Abstract

carcinoma do cólon humano (HCT-8) células mostram uma transição estável, de baixo a alto estado metastático quando cultivadas em substratos convenientemente macios (21 kPa). Inicialmente epitelial (E) na natureza, as células HCT-8 ficam arredondados (R), após sete dias de cultura em substrato macio. R células mostram um número de características metastáticas [1]. Aqui, nós utilizamos substratos gradiente de rigidez, um sensor de força bio-MEMS, e ensaios de contador Coulter para estudar mecanosensibilidade e a adesão de células E e R. Nós achamos que as células HCT-8 perder mecanosensibilidade como eles sofrem transição E-to-R. rigidez HCT-8 células de R ‘, a área de espalhar, proliferação e migração se tornar insensível ao substrato rigidez em contraste com o seu homólogo epitelial. Eles são mais suaves, proliferativa e migratório em todos os substratos. R células mostram negligenciável adesão homotípica célula-célula, assim como a adesão célula-substrato não específico. Consequentemente, eles mostram a mesma área de propagação em todos os substratos em contraste com as células E. Tomados em conjunto, estes resultados indicam que as células R adquirir autonomia e independência de ancoragem, e são, portanto, potencialmente mais invasiva do que as células E. Para o melhor de nosso conhecimento, este é o primeiro relatório de dados quantitativos relativos mudanças na adesão das células de câncer e rigidez durante a expressão de um

in vitro

metástase-como fenótipo

Citation:. Tang X, Wen Q, Kuhlenschmidt TB, Kuhlenschmidt MS, Janmey PA, Saif TA (2012) Atenuação de celular mecanosensibilidade em células cancerígenas do cólon durante

In Vitro

metástase. PLoS ONE 7 (11): e50443. doi: 10.1371 /journal.pone.0050443

editor: Fan Yuan, da Universidade de Duke, Estados Unidos da América

Recebido: 07 de agosto de 2012; Aceito: 22 de outubro de 2012; Publicado: November 30, 2012 |

Direitos de autor: © 2012 Tang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O trabalho é financiada pela National Science Foundation (NSF) concede No. ECCS 07-25831, 10-02165 e NIH RO1 083272-03. XT foi financiado pela NSF Grant 0965918 IGERT: formação da próxima geração de Pesquisadores em Celular e Mecânica Molecular e bionanotechnology. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a maioria das mortes de cancro são causadas por metástases e não do tumor por pai primário [2], [3], [4], [5], [6]. Durante a metástase, as células cancerosas malignas do tumor escapar ao separar um do outro ou a partir de outras células e a matriz extracelular (ECM) [2], [3], [6], [7]. As células escaparam expressam activamente proteinases e alterar os seus ligandos de adesão para degradar e modificar a ECM circundante [3], [4], [5], [8], [9]. Simultaneamente, que sobre-regular a sua motilidade e resistência à apoptose por difusão bem sucedida vascular e invasão de órgãos distantes saudáveis ​​[6], [7], [10]. Ao mesmo tempo, estas células reduzir a sua rigidez [11], [12], [13], [14], isto é, aumentar a sua conformidade a fluir através de pequenos capilares [4], [15], [16]. Um estudo quantitativo das propriedades mecânicas das células cancerosas durante as fases iniciais de metástase; no entanto, está faltando [17], [18], [19], [20], em grande parte por causa dos desafios na detecção do início da metástase

in vivo

ea heterogeneidade nas propriedades bioquímicas e celulares de tumor individual células [3], [17], [21], [22].

recentemente, descobriu [1] que as células de carcinoma do cólon humano (HCT-8) pode consistentemente exibir um

in vitro

-metástase como fenótipo (MLP) quando cultivadas em substratos de hidrogel macias com rigidez mecânica apropriada (géis de poliacrilamida, com o módulo de Young: 21~47 kPa [1], [23]). As células HCT-8 são epitelial (E) na natureza. Quando cultivadas em substratos macios, eles primeiro formam aglomerados ou ilhas epiteliais distintas. Após 7 dias, as células dissociam-se as ilhas, e assumem uma forma arredondada (células R). Estas células são altamente proliferativo R, migratório e significativamente regular negativamente a expressão de E-caderina – características típicas de metástase [1], [24]. Além disso, E a transição R é repetível e irreversível [1], [24]. Em substratos rígidos (3 substratos de poliestireno GPa), este E a transição R não ocorre.

