Abstract

Fundo

Um dos principais mecanismos que poderiam produzir resistência aos medicamentos antineoplásicos em células cancerosas é o ATP vinculativo cassete transportadores (ABC). Os transportadores ABC pode diminuir significativamente a concentração intracelular de drogas antineoplásicas, aumentando o seu efluxo, diminuindo assim a actividade citotóxica dos fármacos antineoplásicos. Um desses transportadores, as múltiplas proteínas resistentes 7 (MRP7, ABCC10), foi recentemente mostrado para produzir resistência a fármacos anti-neoplásicos, aumentando o efluxo de paclitaxel. Neste estudo, foram examinados os efeitos de BCR-Abl tirosina-cinase imatinib inibidores, nilotinib e dasatinib sobre a actividade e a expressão da MRP7 em células HEK293 transfectadas com MRP7, designado HEK-MRP7-2.

Metodologia e /ou principais conclusões

Nós relatamos pela primeira vez que o imatinib e nilotinib revertida multirresistência mediada por MRP7. Os resultados do ensaio de MTT indicaram que a expressão em células HEK MRP7-MRP7-2 não foi significativamente alterada pela incubação com 5 uM de imatinibe ou nilotinib por até 72 horas. Além disso, o imatinib e nilotinib (1-5? M) produziu uma inversão dependente da concentração significativa de resistência a múltiplas drogas mediada por MRP7 aumentando a sensibilidade das células HEK-MRP7-2 ao paclitaxel e vincristina. Imatinib e nilotinib, a 5? M, aumentou significativamente a acumulação de [

3H] paclitaxel em células HEK-MRP7-2. A incubação das células de HEK-MRP7-2 com imatinib ou nilotinib (5 uM) também inibiu significativamente o efluxo de paclitaxel.

Conclusões

O imatinib e o paclitaxel nilotinib resistência mediada por MRP7 reversa, a maioria provavelmente devido à sua inibição do efluxo de paclitaxel através MRP7. Estes achados sugerem que o imatinib ou nilotinib, em combinação com outros fármacos anti-neoplásicos, podem ser úteis no tratamento de certos cancros resistentes

citação:. Shen t, Kuang YH, Ashby CR Jr, Lei Y, Chen A, Zhou Y, et al. (2009) Imatinib e nilotinib reverter a resistência a múltiplas drogas em células de câncer inibindo a actividade efluxo do MRP7 (ABCC10). PLoS ONE 4 (10): E7520. doi: 10.1371 /journal.pone.0007520

editor: Debbie Fox, do Instituto de Pesquisa para crianças do Hospital Infantil de Nova Orleans, Estados Unidos da América

Recebido: 11 de junho de 2009; Aceito: 02 de setembro de 2009; Publicado: 20 de Outubro 2009 |

Direitos de autor: © 2009 Shen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por fundos a partir de sementes de Pesquisa da Universidade de St. John Grant No. 579-1110-7002 (Z.-S. Chen) e Primary Care Medicine Associates, PC (Flushing, Nova Iorque) concessão No. 582-2082-7601 (Z. -S. Chen). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Embora o uso clínico de cirurgia, radioterapia e quimioterapia têm diminuído as taxas de recorrência de cancro, a resistência celular a fármacos quimioterapêuticos é um obstáculo importante no tratamento do cancro [1], [2]. A eficácia da quimioterapia pode ser limitada devido à resistência adquirida a partir de um tratamento anterior. Consequentemente, estratégias de pesquisa para contornar essa resistência em células de cancro tornaram-se um foco atual para o desenvolvimento de novas estratégias de quimioterapia combinações. Tanto a resistência ao fármaco intrínseca e adquirida pode produzir várias alterações em várias vias celulares, conduzindo a uma diminuição na citotoxicidade, e, assim, a eficácia de drogas antineoplásicas, [3]. Portanto, os pacientes de cancro que recebem tratamentos múltiplos pode tornar-se cada vez mais insensível a agentes quimioterapêuticos.

Um dos mecanismos celulares primárias que podem produzir resistência à terapia antineoplásica envolve o efluxo de fármacos a partir de células cancerosas por transportadores transmembranares ou bombas específicas [4]. Estas proteínas transportadoras são originários da superfamília de cassete de ligação a ATP (ABC) transportadores que partilham propriedades estruturais e funcionais comuns [5]. Um certo número de estudos demonstraram que a maioria dos membros da família de transportadores ABC C são proteínas de resistência a multidrogas (PRM), que são caracterizadas por uma resistência cruzada a muitas drogas estruturalmente não relacionados [2], [4].

