Abstract
A evidência crescente sugere que regiões cromossômicas contendo microRNAs são funcionalmente importante na cancros. Aqui, mostramos que loci genómico que codifica miR-204 são frequentemente perdidos em vários tipos de câncer, incluindo câncer de ovário, tumores renais pediátricos, e os cancros da mama. MiR-204 mostra drasticamente reduzida expressão em vários cancros e actua como um potente supressor do tumor, inibir a metástase de tumores in vivo, quando sistemicamente entregues. Nós demonstramos que o miR-204 exerce a sua função por genes alvo envolvidos na tumorigénese incluindo
cérebro-derivado de factor neurotrófico
(
BDNF
), um membro da família neurotrofina que é conhecido por promover a angiogénese tumoral e invasão . Análise de tumores primários mostra que o aumento da expressão de BDNF ou o seu receptor relacionado com a tropomiosina cinase B (TrkB) paralelas uma expressão marcadamente reduzida de miR-204. Os nossos resultados revelam que a perda de miR-204 resulta em BDNF superexpressão e subsequente ativação da pequena GTPase Rac1 e reorganização da actina através da AKT /mTOR caminho que leva à migração de células cancerosas e invasão sinalização. Estes resultados sugerem que microdeleção de loci genômicos contendo miR-204 está directamente relacionada com a desregulamentação das vias oncogênicas-chave que fornecem estímulo crucial para o crescimento de tumores e metástases. Nossos resultados fornecem uma forte razão para manipular os níveis de miR-204 terapeuticamente para suprimir a metástase do tumor
Citation:. Imam JS, Plyler JR, Bansal H, Prajapati S, Bansal S, Rebeles J, et al. (2012) Perda de Genomic de supressor de tumor miRNA-204 promove a migração de células cancerosas e Invasion ativando AKT /mTOR /Rac1 Sinalização e actina reorganização. PLoS ONE 7 (12): e52397. doi: 10.1371 /journal.pone.0052397
editor: Giuseppe Viglietto, Universidade Magna Grécia, Itália |
Recebido: 8 de junho de 2012; Aceito: 14 de novembro de 2012; Publicação: 21 de dezembro de 2012
Direitos de autor: © 2012 Imam et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. O trabalho foi apoiada pela subvenção William e Ella Medical Research Foundation (MKR), GCCRI arranque fundo (MKR), CPRIT comunhão (BZ), Institutos Nacionais de Saúde (NIH) bolsa de formação T32 (MPC), e câncer NIH /National cancer Institute concessão centro (P30 CA054174-17). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
a identificação de regiões cromossômicas que abrigam oncogenes e supressor de tumor é crucial para o entendimento da patogênese do tumor e melhorar os resultados do tratamento [1]. Embora vários genes relacionados com o cancro, foram identificados em regiões com anomalias cromossómicas [2], regiões adicionais com anomalias cromossómicas ou aleatórias recorrentes factores importantes no crescimento e na progressão do cancro permanecem abrigando a ser identificado. Estudos recentes indicam que microRNAs (miRNAs) são um grupo de tais factores [3]. MiRNAs são pequenas, endógeno, RNAs não-codificantes que regulam a expressão do gene da pós-transcrição ligando-se a regiões não traduzidas 3 ‘(UTRs) de mRNAs alvo. Os miRNAs são conhecidos por desempenhar funções cruciais em vários processos biológicos, incluindo o desenvolvimento e diferenciação [4], e expressão desregulada de miRNAs tem sido implicada em várias doenças humanas, incluindo câncer [5]. Evidências crescentes sugerem que miRNAs podem atuar como oncogenes ou genes supressores de tumor [6].