Neste estudo, nós apresentamos uma investigação detalhada das mecanosensibilidade de ambos pré e pós-metástase-like HCT-8 as células utilizam um substrato rigidez gradiente. O estudo revela a perda de mecanosensibilidade de HCT-8 R células em contraste com as duas as células E e os fibroblastos normais. A rigidez das células R, medido por AFM, torna-se independente de rigidez do substrato. Em contraste, a rigidez de células E é correlacionada com a rigidez do substrato. contador Coulter e Bio-MEMS ensaios revelam que as células R têm baixa adesão célula-célula homot�ica e adesão não específica insignificante em comparação com células E.

Resultados

1. fraca adesão entre-8 HCT células R e substrato

Para explorar como 8 HCT-células R respondem a diferentes substratos fisiologicamente relevantes de diferentes graus de rigidez, HCT-8 células R foram colhidas a partir de géis PA suaves, expandido como descrito em Materiais e Métodos e, em seguida, cultivadas em substratos de gel PA rigidez de gradiente frescos com rigidez variável continuamente de 1 a 20 kPa (Fig. 1A, esquerda para a direita). O substrato rigidez de gradiente é revestido com uma concentração uniforme de fibronectina para permitir a fixação de células ao substrato [25], [26], [27]. Para efeitos de comparação, os dois HCT-8 células E e células de rim de macaco normal de fibroblastos (MKF), sem qualquer exposição prévia a géis PA, foram plaqueadas sobre os mesmos substratos de gradiente de rigidez e de funcionalização de superfície (Fig. 1B e 1C). As células normais MKF foram escolhidos como controlo porque eles são conhecidos por serem mechanosensitive rigidez ao substrato [28]. Descobrimos, em contraste com células HCT-8 e as células E MKF normais, as células HCT-8 R constitutivamente mostrou áreas de contacto substrato muito limitada, independentemente de rigidez do substrato. área de contato das células R ‘com o substrato é de cerca de 40-60% de sua aparente área projetada. Como medido por imagem microscópica confocal 3D, a área de contacto célula a R com substrato é de apenas 49,5 ± 20,9 uM

2 (n = 34), que é de 3,8 ± 0,3 vezes menor do que as células E (n = 47), sugerindo que R células têm a adesão mais fraca com o substrato do que as células E. A fraca adesão das células com substrato de P também é consistente com a observação de que R células mostram uma área projectada mais pequena, do que as células E sobre a mesma rigidez do substrato (Fig. 1d). A área projetada de células isoladas, sem qualquer contato célula vizinha, de 1,9 é 0,6 vezes menor para as células R (n = 68) do que as células E (n = 61).

(A-C) imagens de contraste de fase de as células colhidas HCT-8 R, HCT-8 células e, e as células normais MKF nos substratos gel PA gradiente-rigidez. Os respectivos 3 painéis quadrados (fechados por caixas de traço amarelo) mostram as vistas ampliadas representativos sobre 1-5 kPa, 8-12 kPa e 15-20 domínios rigidez kPa. As setas brancas nas vistas ampliadas indicar as células individuais, sem contato, enquanto as setas amarelas indicam as células contactam em colônias. Barras de escala em painéis vista ampliada são 100 mm. (D) Área projetada As células individuais ‘de 3 tipos de células em toda a gama rigidez são mostrados. Aqui eles não têm qualquer contacto com as suas células vizinhas em diferentes substratos de rigidez. (E) A área de propagação de células individuais em contacto com as células vizinhas em diferentes substratos de rigidez. (F) A aparente zona de colónias de células de 3 tipos de células em diferentes substratos de rigidez. (G) O factor de forma da célula de 3 tipos de células, os quais não estão em contacto com as células vizinhas em diferentes substratos de rigidez. (H) O factor de forma da célula de células individuais, que estão em contacto com as células vizinhas em diferentes substratos de rigidez.

