Abstract

Ativação Geral do factor indutível por hipoxia (HIF) Vias é classicamente associada com prognóstico adverso em câncer e tem sido proposto para contribuir para oncogênicos dirigir. Em células claras carcinoma renal (CCRC) Vias HIF está regulada pela inativação do supressor de tumor von-Hippel-Lindau. No entanto HIF-1α e HIF-2α ter efeitos contrastantes na progressão tumoral experimental. Para entender melhor este paradoxo examinamos os padrões pan-genômicas de DNA HIF de ligação e expressão do gene associado em resposta à manipulação de HIF-1α e HIF-2α e relatou os resultados para CCRC prognóstico. Nossos resultados revelam organização pan-genómica distinta de HIF obrigatório em milhares de sites DNA específico da isoforma canônica e não canônica. Foram observadas associações globais entre HIF-específico-1α de ligação, e os genes associados com prognóstico favorável e entre prognóstico vinculativo e adverso HIF-específico-2α. No entanto, dentro de cada conjunto específico-isoforma, associações de genes individuais foram heterogêneos em sinal e magnitude, sugerindo que a ativação de cada isoforma HIF-α contribui altamente complexa mistura de efeitos pró e anti-tumorigênicos

Citation:. Salama R, Masson N, Simpson P, Sciesielski LK, Sun M, Tian YM, et al. (2015) Heterogêneos Efeitos da Direct hipóxia via de ativação em cancro do rim. PLoS ONE 10 (8): e0134645. doi: 10.1371 /journal.pone.0134645

editor: Jörn Karhausen, Duke University Medical Center, United States |

Recebido: 27 de maio de 2015; Aceito: 10 de julho de 2015; Publicação: 11 de agosto de 2015

Direitos de autor: © 2015 Salama et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de Dados: Os dados foram depositada no banco de dados do NCBI Gene Expression Omnibus (GSE67237, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE67237)

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por um Research UK Cancer (número de concessão A16016) para RS, NM e DRM, o Instituto Ludwig de Pesquisa sobre o Câncer para PJR e MS, o Conselho de Financiamento do Ensino Superior para a Inglaterra para DRM, o Wellcome Trust (números de concessão 078.333 /Z /05 /Z, WT091857MA) para PJR, YMT e PS, e da Fundação alemã de Pesquisa (número de concessão SC132 /2-1) para LKS. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a hipoxia é fortemente associada com prognóstico adverso em vias de câncer e hipóxia sinalização são comumente ativados durante o desenvolvimento do câncer [1-4]. Isto é exemplificado pelo cancro de células renais claras (CCRC), em que a inactivação do supressor de tumor de von Hippel-Lindau (pvhl) é um evento comum e cedo [5-7]. pvhl é o componente de reconhecimento de um complexo de ubiquitina ligase E3 que tem como alvo hipoxia fator induzível (HIF) a-subunidades para degradação pela via da ubiquitina-proteassoma, e inactivação de resultados pVHL na activação constitutiva da via de transcrição HIF [8]. HIF alvos transcricionais incluem muitos com funções que se associam com características comuns fenotípicas de cancro (por exemplo, reforço angiogénese, metabolismo energético desregulado, o aumento da motilidade celular), e é vulgarmente assumido que a oncogénese é conduzida em grande parte, pela agregação de os efeitos positivos de activação do HIF sobre tais processos.

activação da transcrição por HIF é mediada principalmente através da ligação de HIF heterodímeros α /p a uma sequência de consenso de núcleo (RCGTG) em elementos de resposta a hipoxia (HRE) [9]. Embora as duas subunidades HIF-a mais bem caracterizados, HIF-1a e HIF-2a, arquitetura de domínio semelhante manifesta, e as sequências de ligação a DNA indistinguíveis [10], eles transativar alvos distintos e mostrar contrastando papéis tumorigênicos [11,12]. Surpreendentemente, forte aumento da regulação do HIF seguinte inativação da BVS em CCRC está associada com um viés incomum na expressão da isoforma HIF, no sentido de HIF-2α [13]. Várias linhas de investigação indicam que este é funcionalmente importante no desenvolvimento de CCRC. estudos de associação do genoma identificadas variantes polimórficas que afectam a susceptibilidade a CCRC ao HIF-2α, mas não HIF-1α, local e em loci dentro da via de transcrição HIF-2α [14]. Por outro lado, a dosagem do gene HIF-1α é geralmente reduzida em CCRC por perda do cromossoma 14q [15], e o gene de HIF-1α, mas não o gene HIF-2α, é sujeito a um pequeno mas significativo excesso de mutações de inactivação [16] . Além disso, HIF-2α mas não HIF-1α, pode sobrepor-se a actividade supressora de tumor de pVHL em sistemas de tumores experimentais [17,18]. Especificamente, a re-expressão de HIF-1α em linhas CCRC que carecem de tipo selvagem HIF-1α retarda o crescimento, enquanto que a sobre-expressão de HIF-2α acelera o crescimento em xenoenxertos tumorais [11,15].