Neste estudo, nós nos concentramos em loci cromossómico contendo miR-204. MiR-204 tem sido relatada a desempenhar papéis importantes na calcificação das células do músculo liso, assim como resposta ao estresse retículo endoplasmático em células da rede trabecular [7], [8]. Além disso, relatórios recentes têm mostrado papéis igualmente importantes para miR-204 na tumorigénese, incluindo a regulação da carcinogênese em tumores da bainha dos nervos periféricos, e migração e invasão de linhas celulares de cancro do endométrio [9], [10]. No entanto, muito pouco se sabe sobre o mecanismo pelo qual o miR-204 regula a oncogénese, em geral, e o crescimento de tumores e metástases em cancros da mama e cancro do ovário, em particular. Além disso, praticamente nada se sabe sobre se miR-204 pode ser alvo terapêutico e como expressão de miR-204 é regulada em cancros. Nossos resultados revelam que loci cromossómico contendo miR-204 é frequentemente perdido, resultando na sua menor expressão em vários tipos de câncer. Nós demonstramos que o miR-204 actua como um potente o crescimento do tumor e um supressor de metástase. Importantemente, os nossos resultados mostram que o miR-204 pode ser alvo terapeuticamente como a entrega sistémica de miR-204 inibiu a metástase do cancro da mama pulmão sem causar qualquer hepatotoxicidade. Descobrimos que o miR-204 actua como um supressor de tumor, visando a função de genes associados com a tumorigénese, incluindo
cérebro-derivado de factor neurotrófico
(
BDNF
). O BDNF é um factor de crescimento dos nervos f isiologicamente importante que desempenha um papel crítico no desenvolvimento do sistema nervoso e ligando-se subsequentemente activar o receptor de tirosina quinase, relacionadas com a tropomiosina cinase B (TrkB) [11], [12]. Além disso, a via /TrkB BDNF é relatado como tendo um papel crítico na tumorigénese, uma vez que promove a proliferação, diferenciação, angiogénese e invasão tumoral [13]. A sobre-expressão de BDNF /TrkB também tem sido implicado em vários mau prognóstico de tumores sólidos, incluindo o neuroblastoma, do ovário, da mama, da próstata e cancros do pulmão [14], [15], [16]. Os nossos resultados revelam que a perda de miR-204 resulta em BDNF superexpressão /TrkB e ativação concomitante da Akt /mTOR /Rac1 sinalização, levando a reorganização da actina durante a migração de células cancerosas e invasão. Estes resultados sublinham a importância funcional das regiões cromossômicas contendo miRNAs específicos no crescimento de tumores e metástases.
Resultados
Perda Somatic de miR-204 em cancros
Para identificar miRNAs que estão associado com regiões cromossômicas aberrantes em cancros humanos, usamos de alta resolução personalizada miRNA hibridização genômica comparativa (CGH) e de alta densidade CGH conjuntos de dados de domínio público para o câncer de ovário, câncer de mama e tumores renais pediátricos. Esta análise revelou vários miARNs nas regiões mínimas de deleção cromossómica e amplificação destes tumores. Para começar a entender a importância funcional dos loci cromossómica associada miRNAs na tumorigênese, inicialmente focada em miRNAs exibem perda de genômica (Figura S1A). A região cromossómica que contém 9q21.12 miR-204 foi frequentemente perdida em 44,63% (158/354) dos cancros do ovário, 28% (10/35) dos cancros da mama e 40% (15/38) de tumores renais pediátricos (Figura 1A , 1B e Figura S1B), que é posteriormente verificada por genómico quantitativa em tempo real A análise de PCR (Figura 1C e 1D). Além disso, a redução dos níveis de miR-204 maduro também fortemente correlacionado com o seu conteúdo de ADN genómico em todas as três tipos de tumores (Figura 1E-1G).
A, alta resolução miARN-CGH na tumores renais pediátricos com seleccionados (esquerda) ou sem (direita) deleções de miR-204. A deleção de loci genómico contendo o miARN é indicado por linhas pontilhadas perpendiculares. pontos vermelhos e verdes indicam a posição e valor de cada sonda refletindo a mudança do número de cópias, representada em triplicado no array CGH. A linha de tendência cinzenta representa o valor médio da sonda em triplicado para cada tumor. B, gráficos obtidos a partir de meta-análise de alta resolução CGH dos cancros do ovário (
n
= 354; obtidos a partir de TCGA), representando um subconjunto de tumores com ou sem exclusão. A supressão de loci genómico contendo o miR-204 é indicado por linhas pontilhadas perpendiculares. C e D, alélica de PCR de miR-204 em local genómico tumores pediátricos renais (C) e em cancros do ovário (D). O eixo y mostra log
2 valores quantificação relativa transformadas. As linhas a tracejado mostram a perda do limiar de cópia. E-G, representação gráfica da análise de qRT-PCR mostrando níveis de miR-204 em tumores renais pediátricos (
n
= 38; E), em cânceres de ovário estágio avançado (
n
= 11 ; F) e, de cancros da mama (
n
= 10; G), quando comparado ao rim normal combinado de controle (
n
= 38), tecidos ovarianos normais (
n
= 5) e normais tecidos da mama combinados (
n
= 10).
