Abstract

N-Myc jusante regulada gene 2 (

NDRG2

) é um gene supressor de tumor candidato, que desempenha um papel importante no controle do crescimento tumoral. O objetivo deste estudo foi investigar a expressão de

gene NDRG2

no cancro da bexiga (BC) tecidos e várias linhas celulares de cancro da bexiga, e buscar seu significado clínico e patológico. Noventa e sete por carcinoma da bexiga e 15 secções de tecido da bexiga normais foram analisadas retrospectivamente com imuno-histoquímica. A linha celular de cancro da bexiga humana T24 estava infectado com LEN-

NDRG2

ou LEN-LacZ. Os efeitos da

NDRG2

superexpressão em células T24 e T24 xenotransplantes nua de rato foram medidos através de curvas de crescimento celular, as curvas de crescimento de tumor, análise de fluxo de citometria, western blot e ensaio Transwell.

NDRG2

foi altamente expressa em tecido de bexiga normal, mas ausente ou raramente expressa em tecidos cacinomatous (χ

2 = 8,761, P 0,01). O

NDRG2

nível foi negativamente correlacionada com o grau do tumor e estágio patológico (r = -0,248, p 0,05), bem como aumento do nível c-myc (r = -0,454, p 0,001). A expressão de

NDRG2

foi baixa nas três linhas de células BC. células T24 infectadas com LEN-

NDRG2

mostraram inibição da proliferação de ambos

in vitro

e

in vivo

, e

NDRG2

superexpressão pode inibir o crescimento do tumor e invasão

in vitro

Citation:. Li R, Yu C, Jiang F, Gao L, Li J, Wang Y, et al. (2013) sobre-expressão de N-Myc Downstream-Regulado Gene 2 (NDRG2) Regulamenta a proliferação e invasão das células do cancro de bexiga

In Vitro

e

In Vivo

. PLoS ONE 8 (10): e76689. doi: 10.1371 /journal.pone.0076689

editor: Raffaele A Calogero, Universidade de Torino, Itália |

Recebido: 27 de maio de 2013; Aceito: 26 de agosto de 2013; Publicação: 16 de outubro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Li et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta pesquisa trabalho foi financiado pela National Science Foundation Natural da China (31.070.681). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

A incidência de cancro da bexiga está aumentando. Estima-se que 386,300 novos casos e 150,200 mortes por cancro da bexiga ocorreu em 2008 em todo o mundo [1]. Nos homens, o câncer de bexiga é o quarto câncer mais comum somente após próstata, pulmão e colorretal, representando 7% de todos os casos de câncer nos EUA [2]. Em mais de 75% dos casos, o diagnóstico é feito numa fase precoce da doença (fases Ta e T1). Apesar de ter recebido tratamento adequado, a taxa de sobrevida global de cinco anos para a doença T2 patológica é 52-77%, doença T3 40-64%, e T4 ou linfa doença do nó-positivos 26-44% [3]. Existem intervenções terapêuticas numeral para tratar esta doença; no entanto, a taxa de sobrevida global não melhorou nos últimos vinte anos. Portanto, para estabelecer um novo modo de terapia utilizando agente antioncogene para melhorar a taxa de sobrevivência dos pacientes é altamente desejável.

O N-myc jusante regular o gene 2 (

NDRG2

) pertence à NDRG família, que inclui quatro membros:

NDRG1, NDRG2, NDRG3

e

NDRG4

. A homologia da sequência dentro do ser humano

NDRG

família é 57-65% e

NDRG

família foi investigada em alguns de câncer humano e distúrbios do sistema nervoso [4]. Como um gene para regular a jusante do Myc,

NDRG2

expressão foi confirmado para ser reduzida em muitos tipos de carcinomas, incluindo cancro da tiróide, câncer de fígado, meningioma, o câncer de pâncreas e câncer de próstata [5-11]. Estes estudos sugerem que

NDRG2

pode desempenhar um papel importante no controle da morbidade dos carcinomas. O

NDRG2

foi confirmado para ser envolvido no crescimento e diferenciação celular, por sua vez,

expressão NDRG2

em gliomas de alto grau foi mostrado para associar com a sobrevida [12,13].