Uma série de estudos sugere que as células cancerosas que expressam o transportador MRP7 família ABC C /ABCC10 pode desenvolver resistência a vários fármacos quimioterapêuticos. Por exemplo, humano adenocarcinoma da glândula salivar (PIG), as células que sobre-expressam ARNm MRP7 e a apresentação de proteína MRP7 resistência significativa à vincristina [6]. expressão MRP7 tem também sido identificados imuno-histoquimicamente em ratinhos portadores de tumor xenoenxertado com PIG humano na sequência de tratamento com vincristina [6]. Além disso, E

217βG, um inibidor competitivo de transporte MRP7, diminuiu de forma significativa a acumulação de docetaxel em células PIG humanos [6]. Em geral, os compostos que são inibidores da actividade de transporte MRP7 atenuar ou resistência em células de cancro que expressam a proteína MRP7 reversa.

As células que sobre-expressam MRP7 conferir resistência a várias drogas anti-cancro, incluindo o paclitaxel, a vincristina e a vinblastina [7]. Trabalhos recentes também relataram que as células-overexpresssing MRP7 conferir resistência a análogos de nucleosídeos e epithilone B [8]. Anteriormente, no nosso laboratório mostraram que cepharanthine, um alcalóide derivado de biscoclaurine, inverteu a resistência de paclitaxel mediada por MRP7 [9].

inibidores de tirosina-cinase (TKI) podem reverter a resistência das células de cancro a drogas antineoplásicas por meio de vários mecanismos. Por exemplo, em células humanas PIG, MRP7, a P-gp, e MRP1 foram todas detectadas após exposição prolongada a vincristina [6]. Recentemente, nós e outros têm relatado que alguns dos TKI são potentes moduladores de transportadores ABC, incluindo P-gp e BCRP /ABCG2 [10], [11]. Os resultados recentes do nosso laboratório sugerem que nilotinib inverte significativamente P-GP- e mediada por BCRP MDR [12].

Neste estudo, um dos principais objetivos foi identificar compostos TKI susceptíveis de anular droga mediada por MRP7 resistência. Por conseguinte, é possível que os inibidores da tirosina quinase, em combinação com outros fármacos anti-neoplásicos, podem ser úteis no tratamento de cancros que expressam proteínas de MDR, incluindo os transportadores ABC. Uma descoberta importante sobre TKI era que certas chamadas drogas “molécula pequena” podem inibir a atividade de TK por competição com o ATP para a ligação ao domínio catalítico intracelular do receptor de TK, o que produziu uma inibição de várias cascatas de sinalização a jusante por autofosforilação [13]. Curiosamente, imatinib, nilotinib e dasatinib são inibidores da TK do cluster ponto de interrupção região de Abelson (BCR-ABL) e Kit, um receptor TK classe III [14] – [18]. O gene BCR-ABL está associada com uma desregulação da função TK e subsequentemente conduz a uma transformação maligna na leucemia mielóide crónica (LMC) [19], [20]. O reconhecimento do gene BCR-ABL e a sua proteína correspondente levou ao desenvolvimento de medicamentos de pequenas moléculas concebidas para bloquear a activação de Bcr-Abl TKI através de ligação competitiva no local de ligação de ATP [19]. No geral, o objetivo principal deste estudo foi determinar se o BCR-Abl TKI poderia reverter MDR mediada por MRP7.

Materiais e Métodos

2.1. As linhas celulares

HEK293 células e o cDNA MRP7 foram generosamente fornecidos pelo Dr. Gary Kruh (Universidade de Illinois em Chicago, Chicago, IL). As células HEK-MRP7-2 transfectadas e células HEK293 transf ectadas de vector vazio pcDNA3.1 foram estabelecidas a partir de células HEK293 por meio de electroporação [9]. A linha sensível ao fármaco parental de células de carcinoma epidermóide humano KB-3-1 e sua correspondente linha de células-P-gp superexpressão KB-C2 foram gentilmente cedidas pelos Drs. Gottesman (NCI, Bethesda, MD) e Akiyama (Universidade de Kagoshima, Japão), respectivamente. As células KB-C2 foram estabelecidas a partir de células KB-3-1, expondo-as a concentrações crescentes de colchicina de uma forma gradual passo a passo (até 2 ^ g /ml) e colheita das células que eram resistentes [20]. Todas estas linhas celulares foram cultivadas como monocamadas aderentes em frascos com meio modificado por Dulbecco de Eagle (DMEM) suplementado com soro de bovino a 10%, glutamina 2 mM, 100 unidades /ml de penicilina, e 100 ug /ml de estreptomicina sob condições de cultura celular standard num incubadora humidificada contendo 5% de CO

2 a 37 ° C.

