RNAs interferentes (siARN) correspondentes para HER2 (5′-AAACGUGUCUGUGUUGUAGGUGACC-3 ‘), HER3 (5′-GGCAGUGUAUAAUCUAUCUCCACUA-3′) e PIK3CA (5’-CCCUAUUGGUGGUGUUACUGGAUCAAAU-3 ‘) foram adquiridos a partir de Invitrogen, e correspondendo ao EGFR (5’-GAGGAAAUAUGUACUACGA-3 ‘) foram adquiridos da Sigma-Aldrich. As células foram transfectadas com o ARNic em cadeia dupla utilizando Lipofectamina e RNAiMAX Opti-MEM (Invitrogen) de acordo com as recomendações do fabricante.

Citotoxicidade

em crescimento exponencial suspensões de células foram semeadas em cada poço e no dia seguinte o foram adicionadas as concentrações indicadas dos diferentes fármacos. Após incubação durante 72 h, a citotoxicidade foi determinada como descrito anteriormente [21].

Western Blot Analysis

As células foram lavadas com PBS gelado e lisadas em tampão de Triton X-100 (50 mmol /L de HEPES, 150 mmol /L de NaCl, 50 mmol /L, NaF, 1% de Triton X-100, e 10% de glicerol, contendo 5 mmol /L de EDTA, 1 mmol /L de fluoreto de fenilmetilsulfonilo, 10 ug /ml de aprotinina, 10 ug /mL de leupeptina, e 1 mmol /L de ortovanadato de sódio), e as proteínas de lisados ​​celulares foram separadas por SDS-PAGE e transferidos para membranas Immobilon (Millipore Corp.), como descrito anteriormente (21). Após transferência, as membranas foram incubadas em solução de bloqueio, as sondadas com anticorpos diferentes, lavou-se, e visualizada utilizando anticorpos conjugados com peroxidase de rábano secundárias (GE Healthcare) e reagente de quimioluminescência aumentada (Amersham).

a, Western blot a análise mostra a expressão de pEGFR, EGFR, pHER2, HER2, pHER3, HER3, PC-Met, c-Met, PTEN, pAkt, Akt, pErk1 /2, e 2 proteínas /ERK1 e α-tubulina como controlo de carregamento. B, as células em crescimento exponencial /ER1 PC9 PC9 e foram expostos a diferentes doses de erlotinib, durante 5 horas, e seguido por análise Western Blot. C, crescimento exponencial 11-18, 11-18 /ER1-7 e 11-18 células /ER2-1 foram expostos a várias doses de erlotinib durante 5 horas, e seguido por análise de Western blot.

Human RTK Arrays

Proteome Profiler humanos fosfo-RTK de anticorpos (R D Systems) foram utilizados de acordo com as instruções do fabricante

Análise PLACE-SSCP

LUGAR. -SSCP análise foi realizada como descrito anteriormente [23] – [25]. segmentos genómicos contendo sequências mutadas foram amplificados por PCR a partir de ADN extraídos de cinco linhas de células (11-18, 11-18 /ER1-7, 11-18 /ER2-1, 11-18 /GEF10-1, e 11-18 /GEF20-1), e células umbilicais humanas normais endoteliais de veia (HUVEC) que foram adquiridos a partir de Lonza Inc. Walkersville Para analisar a mutação L858R, exão 21 do gene de EGFR foi amplificado utilizando os iniciadores (para a frente: 5′-ATTCAGGGCATGAACTACTTGG-3 ‘, reverso: 5’-GTTACCTCCTTACTTTGCCTC TC-3 ‘) e TaKaRa ExTaq polimerase (Takara Bio Inc.). Os arquivos de rastreio obtidos (.fsa) serviu como arquivos de entrada para QSNPlite para análise [26].

Alelo Quantificação

QSNPlite calcula a taxa de pico de altura (R

h) de dois alelos (de tipo selvagem e alelo mutante) em cada corrida SSCP. Para estimar o número de cópias por célula de alelos em cada uma das células de teste de cinco (ver subsecção anterior), as experiências de mistura foram realizadas utilizando células HUVEC como referência. Neste caso, presume HUVECs foram para transportar duas cópias do alelo de tipo selvagem por célula. Rh valores para cada uma das células de teste cinco foram obtidos como a média das cinco repetições, cada um dos quais consistem em células de teste sozinho e mistura em partes iguais-parte do teste e da referência. O número de cópias dos dois alelos nas células de teste foi estimada a partir da diferença de R

valores h entre as células testados isoladamente ea mistura igual partes, da seguinte forma: suponha que as células de teste levar cópia X por célula de wild- digite cópia EGFR, e Y por célula de EGFR mutante. Em seguida, o

h de análise de SSCP para células de teste R, R

h (teste), é representada por; R

h (teste) = M × (X /Y), onde M é uma constante dependente do alelo que vem a partir das diferenças em eficiência de amplificação por PCR, a eficiência de rotulagem, e a forma do pico, entre o tipo selvagem e alelos mutantes. Do mesmo modo, R

h de uma mistura igual de células-parte de teste e de referência a, R

H (mistura), é dada pela seguinte equação.

A partir das duas equações anteriores, X e Y são obtidos como se segue.

as equações acima implicam que cópia-número absoluto do alelo mutante nas células testadas não pode ser estimado, porque M é desconhecido. No entanto, os valores relativos de cópia-números para o mesmo alelo mutante em células de teste diferentes pode ser estimado, pois M é uma constante.