miR-204 Atos como um crescimento tumoral potente e Metástase supressor
A expressão drasticamente reduzida de miR-204 em vários tecidos de câncer nos levou a abordar o papel do miR-204 na tumorigênese. Para determinar isso, primeiro avaliado o efeito de miR-204 no crescimento independente de ancoragem. As células HEK-293 de rim embrionário (células HEK-293 subculturas mais de 52 vezes são referidos como sendo altamente tumorigénicas [17]) que sobrexpressam o miR-204 apresentou diminuição da capacidade de formação de colónia, que foi resgatado com a sobre-expressão de um inibidor de miR-204 ( A Figura 2A). Resultados semelhantes também foram obtidos com miR-204 do cancro da mama que sobre-expressam as células de ovário SKOV3 do cancro MDA-MB-231 e (dados não mostrados). Para confirmar ainda mais a actividade supressora do tipo de tumor potencial de miR-204, células HEK-293 de alta passagem que sobre-expressam de forma estável, quer o miR-204 ou uma sua sequência mexidos foram injectadas as cápsulas dos rins de ratinhos nus e o crescimento de tumores e metástases foram avaliadas 24 dias após a injecção . Em nítido contraste com tumores de controlo, os tumores que sobre-expressam o miR-204 foram drasticamente reduzidos em tamanho (Figura 2B). A seguir, nós examinamos se o miR-204 também inibe a invasão da célula tumoral. A análise histológica de secções de tumores de xenoenxerto indicados drasticamente reduzida ou nenhuma capacidade de invasão de tumores em tecidos renais que sobre-expressos de miR-204 em comparação com o controlo (Figura 2C). Consistente com isto, a sobre-expressão de miR-204 reduziu drasticamente as capacidades migratórias e invasivos de células de cancro da mama (MDA-MB-231) e cancro do ovário (SKOV3) (Figura 2D e dados não mostrados) in vitro.
A , miR-204 inibe o crescimento independente de ancoragem. consumo de nutrientes (à esquerda) e gráfico (direita) representam o número de colónias formadas em poços de agar mole por células HEK-293 que sobre-expressam de forma estável, quer disputa ou miR-204, ainda mais transfectadas com miR-204 inibidor. (*)
P Art 0,05; (**)
P Art 0,01. Os resultados são a média de três experiências independentes. B, o miR-204 sobre-expressão inibe o crescimento do tumor. A fotografia mostra características representativas do crescimento do tumor em
RAG2
– /-, yc
– /- ratos SCID injectado (na cápsula renal) com células HEK-293 superexpressão de forma estável, quer controle corrida ou miR -204. mostra o gráfico de barras significa o volume do tumor para miR-204 (
n
= 9) e corrida (
n
= 9) transfectantes. (*)
P Art 0,001. C, a análise histológica de secções de xenoenxertos de tumores com superexpressão qualquer disputa (controle) ou miR-204. As imagens mostradas no painel direito representam ampliada vista da região encaixotado indicado no painel esquerdo. invasão tumoral em transfectantes de controlo reflecte-se pela invasão de tumor para tecido renal. D, membrana basal ensaio de invasão da matriz de MDA MB-231 transfectadas com 75 nM de sequência (controlo) ou o miR-204 células mimetizam (miR-204) ou o miR-204 transfectadas imitar mais transfectadas com miR-204 inibidor (miR- mexidos 204 + inibidor). gráfico de barras que mostra o número médio de células invadidas contados microscopicamente em cinco campos diferentes por filtro. (***)
P
. 0,001
Segmentação terapêutica de miR-204
Para fundamentar ainda mais a atividade de metástase supressor de miR-204 foi realizada experimentos terapêuticos no modelo de metástase pulmonar cancro da mama. Em primeiro lugar, estabelecida metástases pulmonares por injecção na veia da cauda de-231 MDA-MB células cancerosas da mama que expressam a luciferase-GFP, e subsequentemente injectados miR-204 ou miR-204 oligo mutante (controlo negativo) na veia da cauda de ratinhos nus a cada 5 dias para 30 dias usando LANCErII, in vivo, um veículo de entrega à base de lípidos. Interessantemente, a distribuição sistémica de miR-204 resultou numa redução ou eliminação de metástases pulmonares significativa, enquanto que o miR-204 oligo mutante injectados ratinhos tinham metástases pulmonares graves, tal como medido ao longo do período de 60 dias (Figura 3A-3D e Figura S2). Importante, ratinhos injectados com miR-204 não demonstrou quaisquer efeitos colaterais óbvios como revelado pela ausência de hepatotoxicidade ou alterações no peso corporal (Figura 3E e dados não mostrados). Estes resultados indicam que o miR-204 pode ser um regime terapêutico seguro e viável para tratar o crescimento tumoral e metástases.