2,2. Materiais

DMEM, soro de bovino e penicilina /estreptomicina foram comprados a partir de Hyclone (Logan, UT). Nilotinib (Tasigna®) (Fig. 1B) foi obtido como um presente da Novartis Pharmaceuticals (Basileia, Suíça). Imatinib (Fig. 1A) e dasatinib (Fig. 1C) foram adquiridos de ChemieTeck Inc. (Indianapolis, IN). O paclitaxel, vincristina, doxorrubicina, colchicina, fluoreto de p-aminophenylmethylsulfonyl, albumina de soro bovino, sulfóxido de dimetilo (DMSO) e (4,5-dimetiltiazol-2-il) -3,5-diphenylformazan (MTT), o anticorpo de cabra policlonal 1- contra MRP7 (C-19), o anticorpo monoclonal de ratinho contra a P-gp (P7965), o derivado de rábano de cabra anti-IgG ou anti-ratinho foram adquiridos da Sigma-Aldrich Chemical Co. rotulado com peroxidase (St. Louis, MO) . Um anticorpo policlonal contra MRP1 humano /ABCC1 foi gentilmente cedido pelo Dr. Akiyama (Universidade de Kagoshima, Japão) [21]. Um anticorpo monoclonal contra BXP-34 foi adquirida da BCRP Signet Laboratories Inc. (Dedham, MA). [

3H] paclitaxel (45 uCi /mmol) foi comprado de Moravek Bioquímicos (Brea, CA).

2.3. Preparação de célula lisados ​​

células monocamada confluente em T-25 frasco foram colhidas e lavadas duas vezes com PBS frio. Os extractos celulares foram preparados utilizando o tampão de ensaio de radioimunoprecipitação [1 × PBS, 1% de Nonidet P-40, 0,5% de desoxicolato de sódio, 0,1% de SDS, 100 uM de p-APMSF, leupeptina 10 uM, e 10 uM de aprotinina] durante 30 min sobre ocasional com gelo balançar seguido por centrifugação a 12.000 rpm a 4 ° C durante 15 min. As concentrações de proteína dos lisados ​​celulares foram determinados pelo ensaio de proteínas de Bradford [22]. O sobrenadante contendo os lisados ​​celulares totais foram recolhidos e armazenados a -80 ° C até à sua utilização.

2,4. Imunotransferência

quantidade igual de lisados ​​celulares totais (40 ug) foram resolvidas por electroforese em 4-12% de gel de sulfato de dodecilo de sódio poliacrilamidia (SDS-PAGE) e transferidas electroforeticamente para membranas de nitrocelulose [23]. Os lisados ​​celulares foram desnaturadas numa proveta de 100 ° C, de água durante 5 minutos antes de carregar para a 4-12% SDS-PAGE. O gel foi corrido no tampão de electroforese de SDS (25 mM de base Tris, 0,192 M de glicina, 1% de SDS) a 170 V durante 2 horas. A transferência foi realizada em tampão de transferência (base Tris 25 mM, 0,192 M de glicina, pH 8,3) a 30 V durante 2 h. A membrana de nitrocelulose foi então imerso em leite desnatado a 5% para bloquear a ligação não específica durante 1 h à temperatura ambiente. A membrana foi então imunotrans durante a noite com anticorpos primários (monoclonal ou policlonal MRP7 P-gp e anticorpos BCRP em 1:500 e MRP1 policlonal em 1:3,000) a 4 ° C. No dia seguinte, a membrana foi lavada três vezes com tampão de TBST (Tris a 0,3%, 0,8% de NaCl, 0,02% de KCl, 0,05% de Tween 20), seguido de uma incubação de três horas com anticorpos secundários de policlonal anti-MRP7 ou monoclonal anti- P-gp em 1:1000. O complexo de proteína-anticorpo foi medida utilizando um sistema de detecção de quimioluminescência aumentada (Amersham, NJ). A membrana foi então exposto a filme para o desenvolvimento. A actina controlo de carregamento convencionalmente utilizada foi utilizado para detectar o carregamento igual de cada pista nas amostras preparadas a partir de lisados ​​celulares.