Estas observações a desafiar paradigma geral de que a activação de unidades de sinalização HIF oncogénese através da activação de um pequeno número de alvos transcricionais discretas, e sugerem uma interface mais complexas. Por exemplo, as análises pan-genómicos revelou centenas a milhares de alvos transcricionais directos HIF [10,19-22]. Uma vez que o HIF-1α e HIF-2α podem potencialmente competir para a ligação a HIF-1β ou para ocupação de HRE, ou podem ligar-se diferentes conjuntos de alvos transcricionais, não é claro como a manipulação específica isoforma de impactos HIF-alfa sobre os padrões de transcrição associada com CCRC.

Para estudar esta foi realizada a análise ChIP-SEQ e ARN-SEQ detalhada do HIF-α isoforma ocupação local de ligação e a expressão do gene na linha celular CCRC 786-0 pvhl-defeituoso, após re-expressão de HIF-1α ou sobre-expressão de HIF-2α, e relacionado essas conclusões ao prognóstico padrões associados da expressão do gene em tumores CCRC humanos [6]. Nossos resultados revelam um grande número de sítios de ligação específicos da isoforma HIF-a discretas que manifestam uma arquitetura genômica específica do isoforma, ative padrões distintos de expressão gênica e associado com contrastantes padrões de expressão gênica prognósticos na CCRC clínica. No entanto, apesar de claras associações globais foram observadas entre os genes HIF-associado-1a e bom prognóstico clínico e entre os genes HIF-2α-associados e mau prognóstico clínico, esta dicotomia estava incompleta. Ao nível dos genes individuais, os efeitos foram heterogêneos, tanto sinal e tamanho de efeito, sugerindo que mesmo dentro desse contexto definido, cada isoforma HIF-α tem potencialmente ambos os efeitos pró e anti-tumorigénica.

Materiais e as células métodos

Os métodos de laboratório

Cultura de células.

786-S e HEK293T foram adquiridos da ATCC (https://www.lgcstandards-atcc.org) e adulto em meio de Eagle modificado por Dulbecco suplementado com 10% de soro fetal de vitela, 2 mM de L-glutamina, 100 U de penicilina e estreptomicina 50 U /mL (v /v) (Sigma-Aldrich).

Produção de 786-0 HIF células -1α /HIF-2α.

HIF-1α e as sequências de cDNA HIF-2α [11] foram clonados pela primeira vez em pRRL.IRES.EGFP (tipo presente de Kamil Kranc, Glasgow) para gerar vetores bicistrónicos. Estes foram, em seguida, co-transfectadas com pCMV-dR8.2 e PCMC-VSVG em células HEK293T e as partículas virais resultantes foram isolados por centrifugação e ultrafiltração. 786-0 (ATCC) foram então transduzidas com qualquer um de controle (pRRL), HIF-1α (pRRL-HIF-1α) ou HIF-2α (pRRL-HIF-2α) expressando vírus.

ChIP-seq .

análises Single chip-seq foram realizados conforme descrito anteriormente [19]. Cromatina foi imunoprecipitado usando anti-soro policlonal de coelho para o HIF-1α (PM14), HIF-2α (MP9) [23], HIF-1β (NB-100-110, Novus Biologicals, Reino Unido) ou soro pré-imune como controlo.

poliA + selecionado RNA-seq

o RNA total foi preparado em triplicado utilizando o kit de isolamento Mirvana miRNA. (Ambion; Life Technologies Ltd, Paisley, UK) e tratada com DNaseI (TURBO DNA-free, Ambion ). bibliotecas de ARN poliA + foram então preparadas utilizando o kit de ARN ScriptSeq V2-SEQ (Epicentre, Madison, WI, EUA).

de alta capacidade de sequenciação.