R células HCT-8 também mostram uma insensibilidade notável para alterar a mecânica da sua rigidez- substrato de cultura. Eles mantêm um fenótipo arredondada e a área de adesão limitado a substratos, independentemente da rigidez dos substratos (Fig 1a, indicada por setas brancas;. A Fig. 1d, 1e e 1 g). Quando a rigidez do substrato variou ao longo de um intervalo de 20 vezes, a área de difusão de células R individuais aumentou apenas cerca de 27%, (a partir de 156,2 ± 42,1 uM

2 numa zona 1 kPa (n = 62) para 197,9 ± 83,6 uM

2 (n = 56) sobre uma região de 20 kPa) (Fig. 1d). Do outro lado da rigidez testadas, o aumento da área de propagação células R ‘não é tão dramática como a de células E e MKF. Em 5 kPa, 10 kPa e 15 regiões kPa, suas áreas de spread são 158,2 ± 40,3 mm

2 (n = 56), 182,3 ± 32,2 mm

2 (n = 63), e 190,9 ± 82,5 mm

2 (n = 57), respectivamente (Fig. 1d). Além disso, o factor de forma da célula R alterada apenas 7% de 0,9 ± 0,2 em uma região de 1 kPa a 0,8 ± 0,2 com uma região de 20 kPa (Figura 1G;. O factor de forma, S = 4 * πA /P

2, onde a é a área da célula e P é o perímetro. S = 1, para a forma circular perfeita e 0 para a forma irregular), indicando forma arredondada constitutiva independente da rigidez do substrato. Em 5 kPa, 10 kPa e 15 kPa regiões, os factores de forma de células individuais R são 0,8 ± 0,1, 0,8 ± 0,2 e 0,9 ± 0,2, respectivamente (Fig. 1g). Após cultura prolongada (60 dias), as células de P não mostraram qualquer reversão para uma morfologia epitelial em todos os substratos, independentemente da rigidez, mesmo muito rígida de poliestireno (3 GPa) [1]. Além disso, a gravação diária através de microscopia de vídeo indicam que as células R mostram nenhum sinal de diminuição da atividade proliferativa, mesmo depois de vários meses em cultura. Em contraste, ambas as células HCT-8 e as células E MKF cultivadas no mesmo tipo de substratos gradiente de rigidez mostram sensibilidade óbvio para a rigidez mecânica do seu substrato de cultura. As células E isoladas área espalhar indivíduo aumenta 2,5 vezes mais de 20 vezes a mudança substrato rigidez, de 239,6 ± 191,9 mm

2 na região de 1 kPa a 578,1 ± 429,8 mm

2 na região de 20 kPa (Fig. 1b , indicado pelas setas brancas). Como substratos tornam-se rígidas, as células E HCT-8 exibir uma área maior spread, com as suas áreas de spread 270,8 201,7 mm

2 (n = 51), 276,0 ± 104,8 mm

2 (n = 62), e 442,7 367,7 ± iM

2 (n = 55) no dia 5 kPa, 10 kPa e 15 kPa regiões, respectivamente (Fig. 1b). O seu factor de forma diminuiu de 0,9 ± 0,2 na região de 1 kPa a 0,6 ± 0,2 na região de 20 kPa (Fig. 1g). Através outra rigidez testados, os factores de células de forma única E são 0,8 ± 0,2 (em região 5 kPa), 0,8 ± 0,1 (em região 10 kPa), e de 0,7 ± 0,3 (em região 15 kPa), respectivamente. O mecanosensibilidade de MKF é ainda mais pronunciado em comparação com células HCT-8 de cancro (FIG. 1C). A área de difusão de indivíduo células MKF isolados (Fig 1C;. Indicadas por setas brancas) aumenta 5 vezes através do substrato gradiente, desde 286,4 ± 86,2 uM

2 (n = 46) na região de 1 kPa a 1421,7 ± 845,7 uM

2 (n = 31) na região de 20 kPa (Fig. 1d). Como a rigidez do substrato aumenta, sua área de propagação aumenta dramaticamente, e são 578,1 ± 373,1 mm

2 (n = 62), 749,9 ± 355,5 mm

2 (n = 63), e 1218,6 ± 773,5 mm

2 (n = 59) no dia 5 kPa, 10 kPa e 15 kPa regiões, respectivamente. Concomitantemente com o aumento da rigidez do substrato, células individuais MKF se espalhou para uma morfologia mais irregular, com seu fator de forma a diminuir de 0,9 ± 0,1 no 1 kPa a 0,5 ± 0,2 para as regiões 20 kPa, respectivamente (Fig. 1g). Nas regiões de rigidez intermediários, ou seja, 5 kPa, 10 kPa e 15 kPa regiões, os fatores de forma de células MKF individuais são 0,7 ± 0,3, 0,6 ± 0,3 e 0,5 ± 0,3, respectivamente. A fraca adesão entre as células HCT-8 R e o substrato, bem como a independência da morfologia celular R rigidez do substrato, sugerem fortemente que as células perdem ancoragem R-dependência e a comunicação com o seu microambiente mecânica. Esta independência de ancoragem, pode potencialmente promover a sobrevivência R células em suspensão, o que é uma característica essencial da

In vivo

metástases de células cancerosas [2], [3], [4], [16], [22] .