2,5. Análise de sensibilidade às drogas

sensibilidade droga foi analisada utilizando um ensaio colorimétrico MTT ligeiramente modificado [23]. Vector vazio transfectadas células HEK293-pcDNA3.1 e células HEK293 transfectadas MRP7-2-MRP7 foram semeadas em placas de 96 cavidades, em triplicado, a 5000 células /poço. Após a incubação em meio DMEM suplementado com soro de bovino a 10%, a 37 ° C durante 24 h, os fármacos antineoplásicos foram diluídos até várias concentrações e incubados com as células continuamente durante 72 h. Os inibidores potenciais foram adicionados 1 h antes da adição dos fármacos anticancerígenos.

Após incubação da droga de 72 horas, 20 ul de MTT (4 mg /ml) foi adicionado a cada poço e a placa foi ainda incubada durante 4 h, permitindo que as células viáveis ​​para o desenvolvimento do MTT de cor amarela em cristais de formazano azul-escuro. Subsequentemente, o meio foi suavemente removido sem agitar o adesivo monocamada de células e 100 ul de DMSO foi adicionado a cada poço para dissolver os cristais de formazano. As placas foram bem agitada durante 5 min, e um leitor de microplacas OPSYS ler a absorvância a 570 nm a partir de Dynex Technologies Inc. (Chantilly, VA). O grau de resistência foi calculada pela divisão do IC

50 para as células MDR de que as células progenitoras, ao passo que o grau de MDR reversão foi calculado dividindo-se o IC

50 das células com o fármaco anti-cancro no ausência de inibidor pelo que obtida na presença do inibidor. As concentrações necessárias para inibir o crescimento de 50% das células de controlo foram calculados a partir de curvas de sobrevivência usando o método de Bliss [23].

As drogas antineoplásicas utilizadas incluiam o paclitaxel, a vincristina e doxorrubicina em concentrações variáveis ​​até uma concentração final de 10, 1 e 1 uM, respectivamente. A BCR-Abl TKI, tais como nilotinib e imatinib, foram usadas subsequentemente em concentrações não tóxicas de 1, 2,5 e 5 uM de tela contra a vincristina e doxorrubicina. Neste estudo, foram primeiro seleccionadas uma única dose não tóxica (5 uM) para examinar os efeitos sobre a resistência de TKI mediada por MRP7 ao paclitaxel. Uma vez determinou-se que inibidores da tirosina quinase teve o efeito mais significativo reversão, tais como imatinib e nilotinibe, foram selecionados subsequentemente três concentrações (1, 2,5 ou 5 uM) para cada TKI para determinar se os seus efeitos de reversão foram a paclitaxel, vincristina e doxorrubicina dependente da concentração .

2.6. a acumulação do fármaco e de efluxo

as células parentais HEK293-pcDNA3.1 e HEK-MRP7-2 células transfectadas foram semeadas em dois balões T75 e incubadas com DMEM suplementado com soro de bovino a 10%, a 37 ° C. Depois que as células foram de 60 a 95% confluentes, cada inibidor foi adicionado a frascos separados e as células foram incubadas durante 1 h. As células foram então tripsinizadas e duas alíquotas (48 × 10

6 células) a partir de cada linha de células foram suspensas no meio. Subsequentemente, as células foram suspensas no meio contendo [

3H] paclitaxel numa concentração de 0,1 ^ M, com ou sem o nilotinib TKI e imatinib (5 uM) durante 1 h a 37 ° C. Uma hora mais tarde, o meio de incubação foi substituído por meio contendo o TKI sem paclitaxel. Alíquotas (1 × 10

6 células) foram recolhidos em vários pontos de tempo (0, 20, 60 e 120 min). As células foram então lavadas com PBS gelado e cada amostra foi colocada em fluido de cintilação para medir a radioactividade num contador de cintilação líquida Packard TRI-CARB 1900CA de Packard Instrument Inc. (Downers Grove, IL).

2.7. A análise estatística

Todas as experiências foram repetidas pelo menos três vezes e as diferenças foram determinadas pelo teste t bicaudal de Student. A significância estatística a priori foi fixado em