Todas as bibliotecas foram preparadas de acordo com os protocolos e Illumina sequenciados na plataforma HiSeq 2000 (Illumina, San Diego, CA, EUA).

códigos de adesão.

dados chip-seq e RNA-seq estão disponíveis a partir Gene Expression Omnibus (GSE67237).

análise bioinformática de dados do chip-seq

análise inicial.

sequências de adaptador Illumina foram aparadas usando Trimgalore (0.3.3) e as leituras foram alinhados com Genome Consortium Referência GRCh37 ( hg19) usando BWA (0.7.5a-R405). mapeamento de baixa qualidade foi removido (MapQ 15) usando SAMtools (0.1.19) [24] e lê mapeamento para regiões lista negra Duke Encode (https://hgwdev.cse.ucsc.edu/cgi-bin/hgFileUi?db = hg19 g = wgEncodeMapability) foram excluídos usando BEDTools (2.17.0) [25]. Duplicar leituras foram marcados para exclusão usando ferramentas Picard (1.106) (https://picard.sourceforge.net/). Ler densidades foram normalizados e expressa como leituras por quilobase lê por milhão (RPKM) [26]. Um milhão de regiões não sobrepostas aleatórios selecionados de ENCODE DNase Cluster II picos (https://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/hg19/encodeDCC/wgEncodeRegDnaseClustered/) foram utilizados como controle.

Chamada Peak .

(análise baseada no Modelo de chIP-Seq) picos chip-seq foram identificados usando T-PIC (Peak Identificação forma de árvore para chip-Seq) [27] e MACS [28] no modo de controle. Picos detectados por ambos os chamadores de pico foram filtrados quantitativamente usando a contagem total do pico para incluir apenas os picos que estavam acima do percentil 99.99th das regiões fundo aleatórios selecionados do cluster ENCODE DNASE II (p 0,0001).

De-novo Análise Motif.

As sequências flanqueando cada cimeira de pico (± 150bp) foram repeat-mascarados com RepeatMasker 4.0.3 (https://www.repeatmasker.org). motivos de-Novo foram identificados utilizando Meme-chip (4.9.1) [29] e combinados, usando o módulo TomTom, a motivos de fatores de transcrição conhecidos no banco de dados 2009 Jaspar núcleo [30].

Análise de Componentes Principais (PCA).

sítios de ligação para todas as subunidades incluídos no APC foram fundidos em um conjunto de ligação. APC foi realizada utilizando Singular Value Decomposition (Prcomp, R 3.1.1 -stats biblioteca, https://cran.r-project.org) para ambos os locais de ligação individuais e para a totalidade do sinal de ChIP-seq para cada subunidade. Biplots foram gerados em

mapas de calor R.

local de ligação mapas de calor foram gerados usando Ngsplot (2,08) [31] com os parâmetros:. FL = 50, PM = 5, RZ = 1 , SC = 0-1, MQ = 15.

Motif Probabilidade.

Cada ligação HIF-α região (cúpula ± 150bp) foi digitalizada para o HRE (Jaspar /MA0259.1) e o AP-1 (Jaspar /MA0491.1) os motivos que utilizam matrizes de peso posição (PWMs) obtidos a partir do banco de dados de 2009 Jaspar núcleo [30] vinculativo. A taxa de probabilidade normalizada (NLR) para cada motivo foi calculada de acordo com a Equação 1. O rácio de probabilidade máxima normalizada para cada região de ligação foi relatado tanto para o HRE e AP-1 como motivo dado pela Equação 2.

Equação (1) a equação (2)

Onde

j

é a posição no pico,

i

é a posição no motivo,

L

é o comprimento do motivo,

PWM (b

,

i)

é o valor PWM em

i

para a base correspondente

b

,

b (b)

é o peso de fundo para a base correspondente calculado ao longo de um milhão de sites de DNAse aleatória e

W

é a largura do pico.

análise bioinformática de dados de RNA-seq

Initial análise.

sequências de adaptador foram aparadas como acima. Lê foram então alinhado com GRCh37 usando 2.0.8b Tophat (https://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml) e bowtie 1.0.0 (https://bowtie-bio.sourceforge.net/index. shtml) e mapeando fragmentos excluídos usando SAMtools-singularmente não (0.1.19) [24]. As contagens totais de leitura para cada gene definido UCSC foram extraídos utilizando HTSeq (0.5.4p3) [32] com o modo ‘intersecção-estrita “e genes significativamente regulados foram identificados utilizando DESeq2 (ref. [33]).