2. As células HCT-8 R mostram fraca adesão célula-célula

Em substratos rigidez de gradiente, ambas as células E HCT-8 e as células MKF mostram a formação de colónias de células, especialmente em regiões mais duras (indicado por setas amarelas na Fig. 1b e 1c). O tamanho da colônia é positivamente correlacionada com a rigidez do substrato. Em substrato rigidez 1 kPa, 5 kPa, 10 kPa, 15 kPa e 20 kPa géis os tamanhos de colónias de células de HCT-8 células E são 2962,2 ± 1000,5 mm

2, 3662,1 ± 1105,3 mm

2, 4249,5 ± 919,5 mm

2, 9736,5 ± 4032,7 mm

2 e 11748,7 ± 2144,9 mm

2, respectivamente (Fig. 1F). Para HCT-8 células de R no mesmo substratos de rigidez, as dimensões das colónias são nitidamente menores do que os seus homólogos E, mesmo quando as células R estão em contacto com as células vizinhas durante 3 dias (Fig. 1a). Em rigidezes de substrato de 1 kPa, 5 kPa, 10 kPa, 15 kPa e 20 kPa, os tamanhos de colónias de células R são, 1087,4 ± 338,3 mm

2, 1449,8 ± 343,4 mm

2, 3062,2 ± 1326,9 mm

2, 3849,6 ± 919,1 mm

2 e 3912,1 ± 1183,8 mm

2, respectivamente (Fig. 1F). Observamos também que dentro de colônias de células R, a área de contato célula-célula não é tão extensa como em colônias de células E. células R parecem estar simplesmente tocando um ao outro à queima-contactos (Fig. 1a). Estes resultados sugerem que a adesão célula-célula R não é suficiente para que formam colónias coesivas ou ilhas de células como as células E e MKF.

Além disso, é interessante notar que à medida que as células HCT-8 E ou células MKF submeter a adesão homotípica célula-célula, as suas áreas de células individuais e o factor de forma das células tornam-se notavelmente menos de substrato dependente da rigidez (Fig. 1b e 1c, indicado pelas setas amarelas). áreas de células individuais e factores de forma de HCT-8 células individuais E dentro ilhas de células em 1 géis kPa são 785,6 ± 299,4? M

2 e 0,7 ± 0,1, respectivamente, o que é semelhante àquelas em 20 géis kPa, 892,8 ± 322,1 uM

2 e 0,6 ± 0,1 (Fig. 1e e 1 h). Mesmas características são observadas na rigidez intermediária, a área da célula e fator de forma do indivíduo HCT-8 E dentro ilhas são 526,7 ± 187,0 mm

2 e 0,8 ± 0,1 em 5 géis kPa, 633,9 ± 421,4 mm

2 e 0,6 ± 0.2 em 10 géis kPa e 723,1 ± 515,2 mm

2 e 0,6 ± 0,2 em 15 géis kPa. Para as células MKF individuais ilhas dentro, a sua área celular e fator de forma são 928,5 ± 374,0 mm

2 e 0,5 ± 0,3 em 1 géis kPa, 892,8 ± 415,7 mm

2 e 0,5 ± 0,3 em 5 géis kPa, 1098,1 ± 564,6 mm

2 e 0,5 ± 0,2 em 10 géis kPa, 1008,8 ± 223,7 mm

2 e 0,3 ± 0,2 em 15 géis kPa, e 1160,6 ± 429,7 mm

2 e 0,4 ± 0,1 em 20 géis kPa ( Fig. 1e e 1 h). Uma vez que estas células estabelecer contactos célula-célula, a E e células MKF mostrar o espalhamento das células muito suaves 1 géis kPa, sugerindo que os sinais de célula-célula sobrecarregar os sinais de substrato celular (região esquerda, na Fig. 1b e 1c, indicados pelo amarelo setas). A maioria das células HCT-8 R; No entanto, permanecem arredondado, com a mesma área celular aparente e factor de forma que as células de R isoladas, mesmo quando em contacto com as células vizinhas (Fig. 1A, indicado pelas setas amarelas). Este fenótipo celular R resultados em geral, menor a área de colónias de células R em comparação com ilhas de células E que consistem em números de células semelhantes (Fig. 1F). As áreas individuais de células e factores de forma de células R individuais dentro de colónias de células de R em 1 géis kPa são 151,8 ± 33,4 uM