A, Western blot mostrando a expressão de delE746-A750 EGFR e EGFR total PC9 e PC9 células /ER1. B, de detecção de tipo selvagem e as sequências de mutação utilizando iniciadores específicos. células PC9 mostrar tanto do tipo selvagem e bandas específicas mutante, enquanto PC9 /ER1, 11-18, e QG56 células mostram banda apenas o selvagem-tipo específico. Mut, exon19 mutante, e WT, do tipo selvagem exon19. C, mostra a análise de PCR de heteroduplex (Mut /WT) e homoduplex (wt /wt Mut e /Mut) em células PC9, e apenas homodúplex (p /p) em células PC9 /ER1, 11-18 células abrigando mutação L858R, e QG56 células contendo EGFR de tipo selvagem.

a, análise de mancha de Western utilizando anticorpo específico para o anticorpo e L858R total de EGFR reconhecendo tanto de tipo selvagem e mutante de EGFR. Os níveis de expressão de EGFR mutante (L858R), EGFR total, e L858R contra EGFR total (L858R /total de EGFR) são normalizados por seus níveis de expressão em células 11-18. A análise Western blot com células endoteliais primárias humanas (HUVEC) mostra a expressão de EGFR total, mas não mutante L858R EGFR. B, as sequências de ADN de 15 bases lê redor da mutação L858R em 11-18, 11-18 /ER1-7, e 11-18 /ER2-1 células são comparados. As setas indicam a base de 2573. Note-se que as sequências de nucleótidos de 11-18 em 2573 era G /T heterozigoto. C, análise LUGAR-SSCP de amostras de DNA de 11-18, 11-18 /ER1-7, e 11-18 /ER2-1 células na ausência ou na presença de quantidades iguais de ADN a partir de células endoteliais vasculares humanas (HUVECs) são mostrando. Dois picos mostram-tipo selvagem (WT) e do gene de EGFR mutante (Mut) (a). Com base nas equações mostradas em Materiais e Métodos, copiar alterações numéricas do tipo selvagem e genes EGFR mutantes são estimadas (b).

PCR Análise

Para analisar a mutação de deleção , exão 19 do gene de EGFR foi amplificada utilizando os seguintes iniciadores de PCR para a frente:

de tipo selvagem específicos, ‘, 5′-TCCCGTCGCTATCAAAACATC-3 mutante específica “, tanto de tipo selvagem 5′-CCGTCGCTATCAAGGAATTAAG-3 e mutante tipo, 5’-ATGTGGCACCATCTCACAATTGCC-3 ‘primer reverso 5′-CCACACAGCAAAGCAGAAACTCAC-3’ e TaKaRa ExTaq polimerase.

Para analisar a mutação de deleção, exon5 e 8 do gene PTEN foi amplificada utilizando os seguintes PCR primers para a frente : exon5, ‘exon8, 5′-GCAACAGATAACTCAGATTGCC-3′ 5′-CTCTGGAATCCAGTGTTTCTTT-3 iniciador inverso:. exon5, 5’- CCAATAAATTCTCAGATCCAGG-3 ‘exon8, 5′-GTTCTTCATCAGCTGTACTCCT-3’

Para analisar o mutação de deleção, gene Akt foi amplificada utilizando os seguintes PCR primers para a frente: “iniciador inverso: 5′-GCGCCACAGAGAAGTTGTT-3 ‘5’-GGGTCTGACGGGTAGAGTGT-3

Seleção de Pacientes

foram selecionados NSCLC primária. abrigando mutações EGFR, tais como exão 19 delE746-A750 eo L858R mutação pontual exão 21 a partir dos registros de status de mutação EGFR do Departamento de diagnóstico de Patologia do Hospital Universitário Kurume, Kurume, Japão. Esses registros estado da mutação EGFR tinha sido determinado pelo DNA sequenciação directa ou ensaio braçadeira PNA-LNA PCR [27], [28].

As amostras citológicas de pacientes com cancro

amostras de células foram obtidas a partir pleural efusão (5 casos), linfonodo citologia aspirativa por agulha fina (2 casos), derrame pericárdico (1 caso), e no líquido cefalorraquidiano (3 casos), de acordo com um estudo anterior [28]. O derrame pleural e fluido cerebrospinal foram centrifugadas a 1500 rpm durante 10 min, e o fluido sobrenadante foi removido. O sedimento foi espalhada sobre lâminas de vidro, e foi fixado em 95% de etanol durante a noite. Citologia aspirativa agulha de nódulos linfáticos foi realizada usando uma agulha descartável de calibre 23 ligada a uma seringa de plástico de 10 ml, e a lâmina foi fixada durante a noite em 95% de etanol.

imunocoloração para Activar EGFR Mutações

análise a imunocoloração foi realizada usando anticorpos específicos anti-EGFR delE746-A750 (6B6), a-específica do mutante de EGFR L858R (43B2), e anticorpos de EGFR total (D38B1) (Cell Signaling Technology), tal como descrito anteriormente [27].

Ética Declaração

O estudo de amostras clínicas foi aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade de Kurume.

a, B, crescimento exponencial células PC9 /ER1 PC9 e foram expostos a várias doses wortmanina de (a) e LY294002 (B) durante 5 horas, e seguido por análise Western blot. células C. PC9 e PC9 /ER1 foram tratados com PIK3CA siRNA ou embaralhar (SC) siRNA por 48 h, e seguido por análise de western blot.

Resultados

Estabelecimento de Erlotinib- e linhas de células resistentes a Gefitinib de PC9 e 11-18 células

Para isolar linhas celulares de erlotinibe resistentes de células PC9 abrigando delE746-A750, e de 11-18 células portadoras L858R, ambas as linhas de células foram cultivadas em stepwise doses crescentes de erlotinib de 0,05 a 10