Gene definir análise de enriquecimento (GSEA).

análise enriquecimento

GSEA usado 10000 permutações, pontuação enriquecimento ponderada e pré-classificação de genes [34]. Ambos significado expressão diferencial de acordo com DESeq2 e dobre-diferença entre as duas condições foram usadas para classificar genes [35] (Eq 3).

Equação 3

Onde φ

i é a log2 fold-change e

pv

i

é o valor-p para o gene

i

.

o Cancer Genome Atlas (TCGA) GSEA.

Os dados V2 clínicos e RNA-seq para rim renal Limpar Cell Carcinoma (KIRC) pacientes (https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/) [6] foi agrupada. Foram excluídos pacientes com falta de dados clínicos ou vários conjuntos de dados de RNA-seq. contagens de mRNA normalizados foram utilizados como previsto. Os pacientes foram divididos em dois grupos, utilizando um escore prognóstico, adicionando 1 para cada uma; idade acima de 60, estágio patológico 3 ou 4, presença de metástase, ou paciente falecido. pacientes bom prognóstico teve 0 ou 1 e mau prognóstico pacientes marcou 2, 3 ou 4. A expressão diferencial de cada gene entre os grupos de pacientes foi avaliado pelo teste de verossimilhança para os modelos equipados binomial negativa usando glm.nb em R (3.1.1 ). Genes foram classificados para GSEA baseado em significado combinado e dobre-a mudança como acima.

Doença de anotação.

enriquecimento local de ligação foi calculada utilizando -log10 do teste binomial FDR (q-valor) por GRANDE (Genomic Regiões Enriquecimento de Anotações ferramenta [36]) 2.0.2. subtipos de câncer sem enriquecimento no conjunto de dados, quer ChIP-seq foram removidos.

Encadernação Gene Predictor.

Genes dentro de 10 kb de locais com pelo menos 3 vezes diferença entre HIF-1α e HIF -2α de ligação foram selecionados para projetar um preditor de genes utilizando Supervisionado Princípio Análise de componentes (SPCA) [37,38]. Em primeiro lugar, genes de ligação HIF demonstrando significância univariada; foram selecionados em predizer o prognóstico do paciente (Cox modelo de riscos proporcionais) (p proporções que são semelhantes aos relatados para HIF-1α em células de cancro da mama MCF-7 [39].

A seguir, procurou definir os efeitos funcionais deste novo vinculativo sobre a expressão do gene HIF-1α. a expressão do gene Pan-genómico foi perfilado em células que expressam um novo controlo e HIF-1a pela RNA-seq. Genes foram classificados de acordo com uma combinação de fold-mudança no nível de transcrição a seguir re-expressão de HIF-1α eo significado desta mudança [35]. Usando isso, gene análise ranking do conjunto de enriquecimento (GSEA) [34] do gene mais próximo a cada local de ligação HIF-1α demonstrou uma altamente significativa (p 0,001) associação entre HIF-1α de ligação e positiva, mas não negativo, a regulação destes transcritos (Figura 1E). Isto é consistente com descobertas anteriores de que o HIF actua predominantemente como um activador transcricional [10,19]. Ele também indica que a nova ligação de HIF-1α é funcional e tem efeitos directos e largamente positivos sobre a expressão através de um grande número de genes.

Em contraste, observou-se alguns efeitos de re-expressão de HIF-1α na transcrição (níveis de vizinho mais próximo) de ligação genes HIF-2α. GSEA demonstrado um efeito de re-expressão de HIF-1α sobre a expressão de genes de HIF-2a de ligação (S6 FIG), presumivelmente como um efeito directo de HIF-1α ligação a alguns destes positiva, mas não significativa (p = 0,15) locais (Fig 3C). Mais importante, não houve evidência de grande escala sub-regulação de genes de ligação HIF-2a (ou seja, sem enriquecimento de genes entre os genes regulados negativamente ligação HIF-2α) como uma consequência da re-expressão de HIF-1α em células 786-S. Isto confirma a conclusão de que re-expressa HIF-1α não antagonizar significativamente a atividade HIF-2α em todo o genoma.