2 e 1,0 ± 0,1, respectivamente, e é semelhante àquelas em 20 géis kPa (169,6 ± 30,5 uM

2 e 0,9 ± 0,2), respectivamente, bem como os de células únicas que exibem R não há contactos célula-célula (Fig. 1e e 1 h). Em 5 kPa, 10 kPa e 15 géis kPa, a área da célula e fator de forma do HCT-8 células individuais R ilhas no interior são 156,2 ± 52,3 mm

2 e 0,8 ± 0,1, 142,8 ± 47,2 mm

2 e 0,9 ± 0,0 e 160,7 ± 33,4 mm

2 e 0,8 ± 0,2, respectivamente. Este fenótipo única persiste mesmo depois que as células R são cultivadas em substratos de poliestireno muito duras (3 GPa) para tempos de cultivo prolongados (meses); novamente sugerindo adesão célula-célula fraca entre as células R. Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que, durante ou depois da transição E-a-R, R células adquirem autonomia celular que é caracterizada por célula-célula marcadamente reduzida e contactos de células adesivas-substrato.

3. R células têm actividade reduzida adesiva célula-célula homotípica

Além estimar a adesão célula-célula qualitativamente com base nas suas morfologias de contacto, utilizou-se ainda mais o ensaio contador Coulter para estudar quantitativamente a perda funcional de célula-célula HCT-8 adesão seguinte transição E-to-R. O contador Coulter mede a velocidade e o grau de adesão celular por quantificação da redução do número de células individuais em suspensão como agregados celulares formar como uma função do tempo de [1], [29], [30]. A cinética de adesão célula-célula homotípica específica para as células HCT-8 E e R epiteliais cancerosas foram medidas e comparadas. células epiteliais normais (não canceroso) MA104 foram usadas como controlo. Descobrimos que HCT-8 células R dissociados (colhidas a partir de 21 substratos kPa PA) exibiu uma taxa marcadamente inferior e extensão da adesão célula-célula, em comparação com os HCT-8 células E originais cultivadas em substratos de poliestireno rígido (Fig. 2). Estudos anteriores demonstraram que após 120 minutos de incubação, 84,8 ± 4,0% das células R HCT-8 permaneceu como células únicas, em contraste com 37,6 ± 6,1% de células E HCT-8 originais e 5,2 ± 0,7% de células MA104 normais [1]. Este resultado notável indica fortemente que a actividade adesiva célula-célula de HCT-8 células R é quase completamente perdida depois de desassociar de ilhas de células E. Este resultado é consistente com a nossa descoberta de reduzida expressão de E-caderina nas células R [1], [24]. A redução da adesividade da superfície celular também foi observado quando as forças de aderência não-específicas entre HCT-8 e superfícies de SiO sondas Bio-MEMS

2-revestidos foram medidos.

(a) Comparação da adesão célula-célula taxas de células HCT-8 e originais (não expostos a 21 géis kPa PA), dissociado HCT-8 células R colhidas a partir de 21 géis kPa PA e células epiteliais MA104 não-cancerosas normais. células HCT8 R têm o menor adesão célula-célula. Cada ponto de dados é composto por 3 duplicatas, e cada duplicado é composto por 5 × 10

5 células dos respectivos tipos de células.