(a) os níveis de

NDRG2

diminuição de proteína, enquanto o grau de malignidade dos aumentos de carcinoma da bexiga (x400) (1). tecido de bexiga normal; (2) Bexiga papiloma (T0-Ta); (3) O câncer de Alto Nível da bexiga (T2-T4). (B) Os níveis de proteína aumenta c-myc, enquanto o grau de malignidade de aumentos de carcinoma da bexiga (x400) (4). tecido de bexiga normal; (5) Bexiga papiloma (T0-Ta); (6) O câncer de Alto Nível da bexiga (T2-T4). As seções de (B) (4-6) oriundos dos mesmos blocos de parafina como (A) (1-3), respectivamente.

Apesar de vários estudos têm investigado a função de

NDRG2

em tumores comuns, não houve caracterização funcional do papel potencial dos

gene NDRG2

no cancro da bexiga. Portanto, o objetivo do presente estudo foi investigar o papel da

NDRG2

no cancro da bexiga humana. Primeiro, examinamos a expressão de

NDRG2

em tecidos de carcinoma da bexiga humanos e em comparação com tecidos normais da bexiga por imunoquímica. Verificou-se que o nível de

expressão NDRG2

em tecidos BC foi menor do que em tecidos normais. Em seguida, utilizou-se linhas celulares de cancro da bexiga como modelos para avaliar o efeito de

NDRG2

no crescimento do tumor, diferenciação e invasão

in vitro

e

in vivo

. Nossos resultados sugerem que

NDRG2

tem um papel antioncogenic potencial no cancro da bexiga.

Materiais e Métodos

amostras clínicas

fixado em formalina e parafina-embedded blocos de tecidos de carcinoma da bexiga foram coletadas aleatoriamente de 112 pacientes e controles (idade média de 63,4 anos, variação de 21 a 81 anos) do Departamento de Cirurgia Urológica do Hospital Xijing, FMMU (Xi’an, China) entre 2008 e 2011.These amostras composta por 15 tecidos normais da bexiga, 20 do papiloma da bexiga (T0-Ta), 38 de baixo nível câncer de bexiga (Tis-T1) e 39 amostras de câncer de bexiga de alto nível (T2-T4). Foi obtido consentimento escrito de cada indivíduo. Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Xijing Hospital, Xi’an, China Ética.

(A) em tempo real análise de PCR de

NDRG2

expressão de mRNA. nível (B) Expressão de

NDRG2

proteína tal como ensaiado por western blot. Todos os ensaios foram repetidos de forma independente, pelo menos, três vezes. Os resultados são apresentados como a média ± SD (** p 0,001) ..

imuno-histoquímica (SP: estreptavidina-perosidase)

Mouse anti-humana

NDRG2

anticorpo monoclonal e o anticorpo monoclonal de c-Myc foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology Company (Santa Cruz, EUA.). O kit imuno-histoquímica foi adquirido da Boster Company (Wuhan, China). A coloração imuno-histoquímica foi realizada de acordo com as instruções do fabricante. As seguintes preparações foram feitas a partir de cada bloco de tecido:. Uma lâmina corada com HE (o estágio patológico foram verificados por patologistas), um slide incubadas com anti-

NDRG2

anticorpo, um slide incubadas com anticorpo c-myc

a fim de determinar com precisão a expressão positiva e minimizar a taxa de falso-positivo, foram utilizados dois arbitory sistema de pontuação semi-quantitativa para avaliar a extensão e intensidade da coloração por três patologistas de forma independente. As pontuações foram definidas como se segue: (1) o grau de pontuação coloração: 0 ponto para a coloração de 5%, um ponto para a coloração de 6% a 25%, 2 pontos para a coloração de 26% a 50%, 3 pontos para a coloração 51 % a 75%, e 4 pontos para a coloração de 75% (2). A intensidade da coloração de pontuação: 0 ponto para a coloração negativa, 1 ponto para a coloração fracamente positivo, 2 pontos para coloração moderada e 3 pontos para coloração forte (tan). Para cada amostra, os resultados derivados dos dois sistemas de pontuação foram multiplicados. Os resultados da determinação foram divididos em quatro níveis: negativo (0 a 1, -), fracamente positivo (2 a 4, +), positivo (5 a 8, + +), fortemente positiva (9 a 12, + + +) . A visualização foi realizada através de microscopia de luz (Olympus, Nagano, no Japão) e calculada com a análise estatística.