a, injecção de miR-204 oligonucleótido na veia da cauda a metástase pulmonar suprimida. Imagens ao vivo de bioluminescência de camundongos injetados com miR-204 (
n
= 6) ou miR-204 mutante (neg controle;.
n
= 6) oligonucleotídeos usando o Xenogen In Vivo Imaging System ( IVIS) (Xenogen). As imagens foram tiradas após injecção subcutânea de 150 mg /kg de substrato de D-luciferina em PBS a ratinhos anestesiados. B, o volume de metástase de tumor foi avaliada a partir do dia 10 até que os animais foram sacrificados no dia 60. Usando a análise do ROI, tumor foi calculado a intensidade da luz em fotões /s, o que corresponde com o número de células vivas in vivo. C, imagens pulmonares representativos que mostram GFP
+ ve focos (círculo vermelho) em neg. grupos de controle. D, secções de pulmão representativos mostrando focos metastáticos no neg. grupos de controle. E, não hepatotoxicidade em miR-204 ratinhos injectados. Seções de fígado de miR-204 injetaram em ratos não mostram sinais de hepatotoxicidade. A presença de linfócitos periportal multifocais não é incomum e é um achado comum em animais jovens.
miR-204 Metas genes associados com Tumorigênese
Para entender o mecanismo pelo qual miR-204 pode desempenhar um papel na tumorigénese, foram identificados genes regulados pelo miR-204. Uma vez que a maioria dos miARNs agem para diminuir os níveis de ARNm alvo [18], foi realizada a análise de expressão de genes em células que sobre-expressam o miR-204 e determinados os potenciais alvos de miR-204. Dos genes alterados em miR-204 que sobre-expressam as células, os genes regulados negativamente são mais susceptíveis de ser directamente objecto de miR-204. Interessantemente, muitos dos genes regulados negativamente estão associadas com os processos relacionados com o cancro e fisicamente ou funcionalmente interagir uns com os outros, como foi revelado por análise à base de passagem (Figura S3). Realizamos análises detalhadas em dois desses genes:
BDNF
e
Ezrin
que apresentaram maiores níveis de alteração na nossa análise microarray e destaque em todos os caminhos biológicos previstos com maior significado enriquecimento funcional. BDNF com o seu receptor TrkB se sabe desempenhar um papel crítico na angiogénese tumoral e metástase; e Ezrin, uma proteína organizador do citoesqueleto, tem sido implicada na metástase de crescimento do tumor de vários adulto e tumores pediátricos incluindo osteossarcoma, mama e adenocarcinomas pancreáticos, carcinoma do ovário, bem como o rabdomiossarcoma e tumores renais pediátricos [19], [20], [21 ]. Além disso, vários algoritmos de previsão de destino, incluindo SvMicrO [22], a abordagem bayesiana fusão decisão [23], e miRmate [24] que temos gerado recentemente, bem como TargetScan [25] e PicTar [26], também previu
BDNF Comprar e
Ezrin
a ser alvo de miR-204. Além disso, os sítios de ligação de miR-204 foram encontrados para ser evolutivamente conservadas ao longo vertebrados, sugerindo que ele tem uma importante função de regulação através de uma variedade de espécies. Importante, miR-204 e
BDNF
/
TrkB
bem
Ezrin
expressão mostrou uma forte correlação inversa em vários tumores (Figura 4A-4C e Figura S4A-S4C) .