4. mudanças celular rigidez refletir a

mecanosensibilidade

Além de substrato alterações na morfologia celular dependente de rigidez, as células HCT-8 E também mostrou variada celular rigidez dependente rigidez substrato de cultura. Usando microscopia de força atômica (AFM), a rigidez da célula de HCT-8 células E cultivadas em substratos rigidez de gradiente é determinado pelo recuo usando vigas de silício-nitreto com uma constante de 148,14 PN /nm mola (com velocidade de recuo celular consistente 0,1 um /seg). teoria Hertz (ver Materiais e Métodos) foi usado para extrair o módulo de elasticidade das células recuadas. Para facilitar a comparação entre diferentes células na mesma rigidez substrato, nós designado 5 regiões iguais de espaço em toda a gama de rigidez, com a região 1 que mede a rigidez de 1-4 kPa, regiões 5 com rigidez 5-8 kPa, 9-12 kPa , 13-16 kPa, 17-20 kPa, respectivamente (Fig. 3a). Usando AFM, encontramos células HCT-8 e aumentar a sua rigidez de células como os substratos tornar-se mais rígida. Da região 1 para a região 5, HCT-8 células E rigidez progressivamente aumentaram de 1,4 ± 0,9 kPa a 1,9 ± 0,8 kPa, a 2,1 ± 1,4 kPa, a 2,2 ± 1,3 kPa, e de 3,8 ± 2,0 kPa, respectivamente (n = 6 ~ 10 para cada região; a Fig. 3b). Em particular, é importante notar que o gradiente de aumento de rigidez da célula (Fig. 3a) parece coincidir com o gradiente de aumento de rigidez do substrato de gel. Estes resultados são consistentes com os relatados anteriormente [25], e sugere que as células HCT-8 e são altamente sensíveis às variações do delicado dos seus sinais mecânicos microambiente. A rigidez de HCT-8 R células; No entanto, em todos os diferentes substratos de rigidez, aparece invariante a 0,5 ± 0,4 kPa, o que indica que as células de P tem uma muito limitada ou nenhuma interacção com o seu microambiente mecânica. O estudo AFM também indicou que as células R são mecanicamente mais suave do que as células E, que potencialmente podem melhorar a sua maleabilidade para permitir a invasão mais eficiente de tecidos alvo seguinte

in vivo

metástase.

Usando Microscopia de Força Atômica , a rigidez das células HCT-8 e cultivadas sobre o substrato de gradiente são determinadas. As células HCT-8 E aumentar a sua rigidez de células como os substratos tornar-se mais rígida. Para facilitar a comparação entre diferentes células na mesma rigidez do substrato, cinco regiões de igual espaçadas em toda a gama rigidez são designadas: a região 1 abrange 1-4 kPa, a região 2 abrange 5-8 kPa, região 3 abrange 9-12 kPa, região 4 cobre 13-16 kPa, e a região 5 abrange 17-20 kPa. (A) A partir de uma região para região 5, a rigidez de células E aumenta progressivamente com valores de 1,42 ± 0,85 kPa a 1,90 ± 0,77 kPa, 2,06 ± 1,39 kPa, 2,15 ± 1,28 kPa e 3,82 kPa ± 1,98, respectivamente. Em contraste, em substratos de gel com gradiente mesma rigidez, as células R pós-metastáticos mostrar rigidez celular quase invariável. (B) de contraste de fase imagens de HCT-8 células E em substratos PA inclinação.

5. ilhas de células E mostram elevada aderência não específica em relação a células R

A superfície de aderência não-específicos de células HCT-8 (E 4

° dia de cultura em gel de PA) e células de P foram medidos usando um bio-sensor de força MEMS micro fabricado [1] (fig. 4 e Materiais e Métodos), [30], [31]. O sensor consiste num feixe microcantilever com relação força-deslocamento calibrado (ver Materiais e Métodos). Há uma sonda fixa (largura de 15 um e 5 mm de profundidade) ligado ao feixe, a qual faz contacto adesivo com as células (Fig. 4a). O sensor é feito de silício de cristal único, e é revestido com uma camada fina de óxido de silício nativa (SiO

2). A sonda e o sensor não são funcionalizadas. O sensor é manipulado com uma fase piezo X-Y-Z. A sonda plano é posto em contacto com a superfície convexa lateral, ilhas de células E ‘no limite. Cada ilha de células E consiste de 100 s de células com várias células de empilhamento na periferia ilha (Fig. 4b). Após um contacto de 2 minutos, o sensor de força é puxado para fora horizontalmente a partir da ilha célula a uma velocidade constante de 2,1 ± 0,4 um /s (Fig. 4C). O tempo de contato foi escolhido como 2 minutos, uma vez que a duração do contato prolongado pode resultar na deposição celular de ECM na sonda e complicar a análise. Devido à adesão célula-sonda, o feixe do sensor se deforma durante a retracção, isto é, células de aplicar uma força de restabelecimento contra o desprendimento. A duração de contacto curtos entre a célula e da sonda evita que a activação de integrinas celulares e a formação de qualquer adesão focal da sonda (demora 30 minutos, para formar [32], [33]). Assim, as interacções adesivas não específicas só pode ser formada entre a superfície da célula e o

2-revestido sonda SiO.