A superexpressão de HIF-2a mais ativa seus alvos endógenos

Uma vez que a sobre-expressão de HIF- 2α em células 786-S tem um efeito oposto no crescimento do tumor de xenoenxerto de re-expressão de tipo selvagem HIF-1α [11], que em seguida examinado o efeito de aumentar os níveis de HIF-2α em HIF de ligação e expressão de genes. Em primeiro lugar, procurou distinguir se a ligação de HIF-2α em células 786-O defeituosos BVS está saturado ou se a sobre-expressão de HIF-2α aumentaria ligação a sites que já estão ocupadas em células de controlo. Para testar isso, que correlacionou a intensidade dos sinais de ligação HIF-2α em células com superexpressão transfectadas HIF-2α com que nas células de controle. Isto revelou um aumento em ambos os sinais de HIF-2α e sinais de HIF-1p na maioria dos locais de ligação endógeno HIF-2a a seguir sobre-expressão de HIF-2α (Fig S7), indicando que os níveis endógenos de HIF-2α 786-0 em células não são suficientes para carregar totalmente estes HIF-2α sítios de ligação.

Ampla não-canônica de ligação de overexpressed HIF-2α

Notavelmente no entanto, a análise pan-genómica revelaram um total de locais de ligação 5283 discreta HIF-2a em que as células que sobre-expressam 786-0 HIF-2α. Estes locais incluem muitos daqueles ocupado por endógena HIF-2α. Em contraste com os resultados seguintes re-expressão de HIF-1α, análise do mapa de calor de HIF-2α e ligação HIF-1β indicou que muitos destes locais estão ocupados apenas por HIF-2α, sem HIF-1β (Fig 2A, comparar iii e iv). Concordante com esta, a análise revelou que APC transfectadas HIF-2α e HIF-1β ligação co-variam menos extensivamente em células que sobre-expressam transfectadas HIF-2α do que nas células de controlo (Fig 2B).

(A) HIF- locais de ligação 2a do HIF-2α células que sobre-expressam foram identificados por pico de chamada e classificados no eixo vertical de acordo com a intensidade do sinal. mapas de calor destes locais (± 5kb no eixo horizontal) mostra a densidade de leitura ChIP-seq para as subunidades de HIF indicados foram geradas para ambas as células de controlo (I, II) e as células com o HIF-2α sobre-expressos (III, IV). Em contraste com a re-expresso HIF-1α, overexpressed HIF-2α liga-se a um grande número de sítios (compare I e III), sem HIF-1β (comparar III e IV) e tem pouco efeito sobre a distribuição de HIF-1β ( comparar II e IV). (B) Biplot mostrando Análise de Componentes Principais (PCA) da intensidade do sinal ChIP-seq (valores RPKM) para ambos os sites individuais de ligação (pontos) e HIF-subunidades (vetores) em todos os locais de ligação de HIF identificados em células de controlo e em HIF- 2α células superexpressão. Locais de ligação endógeno HIF-2α em células de controle são mostrados em azul, enquanto locais de ligação expressa re-HIF-1α são mostrados em vermelho, sítios de ligação de ambos são de cor púrpura e os locais restantes são de cor cinza. PCA para subunidades de HIF mostra que o HIF-2α e HIF-1β co-variar mais em pormenor nas células de controlo (comparar HIF2α (VA) e HIF1β (VA)) do que nas células que sobre-expressam (comparar HIF2α (2αOE) e HIF1β (2αOE) ). (C) Histograma da distância a mais próxima local de início da transcrição (TSS) para locais em células que sobre-expressam o HIF-2α ligação HIF-2α. locais nas células com superexpressão HIF-2a de ligação (D) HIF-2α foram classificados de acordo com a classe (Ensemble) do gene mais próximo. A freqüência relativa de cada classe é mostrado pelo gráfico de pizza. análise de conjunto enriquecimento Gene (GSEA) para o conjunto de genes mais perto de locais de ligação de HIF-2a (E) nas células de controlo e (f) recentemente identificados locais nas células com superexpressão de ligação HIF-2α, quando os genes são classificados de acordo para Pasta e mudança na expressão de ARNm de significância a seguir sobre-expressão de HIF-2α (eixo horizontal).