a-C, o aumento da expressão BDNF se correlaciona fortemente com menor expressão de miR-204 em vários tipos de câncer. Representação gráfica de análise de qRT-PCR mostrando a correlação inversa entre o miR-204 e
BDNF
em tumores renais pediátricos (
n
= 38; A), cânceres de ovário estágio avançado (
n
= 11; B) e cancros da mama (
n
= 10; C), em comparação com rins controle pareado normal (
n
= 38), tecidos ovarianos normais (
n
= 5) e tecidos mamários normais pareados (
n
= 10). D-H,
BDNF
é um alvo genuíno de miR-204. D, esquemática da sequência putativa de ligação de miR-204 no
BDNF Sims 3 ‘UTR. E, células HEK-293 foram co-transfectadas com expressão de luciferase de Renilla construir pRL-TK e construções de luciferase de pirilampo contendo quer pMIR-
BDNF
UTR 3 ‘na ausência e na presença de miR-204 mímica ou pMIR-
BDNF Sims 3 ‘UTR mutante. a actividade da luciferase do vaga-lume de cada amostra foi normalizada para a actividade da luciferase de Renilla. A média ± SEM de três experiências independentes (realizada em duplicado para cada experimento). (**)
P Art 0,01; (***)
P Art 0,001. F, a análise de qRT-PCR de miR-204 e células transfectadas com miR-204 inibidores usando
BDNF
iniciadores espec�icos superexpressão. G, análise de western blot de células HEK-293 transfectadas com miR-204 mímico utilizando anticorpo-BDNF anti (1:1000). β-actina foi utilizado como um controlo de carga. fotografias de gel são representativos de três experiências independentes. H, representação gráfica de intensidades das bandas quantificado usando o software de análise de gel Total de Labs TL100 1D (
n
= 3; Nonlinear). nível de proteína BDNF para o controle foi definido para 100.
Para validar o nosso microarray e direcionar resultados de previsão, primeiro analisou se miR-204 alvos
BDNF
/
Ezrin
por ligação ao local previsto na sua extremidade 3 ‘UTR (Figura 4D e Figura S4D). De facto, a actividade de luciferase de uma construção repórter contendo PMIR-o
BDNF
ou
Ezrin
3 ‘UTR foi significativamente reprimido, o qual foi ainda mais reduzida em células que sobre-expressam o miR-204, quando comparado com a construção, sem a UTR 3 ‘(Figura 4E e Figura S4D). Em contraste, a mutação da sequência de semente em
BDNF
UTR 3 ‘contendo o construto não apenas a actividade da luciferase restaurado para perto daquele do construto de tipo selvagem, mas também a partir de transcritos prestados estas construções insensível a sobre-expressão de miR-204 ( Figura 4E), confirmando uma interação específica entre miR-204 e o sítio de ligação previsto nas “UTRs 3 destes genes. Para fundamentar ainda mais estes resultados, foram determinados os níveis de BDNF /Ezrin em células que superexpressam miR-204. MiR-204 superexpressão resultou em redução significativa de BDNF /Ezrin, tanto a nível de RNA e de proteínas (Figura 4F-4h e Figura S4E e S4F). Em seguida, vamos examinar se ou não BDNF e Ezrin são funcionalmente importantes alvos de miR-204. Para resolver isso realizamos experimentos de resgate. Restabelecimento de
BDNF
ou
Ezrin
resgatado miR-204 fenótipos induzidas incluindo o crescimento independente da ancoragem, a migração celular e invasão (Figura S5 e dados não mostrados). Estes resultados sugerem que a regulação da
BDNF
e
Ezrin
é um evento importante no crescimento de células de câncer, migração e invasão.