(a) O sensor de força não-funcionalizado micro fabricado Si com uma sonda e plana com conhecidos relação força-flecha é manipulado por um de alta resolução xyz Piezo-stage entrar em contato com a superfície convexa lateral, ilhas de células ‘(no plano xy). (B) Microscopia Confocal de ilhas de células mostrar a altura de ilhas é da ordem de 30~50 uM. A altura vertical da sonda de bio-MEMS é 5~10 um. (C) Após um contato 2 minutos, sensor de força está na horizontal afastou a uma velocidade constante de 2,1 ± 0,4 mm /s. Enquanto a adesão celular entre a superfície da sonda e celular impede a retracção do sensor, os sensores de feixes de deformar por δ, dando a força F. Note-se que a sonda não é funcionalizado. O contato 2 minutos entre a sonda e células impede a ativação das integrinas celulares ea formação de qualquer adesão focal de células, que leva . 30 minutos para formar

Nós descobrimos que, durante a retração de as ilhas, e-Cell sensor de bio-MEMS esticar localmente por 15-20 um, resultando em uma forma cónica (ver ambos os esquemas da fig. 4c e imagens de contraste de fase na Fig. 5). Note que este estiramento é diferente do que unicamente devido a membrana do tirante, o qual consiste em esticar a única bicamada fosfolipídica. Durante a retracção da sonda, o cone é continuamente esticada com o aumento do ângulo de contacto θ, enquanto que o contacto da célula com a sonda de gotas de uma forma passo a passo (Fig. 5B-5D). O aumento da força entre celular e sonda se reflete no aumento progressivo do fosso entre uma referência fixa e a sonda (de D

0 a D

1 e D

2). força celular é calculado a partir da mudança de abertura e força-deformação de calibração do sensor de mola. A um valor de força crítica, F

C, o cone de repente se desprende da sonda (Fig. 5D-E). Para E-células, F

c é a força máxima nas curvas força-deslocamento. Consideramos F

C como uma medida da adesão celular-sonda. Medimos Fc para 12 tais grupos de células e obteve F

c = 256,3 ± 33,7 nN (n = 12). Experiências semelhantes com as células de I mostram a adesão de células-sonda negligenciável com F

C = 1,14 ± 0,13 nN (n = 25; A Fig. 6). Assim, as células R têm insignificante de adesão não-específica em comparação com células E e, portanto, parecem estar em um estado “lubrificado”, talvez o que lhes permite ser adaptado a passagem por leitos capilares vasculares durante

in vivo

metástase.

(a) intercelular adesivo força de desprendimento de uma ilha celular na sonda MEMS. A força aumenta monotonicamente com estiramento até o descolamento. (B-e) imagens de contraste de fase de um experimento adesão típico. A força é calculada a partir da deformação da haste do sensor

D

e a curva de calibração de força-deformação. A força distanciamento crítico, F

c, é a força máxima nas curvas força-deslocamento. Durante o alongamento, o ângulo de contato θ entre a sonda ea ilha da célula aumenta, mas o tamanho da zona de contacto entre a sonda ea ilha celular continua diminuindo. Barra de escala = 40 um.

(a) força adesiva de células R em sonda MEMS como a sonda é movido longe das células após 2 minutos de contato (n = 25). (estar). imagens de contraste de fase de R células e MEMS sonda quando a adesão não-específica entre eles é medido. A força máxima descolamento medida é 2,5 nN, enquanto a deformação celular é quase imperceptível. Barra de escala:. 40 um

Discussão

Para o nosso conhecimento, o presente estudo é o primeiro a descrever e avaliar a mudança na mecanosensibilidade em células cancerígenas do cólon humano durante uma metástase-like transição produzido por apenas alterando o microambiente mecânica durante

in vitro

cultura. Em um trabalho anterior relatamos células HCT-8 executar uma transição E-to-R em 21~40 substratos kPa rigidez [1]. O presente estudo emprega efetivamente uma abordagem sistema de análise combinatória utilizando substratos rigidez-gradiente, ensaio contador Coulter, de força atômica microscopia (AFM) e sensores de força Bio-MEMS para explorar a mudança mecanosensibilidade quantitativa das células HCT-8 epitelial E carcinoma do cólon humano como eles trânsito para as células de P-forma arredondada. Descobrimos, desencadeada pelas pistas substrato rigidez adequadas, que as células HCT-8 R perdem a sua sensibilidade tanto ao microambiente substrato, bem como a sua interacção com as células vizinhas R e E. Como resultado, as células HCT-8 R adquirir autonomia para a sobrevivência como células independentes de ancoragem, móveis, o que é uma característica essencial dos primeiros eventos de metástases de células de cancro [3], [4], [5], [6], [16], [20], [30], [34], [35].