Como com a ligação em células que expressam re-HIF-1α, a distribuição dos locais de ligação transfectadas HIF-2a era notavelmente não -uniform em todo o genoma (fig 2C e 2D). Curiosamente, apesar do grande aumento no número de sítios que conformados com um padrão semelhante ao observado para endógena HIF-2α em ambos estes (Fig S8) e células não-CCRC (MCF7) [10,39], mas distinta da de HIF-1α. Em contraste com o HIF-1α, a distribuição foi mais promotor-distai (Fig 2C). Além disso, como com os padrões de ligação de HIF-2α endógenos, anotação de genes “vizinho mais próximo” revelou que uma proporção substancialmente maior foram em loci não-codificante do gene, do que foi observado para a re-introduzidos ou endógena HIF-1α (Figura 2D). Estas diferenças entre as isoformas de HIF-a, que foram observados independentemente do nível de expressão do tipo de célula ou o número de sítios ligados, sugerem que a capacidade de reconhecer intensificadores promotores distante em não-codificante do gene loci contra sítios promotor proximal é uma propriedade inato de HIF- α isoformas.

por fim, buscou-se identificar se o aumento de carga de locais de ligação de HIF-2α existente ou ligação de HIF-2α em locais recentemente detectados, ou ambos, está associado a efeitos funcionais sobre a expressão gênica. Utilizou-se para testar GSEA enriquecimento de loci de ligação de HIF (genes vizinhos mais próximos) entre os genes cuja expressão foi alterada por sobre-expressão de HIF-2α (tal como medido pela RNA-SEQ). Foi realizada a análise para ambos os sítios de ligação que foram ocupados pela endógena HIF-2α, e aqueles que foram recentemente observados após a sobre-expressão de HIF-2α. Uma associação com positiva, mas não negativo, foram observados efeitos sobre a expressão do gene para ambos os grupos de loci de ligação (Fig 2E e 2F). Assim, a activação constitutiva do HIF-2α em 786-0 células é submáximo e aumentando a HIF-2α leva a ambos os efeitos quantitativos e qualitativos sobre a expressão do gene alvo HIF.

Curiosamente, perto inspeção das aparentemente novos sítios de ligação com frequência revelou baixos níveis de HIF obrigatório nesses locais nas células de controle, que estavam abaixo dos limiares para a identificação de uma ligação significativa, mas sobretudo às observadas no conjunto de regiões de controlo (S9A FIG). Isto sugere que estes sinais são de fato ‘real’ e refletir distribuição irregular de carga de potenciais sítios de ligação HIF (S9B Fig).

Análise de HIF-2α e HIF-1α motivos de ligação

Desde HIF -1 e HIF-2 são relatados para reconhecer uma sequência de ligação ao DNA de base idêntica [10], não está claro porque a ligação de HIF-1α e HIF-2α é distribuído de forma tão diferente. Para abordar esta começamos por analisar as sequências de imunoprecipitados de fator de transcrição motivos usando MEME-chip obrigatório. Como esperado, o motivo HRE canónica (Jaspar /MA0259.1) [40] foi enriquecido em todos os conjuntos de locais de ligação; os lugares ocupados por endógeno HIF-2α, overexpressed HIF-2α e expressou-re HIF-1α e enriquecimento foi positivamente correlacionada com a força do sinal de HIF-1β (Figura 3A e 3B e S8C Fig, linha azul). O segundo motivo mais enriquecido foi um (TRE) motivo de ligação AP-1 (Jaspar /MA0491.1) [40]. Curiosamente, este enriquecimento foi bastante diferente distribuídos entre HIF-1α e loci de ligação HIF-2α. Foi observada uma forte enriquecimento em sequências de ligação sobre-expresso de HIF-2α (Fig 3B). No entanto, em contraste marcado com o motivo HRE, no conjunto de ligação para a sobre-expresso de HIF-2α, o enriquecimento do motivo AP-1 foi correlacionada inversamente com a força de ligação de HIF-1β (Fig 3B). Além disso, no conjunto de loci de ligação HIF-1α, o motivo de ligação a AP-1 foi significativamente empobrecido (Fig 3A). Em geral, a distribuição diferencial do presente AP-1 motivo entre HIF-1α e loci de ligação HIF-2α foi altamente significativa (p 10

-16).