Perda de miR-204 miR-204-mediada Activa AKT /mTOR sinalização e Rac1 Translocação em células cancerosas
Para determinar o mecanismo através do qual o miR-204 pode exibir a sua actividade e o crescimento do tumor supressor de metástase, examinámos o efeito de miR-204 em sinalização AKT /mTOR quanto tanto o BDNF e Ezrin têm mostrado activar Akt [27], e a activação selectiva de Akt por mTOR tem sido demonstrado que regulam a migração celular e invasão do cancro [28]. Curiosamente, a sobre-expressão de miR-204 resultou em actividade reduzida de AKT e mTOR alvos a jusante 4E-BP1 e S6 (Figura 5A). 4E-BP1 é um inibidor da tradução, que se dissocia do eIF4E sobre a fosforilação para permitir a tradução da proteína, e S6 é uma proteína ribossómica cuja fosforilação facilita a montagem do ribossoma e consequente tradução de ARNm. Para confirmar nossos resultados in vitro, analisamos a expressão de fosfo-AKT (pAKT) e fosfo-S6 (PS6) em xenotransplante tumoral superexpressão de miR-204. Como mostrado na Figura S6, os níveis de pAKT e PS6 foram significativamente reduzidos, enquanto que a AKT total e os níveis totais de S6 permanecem inalteradas em tumores que sobre-expressam o miR-204 quando comparados com tumores de controlo transfectantes, como revelado pela análise imuno-histoquímica. Para fundamentar ainda mais a noção de que a Akt /mTOR é de facto um alvo importante de miR-204, que o miR-204 co-transfectadas com o mutante constitutivamente activo AKT T308D /S473D e mostrou que a AKT constitutivamente activa resgatado os efeitos negativos da miR- 204 sobre os níveis de fosfo-4E-BP1 (p4E-BP1) e PS6 jusante (Figura 5, compare 5A e 5B). No entanto, não foi possível detectar o resgate de efeitos negativos mediados por miR-204 em níveis de pAkt em células co-transfectadas com AKT constitutivamente activa (Figura 5B). Isto é devido à mutação de Ser
473 a Asp
473 em AKT constitutivamente activa, e, por conseguinte, o anticorpo anti-fosfo-Ser
anticorpo 473-AKT utilizado para a análise de Western blot detectadas apenas pAKT endógena, que é reduzido em nível, na presença de miR-204 (Figura 5A e 5B).
a, o miR-204 suprime a activação da sinalização de AKT e mTOR. As células HEK-293 transfectadas com o miR-204 foram cultivadas em condições isentas de soro e submetido a análise de Western blot utilizando anti-fosfo-Ser
473-AKT (1:1000), anti-AKT-total (1:1000) , anti-fosfo-Ser
235/236-S6 (1:1000), anti-Total-S6 (1:1000), anti-fosfo-Thr
37 /46-4E-BP1 (1:1000 ) e anti-Total-4E-BP1 (1:1000). β-actina (1:10,000) foi utilizada como um controlo de carga. fotografias de gel são representativos de três experiências independentes. B, células HEK-293 transfectadas com o mutante constitutivamente activo AKT T308D /S473D (CA-AKT) na ausência e na presença de miR-204 foram cultivadas em condições sem soro e submetido a análise de Western blot, conforme descried em A. C, a sobre-expressão de miR-204 suprime ruffling membrana induzida por BDNF e Rac1 translocação. As células HEK-293 transfectadas com o miR-204 ou miR-185 foram cultivadas em condições isentas de soro e tratadas com ou sem BDNF (100 ng /mL) durante 10 minutos e coradas com anticorpo Rac1 (vermelho) e FITC-faloidina (verde) . As setas indicam regiões de enrugamento da membrana. D, o miR-204 aumenta a sensibilidade das células de HEK-293 a apoptose, conforme determinado por coloração /PI Anexina V usando o kit de detecção de apoptose V FITC-anexina. A população de células percentagem mostrado é a média ± SEM de três experiências independentes. E, a análise de transferência de Western de células HEK- 293 transfectadas com o miR-204 utilizando anticorpo anti-caspase-3 (1:500) e anti-PARP (1:1000) mostram aumento da clivagem de caspase-3 e PARP. β-actina (1:10,000) foi utilizada como um controlo de carga. fotografia do gel é representativa de três experiências independentes.