P

. 0,05

Resultados

3.1. Expressão de MRP7 em células HEK-MRP7-2 HEK293-pcDNA3.1 e

Neste estudo, as duas linhas de células utilizadas foram células HEK293 transfectadas com o vector de expressão MRP7 ou o vector vazio de controlo (pcDNA3.1 ). A análise de imunotransferência foi realizada para detectar o nível de expressão da proteína MRP7 nas linhas acima referidas. proteína MRP7 (PM 171 kDa) foi expresso em células de HEK-MRP7-2, mas não em células HEK293-pcDNA3.1 (Fig. 2a). P-gp, com um peso molecular de 170 kD, foi detectada nas linhas celulares de controlo KB-C2 positivos, mas não no controlo negativo KB-3-1, HEK293-pcDNA3.1 ou HEK-MRP7-2 linhas celulares ( A Fig. 2B). Realizou-se também ensaios de Western blot para determinar se MRP1 e BCRP foram expressos em células HEK293-pcDNA3.1 e HEK-MRP7-2. Os níveis de MRP1 e BCRP em ambas as células HEK-MRP7-2 e células HEK293-pcDNA3.1 eram indetectáveis. Estas descobertas são importantes, como quaisquer efeitos observados com os inibidores são pouco provável que seja devido à sua interacção com a P-gp, de MRP1 e /ou BCRP.

(A) Expressão de MRP7 em HEK293-pcDNA3.1 ( pista 1) e de células transfectadas com MRP7 (pista 2). (B) Expressão de P-gp em células HEK293-pcDNA3.1 (pista 1), células HEK-MRP7-2 (pista 2), KB-3-1 (pista 3) e KB-C2 (pista 4). (C) Efeito de 5 uM de imatinib no nível de expressão de MRP7 (HEK-MRP7-2) durante 36 e 72 h, respectivamente. (D) Efeito de 5 uM de nilotinib sobre o nível de expressão de MRP7 (HEK-MRP7-2) durante 36 e 72 h, respectivamente. Quantidades iguais de proteína (40 ug) de lisado celular total foram usadas para cada amostra. As membranas de nitrocelulose foram coradas imunologicamente com o anticorpo primário contra actina ou MRP7 em 1:500 diluição, ou P-gp em 1:500 diluição a 4 ° C durante a noite, e, em seguida, incubadas com anticorpo secundário conjugado com HRP em 1:1000 diluições à temperatura ambiente durante 3 h.

para avaliar o efeito do imatinibe /nilotinib sobre a expressão de MRP7, as células HEK-MRP7-2 foram incubadas com 5 pM de imatinibe ou nilotinib durante 36 e 72 h, respectivamente . A incubação de células HEK-MRP7-2 com imatinib ou nilotinib não alterou significativamente a expressão dos níveis de proteína de MRP7 em diferentes pontos de tempo (Fig. 2C e D). Isto sugere que o efeito dos inibidores na resposta das células aos fármacos anti-cancro não é devida à regulação da expressão MRP7.

3,2. Análise da sensibilidade ao fármaco de células HEK293 transfectadas com MRP7

Para determinar o perfil de resistência a drogas de MRP7, a sensibilidade de células HEK-MRP7-2 para fármacos antineoplásicos específicos transfectadas foi comparada com a do controlo só de vetor células, HEK293-pcDNA3.1. As células HEK-MRP7-2 exibiram um maior nível significativo de resistência ao paclitaxel e vincristina (9.5- e 6,7 vezes a resistência ao comparar as células de controlo, respectivamente) (Tabela 1). Estes resultados indicaram que a linha de células HEK-MRP7-2 foi capaz de conferir resistência a vários fármacos antineoplásicos, o que é consistente com nosso relatório anterior [9].

3.3. O efeito dos inibidores da tirosina quinase na sensibilidade das células HEK293 transfectadas com MRP7 para drogas antineoplásicas

testados vários inibidores da tirosina quinase BCR-ABL para determinar se podiam reverter a resistência das células HEK293 que sobre-expressam MRP7 ao paclitaxel e vincristina fármaco antineoplásico. A magnitude de inversão produzidos pela TKI de paclitaxel foi variável (Tabela 1; Fig. 3). A pré-incubação de células com imatinib ou nilotinib, a 2,5 uM, reverteu significativamente a resistência das células de HEK-MRP7-2 ao paclitaxel (Tabela 1, Fig. 3A e 3B). O imatinib e nilotinibe produziu uma inversão 6,9 e 13,0 vezes, respectivamente, da resistência ao paclitaxel. A IC