as propriedades físicas dos substratos de cultura encontram-se amplamente de afectar a expressão de genes e fenótipos de um número de células normais e cancerosos [1], [17], [18], [35], [36], [37], [38], [39], [40], [41], [42], [43], [44 ], [45], [46], [47], [48], [49], [50], [51], [52], [53], [54], [55]. Para responder ao substrato estímulos, as células aderir e espalhar sobre o substrato seguido por detecção e ambos os sinais mecânicos e químicos de processamento [26], [37], [44], [46], [49], [53], [55 ], [56], [57], [58], [59], [60], [61]. Como vimos anteriormente [1], depois de 7 dias de cultura em substratos macios, células HCT-8 passam por um E para transição R caracterizado por R células de dissociação a partir da camada de células epiteliais ou ilhas de células mãe. Estas células R dissociados mostrar aderência extremamente reduzida (específica e não-específica [1], [24], [29]) em comparação com os seus homólogos celulares E. Ao contrário das células de E, as células HCT-8 R dissociadas mostram as interacções célula-substrato independentes substrato rigidez. A sua proliferação não é prejudicada pela fraca ancoragem com o substrato de cultura ou a outras células (Fig. 1). independência Anchorage é uma característica distintiva das células metastáticas [7], [21], [36]. Na verdade, a nossa recente

in vitro

ensaios de invasão das células da membrana basal indicam que as células HCT-8 R são significativamente mais invasiva do que as células E [24].

A nossa descoberta de um E-to-R transição no HCT-8 células do cólon adenocarcimona sugere que substrato adequado suavidade mecânica pode promover ou auxiliar na iniciação dos primeiros eventos em metástase de células cancerígenas, e perda irônica de mecanosensibilidade, o que poderia ajudar na disseminação vascular para locais alvo de tecidos distais. Este estudo revela que as células de cancro do cólon podem atingir essa característica exclusivamente por cultura sobre o substrato apropriadamente macio. Estamos atualmente avaliando se as células R apresentar um comportamento metastático avançado em estudos com animais, em comparação com células E. Se E da transição R correlaciona-se com a aquisição da actividade metastática reforçada, a manipulação mecânica do microambiente pode servir como um atraente

In vitro

modelo para investigar os fenómenos precoces de metástases de células de cancro, bem como para o rastreio de anti-possível agentes terapêuticos metastático.

Materiais e Métodos

1. Cultura celular, imagens de microscopia e preparações geles PA

adenocarcinoma de cólon humano células HCT-8 (ATCC Nº .: CCL-244) foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Gibco No .: 23400-062) suplementado com 2 gramas de de bicarbonato de sódio por litro, dando concentrações finais de soro de cavalo a 10% (Gibco n .: 26050-088), 1 × antibiótico-antimicótico (Gibco No .: 15240-062) e 1 mM de piruvato de sódio (Gibco No .: 11360) [1]. células MA104 (embrionárias de rim de macaco verde Africano) foram obtidos a partir de MA Bioproducts e cultivadas em MEM (Gibco No .: 41500-018) suplementado com 2 gramas de HEPES por litro, 2,2 gramas de bicarbonato de sódio por litro, 1 × antibiótico-antimicótico quanto acima, e soro de bovino fetal a 5% (Gibco No .: 16140). A de fibroblastos de rim de macaco linha celular (MKF) (CV-1, ATCC, Manassas, VA) foi cultivada num meio com 90% de DMEM (ATCC, Manassas, VA), 10% de FBS (ATCC, Manassas, VA) e 1 × antibiótico-antimicótico (Gibco No .: 15240-062). A densidade de células antes do plaqueamento foi contado com hemocitômetro padrão. incubadora de cultura de células padrão foi utilizada para fornecer a condição de cultura com humidade suficiente, a temperatura de 37 ° C, e 5% de CO

2. (1).