AKT controla invasão celular através da regulação de vários processos que estão envolvidos na organização da actina, a adesão célula-a-célula, e a motilidade celular [28], [29] , [30]. Para examinar se o miR-204 pode desempenhar um papel directo no presente processo, avaliou-se o efeito de miR-204 sobre-expressão na activação da proteína pequena GTPase Rac1, que funcionalmente interactua com o AKT /mTOR e é relatado para desempenhar um papel crítico na migração de células e a reorganização da actina após indução com BDNF [31] ou o factor de crescimento epidérmico (EGF) [28]. A estimulação de células MDA-MB-231 (e SKOV3 ou células HEK-293) com o BDNF ou EGF induzido membrana e agitando causada Rac1 ser translocada para a região agitando (Figura 5C, Figura S7, e dados não mostrados). Em contraste, a membrana ruffling e Rac1 translocação não foram observadas em células que sobre-expressam o miR-204 quando induzida com BDNF ou EGF (Figura 5C, Figura S7, e dados não mostrados). Evasão de apoptose, o que é crítico para o crescimento tumoral e progressão [32] pode ser um outro mecanismo central à oncogénese em cancros que exibem perda de miR-204. Além disso, o aumento da actividade de AKT /mTOR também tem sido associada com a diminuição da apoptose em cancros [33]. Com efeito, o miR-204 sobre-expressão causou um aumento significativo nos níveis tanto de caspase-3 e poli activado ribose do ADP polimerase (PARP), indicadores de danos irreversíveis para a integridade da célula e do genoma, com um aumento resultante na actividade apoptótica (Fig 5D e 5E). Tomados em conjunto, os nossos resultados sugerem que a perda de miR-204 promove o crescimento de células tumorais, migração e invasão ativando seus genes-alvo que são conhecidos os reguladores da cascata de sinalização oncogénica.
Discussão
Muitos miRNAs associados com cancros são conhecidos por ser localizado para locais frágeis genômicas [34]. No entanto, surpreendentemente pouco se sabe sobre a importância funcional das regiões com aberrações cromossômicas contendo miRNAs. É provável que as telas genéticas iniciais (com resolução mais baixa hibridização genômica comparativa) destinadas a descobrir anomalias cromossómicas esquecido mudanças nas regiões genômicas contendo miRNAs. Porque miRNAs influenciar vários genes em uma ou mais vias que regulam o crescimento celular e apoptose e contribuem para a formação de tumores quando desregulamentado, um controlo mais próximo de regiões genômicas menores que codificam miRNAs provavelmente irá fornecer importantes insights sobre o mecanismo de desenvolvimento de neoplasias. Como a maioria dos miRNAs são propostas a ser reprimidos em cancros, acreditamos que microdeleção de regiões genéticas contendo miRNAs específicos é um evento mais frequente que desempenha um papel importante no desenvolvimento e progressão de cancros humanos e merece maior atenção.
neste estudo forneceu a evidência que o miR-204, que actua como um potente o crescimento do tumor e um supressor de metástase, é somaticamente perdido em cancros humanos. Nós demonstramos que o miR-204 regula a expressão e função de proteínas pró-angiogénico BDNF e seu receptor TrkB em tumores. Nossos resultados mostram que a perda de miR-204 promove BDNF (ou EGF) a migração de células cancerígenas induzida por invasão e pela ativação de Akt /mTOR levando a Rac1 translocação e reorganização da actina. Desde AKT e Rac1 exigem uns dos outros para a sua activação [28], [35], os nossos resultados sugerem que a perda de miR-204 expressão em tumores humanos podem induzir o ciclo de realimentação positiva entre BDNF /AKT1 /mTOR e Rac1 durante a migração de células cancerosas e invasão. Apoiando isto, tanto de mTOR e complexos mTORC1 mTORC2 têm sido relatados para regular a motilidade e metástases de cancro colo-rectal por meio da via de sinalização Rac1 [36], e Rac1 foi mostrado para regular simultaneamente mTORC1 mTORC2 e [37]. Por outro lado, o BDNF, o qual activa os níveis Rac1 ligada a GTP [38], tem sido mostrado para ser bloqueada por inibidor de mTOR rapamicina [39]. Estes estudos, juntamente com os nossos resultados mostram níveis reduzidos de pAKT /pS6K em linhas celulares de tumores e em que sobre-expressam o miR-204, indicam fortemente que o BDNF /AKT /mTOR /Rac1 cascata de sinalização é um dos principais alvos de miR-204. Estudos futuros destinadas a abordar o efeito de miR-204 em componentes mTORC1 e mTORC2 como Raptor /SIN1 provavelmente irá fornecer informações adicionais. Semelhante ao BDNF, os nossos resultados mostram que o miR-204 inibe a activação induzida por EGF de Rac1. Isto é significativo, como foi mostrado diafonia entre o EGFR e do receptor de TrkB de BDNF para induzir a migração de células de cancro [40] e a resposta ao EGF é um passo fundamental durante a invasão de células de cancro e está directamente relacionada com a metástase [41]. Estas observações sugerem que o miR-204 pode ter um papel mais amplo para alterar a migração de células de cancro induzido pelo factor de crescimento e invasão em geral. Além disso a migração de células de cancro e invasão, activação de BDNF sinalização /TrkB pode também contribuir para a evasão de apoptose em miR-204 células esgotadas como BDNF superexpressão /TrkB tem sido associada com estabilização e activação de AKT resultando em diminuição da apoptose [42]. Coerente com isso, nossos resultados mostram que miR-204 superexpressão resulta em fosforilação reduzida e ativação de mTOR alvos a jusante 4E-BP1 e S6 quinase.