50 de paclitaxel em células HEK-MRP7-2 co-cultivadas com 2,5 uM de nilotinib foi significativamente diminuído de 207,0 ± 19,7 nM a 15,9 ± 0,9 nM, e esta foi significativamente menor do que a do paclitaxel no grupo de controlo (21,9 ± 1,9 nM). A resistência ao paclitaxel foi completamente revertido quando imatinib foi co-incubado com o paclitaxel em células HEK-MRP7-2. Uma inversão significativamente maior foi obtida nas 5 uM (12,4 vezes) em comparação com a concentração de 1 uM (4,7 vezes). Imatinib, a 5 uM, também aumentou a sensibilidade das células a paclitaxel em células HEK293-pcDNA3.1 por 2,2 vezes, embora este efeito em células HEK293-pcDNA3.1 foi significativamente menor do que nas células transfectadas MRP7 (12,5 vezes) (Tabela 1). Estes resultados indicaram que o imatinib BCR-ABL e TKI nilotinib atenuou significativamente a resistência ao paclitaxel mediada por MRP7. Embora a co-incubação de células HEK293-pcDNA3.1 (células de controlo) com paclitaxel nilotinib e também aumentou a sensibilidade ao paclitaxel (um deslocamento de 2,5 vezes nas células HEK293-pcDNA3.1), esta sensibilidade aumentada foi significativamente menor do que a verificada para as células transfectadas MRP7 (Tabela 1; Fig. 3C). Em contraste, outro inibidor da tirosina quinase BCR-Abl, dasatinib a 2,5 uM, não aumentou significativamente a sensibilidade de paclitaxel em qualquer células HEK-MRP7-2 (Tabela 1, Fig. 3C).

Dois ou HEK293-pcDNA3.1 linhas celulares, HEK293-pcDNA3.1 e HEK-MRP7-2, são representados como HEK293 e MRP7, respectivamente. Após a sementeira e a cultura de células durante 24 h, quantidades iguais de PBS ou os agentes de reversão foram adicionados em células HEK293-pcDNA3.1 (como mostrado e, respectivamente) e células HEK-MRP7-2 (como mostrado e, respectivamente), 1 h antes de a adição de paclitaxel. As várias concentrações de paclitaxel foram indicados na figura. A concentração final de imatinib, nilotinib ou dasatinib foi de 2,5 mM. A figura acima mostra um resultado representativo para imatinib, nilotinib ou dasatinib.

Além de paclitaxel, que também examinou o efeito do TKI selecionado para sensibilizar células para outra droga anticâncer, vincristina. Similar aos resultados com o paclitaxel, nilotinib e imatinib (1, 2,5 e 5 uM) reverteu significativamente a resistência mediada por MRP7 vincristina (2.1-, 6.8- e 9,0 vezes, respectivamente, para nilotinib; 2.4-, 6,9 e 8,2 vezes , respectivamente, para o imatinib) de um modo dependente da concentração (Tabela 1). Examinámos também a resposta de células transfectadas com MRP7 para outro fármaco anticancerígeno, doxorrubicina, na presença de imatinibe, como a doxorrubicina não é um substrato de MRP7 [23]. Os nossos resultados indicaram que o imatinib (1, 2,5 e 5 uM) não sensibilizaram significativamente a resposta de células HEK293-pcDNA3.1 de controlo parental, ou resistência transfectadas em células HEK-MRP7-2, (Tabela 1) reverter para a doxorrubicina. Isto indica que a resposta a estes TKI era específico para MRP7, como a doxorrubicina não é um substrato para MRP7 e, portanto, não mediar doxorrubicina efluxo. A doxorubicina é um substrato de P-gp, de MRP1 e BCRP, mas nenhum nem imatinib nilotinib aumentou significativamente a sensibilidade das células HEK doxorrubicina-MRP7-2, o que sugere que a P-gp, MRP e BCRP não contribuem significativamente para a resistência ao fármaco de HEK- MRP7-2.

No geral, imatinib e nilotinib significativamente inverteu a resistência mediada por MRP7 ao paclitaxel e vincristina, mas não doxorrubicina. Além disso, esta inversão era dependente da concentração (Tabela 1; Fig. 3). Embora um aumento na sensibilização das células de controlo HEK293-pcDNA3.1 ocorreu após a exposição ao nilotinib ou imatinib, este efeito foi significativamente mais baixa do que a verificada para as células HEK-MRP7-2 transfectadas (Tabela 1; Fig. 3).

3.4. Os efeitos de imatinib e nilotinib sobre a acumulação intracelular e o efluxo de [

3H] paclitaxel

A fim de determinar o mecanismo através do qual o imatinib e nilotinib surmount ou resistência ao paclitaxel mediada por MRP7 inverter, o seu efeito sobre a acumulação de [

3H]-paclitaxel em células transfectadas-MRP7 foi examinada. A concentração intracelular de [

3H]-paclitaxel em células HEK-MRP7-2 foi de 30% do que acumulado pelas células HEK293-pcDNA3.1 (Fig. 4). A acumulação de paclitaxel foi aumentada significativamente (1,9 vezes) em células HEK-MRP7-2 (P 0,05) a seguir à incubação das células, quer com imatinib ou nilotinib a uma concentração de 5 uM. Em células HEK293-pcDNA3.1, imatinib, mas não nilotinib, resultou num ligeiro aumento na concentração intracelular de [

3H] paclitaxel, mas Esta sensibilização foi modesto em comparação com o efeito de imatinib em células HEK-MRP7- 2 células.

as acumulações de paclitaxel intracelulares em células HEK-MRP7-2 HEK293-pcDNA3.1 e foram medidos após a incubação com 0,1 mM paclitaxel. acumulação intracelular de paclitaxel em células HEK293-pcDNA3.1 na ausência de imatinibe e nilotinibe foram mostradas nas barras da esquerda (▪). acumulação intracelular de paclitaxel na presença de 5 uM de imatinib em células HEK293-pcDNA3.1 foi mostrado à direita (□). acumulação intracelular de paclitaxel em células HEK-MRP7-2 na presença de 5 uM de nilotinib foi mostrado à direita (). Cada coluna representa a média (± SD). Todas as experiências foram realizadas em triplicado. * P 0,05, teste t de Student

Com base nos resultados anteriores, é possível que o aumento em paclitaxel intracelular produzida pelo imatinib e nilotinib pode ser devido a: (1) uma diminuição na. efluxo de paclitaxel e /ou, (2) um aumento na captação de paclitaxel. Portanto, a experiência seguinte foi realizada para determinar se o aumento na acumulação de paclitaxel produzido pelo imatinib e nilotinib era devida a uma inibição do efluxo de paclitaxel. As células HEK-MRP7-2 e células HEK293-pcDNA3.1 foram incubadas com paclitaxel e um curso de tempo de acumulação de droga intracelular foi determinada (Fig. 5). Como esperado, as células HEK-MRP7-2 libertada uma percentagem significativamente mais elevada de paclitaxel acumulada em comparação com células HEK293-pcDNA3.1, e a quantidade de paclitaxel que foi effluxed aumentou com o tempo. A acumulação de paclitaxel a 0 min de efluxo de fármacos foi definido como 1. Decorridos 60 minutos, em células incubadas em meio isento de droga, ~ 60% do paclitaxel acumulada foi exportado a partir de células HEK-MRP7-2 na ausência de imatinibe ou nilotinib . Em contraste, quase todo o paclitaxel esteve presente no interior das células HEK-MRP7-2 incubadas com imatinib ou nilotinib a uma concentração final de 5 uM em diferentes períodos de tempo. Para as células de controlo, a concentração de paclitaxel sujeito a efluxo também aumentou com o tempo, mas o nível de efluxo foi apenas ligeiramente menos do que o observado em células transfectadas com MRP7. Em contraste, nas células HE293-pcDNA3.1, ~ 30% do paclitaxel foi libertada após 60 min, na ausência dos compostos de teste. A incubação das células HEK293-pcDNA3.1 com imatinib ou nilotinib (5 uM) também inibiu o efluxo de paclitaxel, embora a magnitude do efeito foi significativamente menor do que a observada para as células HEK-MRP7-2.

a percentagem de paclitaxel libertado foi representada graficamente como uma função do tempo. Após 1 h de incubação do TKI, [

3H]-paclitaxel foi co-incubadas em HEK293-pcDNA3.1 com TKI () ou sem TKI (), e, entretanto, em células de HEK-MRP7-2 com TKI () ou sem TKI (). As células foram lavadas e re-incubadas no meio livre de paclitaxel. Nos pontos de tempo de 0 minutos, 20 min, 60 min e 120 min, as células foram recolhidas e os níveis de [

3H]-paclitaxel foram determinadas por contagem de cintilação. Os valores a 0 min de efluxo de droga foram definidos como 1 para comparação com os valores medidos a partir de outros pontos de tempo. Cada ponto representa a média (± DP) de três experiências separadas feito usando amostras em triplicado.