Porque miR-204 reside no
receptor de potencial transitório canal de cátions membro 3
(
TRPM3
) gene, que é um membro do receptor transiente potencial canais família de proteínas que se sabe serem importantes para a sinalização de cálcio e homeostase celular, será tentador especular que os fenótipos associada com a perda genômico de loci cromossómico contendo miR-204 também pode ser contribuído pelo gene hospedeiro
TRPM3
. Nossos resultados mostram supressão do crescimento de tumores e metástases após a introdução da sozinho miR-204, e nenhuma mudança nos níveis de
gene TRPM3
no miR-204 células cancerosas imitar ou inibidor de superexpressão (Figura S8), sugerem claramente que miR-204 fenótipo supressor de tumor associado não é mediada através
TRPM3
. No entanto, não podemos excluir a possibilidade de que o miR-204 e seu gene hospedeiro
TRPM3
actuam em sinergia para regular a supressão do crescimento do tumor, bem como a migração de células tumorais e invasão. Desde um papel definido para
TRPM3
na tumorigênese não foi relatado, um estudo detalhado examinando
O papel supressor de tumor potencial TRPM3
e seu efeito sinérgico com miR-204 (se houver) será alvo de investigações futuras.
em conjunto, nossos resultados sugerem que loci genéticos contendo miRNA específico pode desempenhar um papel causal no crescimento e metástase do câncer através da regulação de chave via oncogénica. A capacidade de miR-204 para direcionar
BDNF
/
TrkB
e
Ezrin
, que têm papéis importantes em processos celulares normais e estão sobre-expresso em cancros agressivos, indica que miR -204 pode controlar mecanismos reguladores-chave, a desregulação dos quais podem predispor eventos normais de desenvolvimento /diferenciação a sofrer transformações. Portanto, as estratégias que visem a utilização miR-204 como regimes terapêuticos terá a vantagem de reverter passos inapropriadamente activadas em células cancerosas para um estado mais normal. A identificação de miR-204 como um supressor tumoral potente juntamente com demonstração do seu potencial terapêutico e hepatotoxicidade insignificante estabelecer uma forte razão para o desenvolvimento de miR-204 como um regime terapêutico viável para tratar o cancro.
Materiais e Métodos
normais e tumorais de tecido amostras e linhas celulares
As linhas celulares representativas de tumores pediátricos renais (HEK-293; linhagem celular de rim embrionário) cancros, ovário (SKOV3), e da mama (MDA-MB-231) utilizado para experiências foram obtidas de ATCC e cultivadas de acordo com os protocolos fornecidos. Setenta e seis tumores renais pediátricos e rim combinado normal foram adquiridos a partir das Crianças Oncology Group (Arcadia, CA). Onze tumores de ovário em estágio avançado e cinco tecidos ovarianos normais foram obtidos a partir UT MD Anderson Cancer Center (Houston, TX). Quinze tecidos de cancro da mama e tecidos normais pareados foram obtidos a partir UT Saúde Science Center (San Antonio, TX).
RNA e proteínas Análises
O RNA total foi extraído de tumores e tecidos normais, bem como todas as linhas celulares, e foi sujeito a análise de qRT-PCR, como descrito anteriormente [43]. A análise Western blot foi realizada tal como descrito previamente [43]. β-actina foi utilizado como um controlo de carga. β-actina foi utilizado como um controlo de carga.