Discussão

Este estudo foi o primeiro a identificar que o imatinib BCR-Abl TKI e nilotinib , mas não dasatinib, poderia reverter MRP7-MDR mediada de um modo dependente da concentração.

células HEK293 transfectadas com o gene recombinante MRP7 HEK-MRP7-2, e células HEK293 transfectadas com pcDNA3.1-vector vazio, foram utilizados para os testes de função MRP7 de efluxo. Estas linhas celulares transfectadas foram anteriormente utilizados em estudos destinados a determinar os efeitos da cepharanthine sobre a reversão da resistência mediada por MRP7 ao paclitaxel [9]. Neste estudo, a análise Western blot confirmou que a transfecção de células com MRP7 foi bem-sucedida, como proteínas MRP7 foram expressos apenas em células HEK-MRP7-2, e não em células HEK293-pcDNA3.1 (Fig. 2). As linhas de células foram expostas às mesmas condições experimentais e os procedimentos exactos, e foram cultivadas com os mesmos fármacos antineoplásicos para o mesmo tempo de incubação. Pode-se argumentar que as células transfectadas-MRP7 expressa outras proteínas, além de MRP7, como P-gp, que pode ter contribuído para MDR. No entanto, a análise de Western blot indicou que nem a linha celular de controlo HEK293-pcDNA3.1, nem o HEK-MRP7-2 linha celular transfectada, expressaram níveis detectáveis ​​de P-gp (Fig. 2), que também podem mediar a MDR. Além disso, de MRP1 e BCRP foram indetectáveis ​​em ambas as células transfectadas HEK-MRP7-2 através da análise de Western blot de controlo HEK293-pcDNA3.1 e (dados não mostrados). Portanto, estes resultados indicam que o HEK-MRP7-2 linha celular transfectada expressa especificamente MRP7, mas não a P-gp, MRP, ou BCRP.

Previamente, foi relatado que cepharanthine e nilotinib inverteu significativamente P- GP-MDR mediada em células HEK-MRP7-2 [9] e linhas de células que sobre-expressam BCRP [24], respectivamente. Desde MRP7 e P-gp são semelhantes em estrutura e actividade funcional, que conceberam experiências para determinar se o nilotinib poderia reverter a resistência aos medicamentos mediada por MRP7 ao paclitaxel. Devido à semelhança estrutural entre MRP7 e P-gp, um estudo anterior indicou que alguns inibidores da P-gp foram capazes de reverter significativamente a resistência ao paclitaxel em células HEK-MRP7-2 superexpressando MRP7 [9]. Descobrimos que nilotinib (2,5 M) células HEK293 transfectadas-MRP7 significativamente sensibilizados a paclitaxel, uma vez que diminui acentuadamente o IC

50 de paclitaxel em células trasnfected-MRP7, em comparação com células de controlo. Embora nilotinib é um inibidor da P-gp [24], isto não é um factor contaminante nas nossas experiências, como a proteína gp-P não deve ser expresso em células HEK-MRP7-2 HEK293-pcDNA3.1 ou (Fig. 2) .

neste estudo, verificou-se que inibidores da tirosina quinase específicos: 1) diminuiu significativamente a resistência ao paclitaxel em células que sobre-expressam MRP7 (Tabela 1; Fig 3), 2) se sensibilizar de forma significativa a resposta ao paclitaxel no vazio. células transfectadas vector, mas o efeito foi significativamente menor do que nas células MRP7 transfectadas (Fig. 3), e 3) não significativamente inibir ou induzir a expressão MRP7 (Fig. 2C e D). No geral, estes resultados sugerem que tentativamente dos TKI utilizados neste estudo, de imatinibe e nilotinibe são capazes de reverter a resistência mediada por MRP7 através da inibição da função de MRP7. Entre os inibidores da tirosina quinase que foram testados contra o paclitaxel, o imatinibe BCR-ABL e TKI nilotinib em 5 uM completamente inverteu a resistência de paclitaxel mediada por MRP7 por uma magnitude de 12,5 e 21,0 vezes, respectivamente (Tabela 1). Em contraste, outro inibidor da tirosina quinase BCR-Abl, dasatinib, produziu nenhuma reversão significativa da resistência mediada pelo paclitaxel MRP7 (Tabela 1; Fig. 3C). Actualmente, a explicação para a diferença entre o dasatinib comparado ao nilotinib ou imatinib permanece a ser determinada. Uma abordagem potencial que pode dar uma visão sobre esta questão seria a de relação de atividade estrutural (SAR). Com base nas suas estruturas químicas (Fig. 1), o dasatinib carece de um anel de 2-phenylaminopyrimidine que está presente nas estruturas do nilotinib e imatinib. É possível que a ausência desta anel em dasatinib poderia ser um factor importante que diferencia a partir de dasatinib actividade que de qualquer das nilotinib ou imatinib. estudos de estrutura-função detalhada será necessária para delinear a SAR para a interação desses TKI com células-superexpressão MRP7. Além disso, foi sugerido que as células HEK293-pcDNA3.1 também foram sensibilizados por nilotinib ou imatinib co-administração (Tabela 1; Fig. 5).