Cultura celular

T24 humano seleccionado, 5637 e BIU-87 linhas de células a ser utilizado na inquérito. Estas linhas celulares foram previamente confirmada como as linhas celulares adequadas para a pesquisa de cancro da bexiga. Como controle normal, nós escolhemos células da bexiga humana (SV-HUC-1). Todas as linhas celulares foram adquiridos a partir do Cell Bank, da Academia Chinesa de Ciências, Shanghai, China. As células foram cultivadas em RPMI1640 (Gibco) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (Sijiqing Hangzhou, China). Todas as linhas celulares foram cultivadas em condições estéreis a 37 ° C e 5% de CO

2.

(A) Detecção de eficiência de infecção de lentivírus, e contraste de fase (à esquerda) ou GFP (direita) foram imagens obtidos quatro dias após a infecção. (B) em tempo real A análise de PCR de

NDRG2

expressão de ARNm em células T24. (C) Análise de Western blot de

NDRG2

expressão da proteína. Os resultados são apresentados como a média ± DP (** p 0,01) ..

-PCR quantitativo em tempo real

O ARN total foi extraído a partir de células utilizando o reagente TRIzol (Takara bio, Japão) e reversamente transcrito utilizando M-MLV da Transcriptase reversa (Fermentas) de acordo com as instruções do fabricante. Os iniciadores utilizados foram os seguintes: GAPDH, 5′-AGGTCCACCACTGACACGTT-3 ‘e 5′-GCCTCAAGATCATCAGCAAT-3’;

NDRG2

, 5′-GCCCAGCGATCCTTACCTACC-3 ‘e 5′-GGCTGCCCAATCCATCCAACC-3’. O programa de amplificação consistiu de activação da polimerase a 95 ° C durante 30 segundos e 40 ciclos de desnaturação a 95 ° C durante 15 segundos, emparelhamento e extensão a 59 ° C durante 30 segundos. Os níveis de expressão relativos foram normalizados utilizando o ciclo limiar comparativa (2

-ΔΔCt). O PCR em tempo real realizado usando o sistema de CFX96 toque de PCR (Bio-Rad). Todas as experiências acima mencionadas foram repetidas pelo menos três vezes.

Western Blotting Análise

Todas as células foram recolhidas na fase exponencial e, em seguida, a proteína total foi extraída com tampão de lise contendo 1% de Tween 20, e finalmente quantificada com ensaio BCA. Uma quantidade igual de proteínas de 20 ug foram sujeitos a 10% de concentração de SDS-PAGE. As proteínas separadas por SDS-PAGE nos geles foram transferidas para nitrocelulose (NC) (Amersham membranas, St Giles, Reino Unido). Subsequentemente, as membranas de NC foram bloqueadas com 5% de leite desnatado durante 1 hora à temperatura ambiente e depois incubadas com anti-ratinho humano

NDRG2

anticorpo (1: 800) (Santa Cruz, EUA) durante a noite a 4 ° C. detecção de proteína GAPDH foi usada como um controlo interno. Depois de se lavar três vezes, as manchas transferidas contendo

NDRG2

bandas foram visualizadas com peroxidase de rábano (HRP) -conjugated anti-murganho ou anticorpo anti-coelho secundário (diluição 1: 2000, Santa Cruz) durante 2 h a temperatura do quarto. Os reforçada quimioluminescência (ECL) soluções de detecção do sistema (Pierce, NJ) foram então aplicadas, e quantificada por software Kodak Digital Ciência ID (Kodak, NY).

Lentivírus Infecção

Para produzir lentivírus, células 293T foram co-transfectadas com plen-GFP

NDRG2

ou plen-GFP-lacz, que foram amplificados em

e. coli DH5

, purificados utilizando um kit Plasmid Maxi (Qiagen, Valencia, CA) e transfectado para células 293T confluente de 70%, utilizando lipofectamina 2000 (Invitrogen). partículas lentivirais foram recolhidas a partir do sobrenadante 72 horas após a transfecção e purificado por ultracentrifugação. Estas partículas foram doravante referida como LEN-

NDRG2

, e LEN-Lacz (controle negativo). células T24 estavelmente infectadas foram seleccionadas utilizando blasticidina, por contagem das células verdes -positivas proteína fluorescente (GFP) sob microscopia de fluorescência (Olympus, Japão), aplicado na concentração mínima de blasticidina, após uma série de titulação, necessária para matar células não infectadas T24. A linha celular foi dividido nas seguintes três grupos experimentais: células 1)

NDRG2

grupo (LEN-

NDRG2

células infectados), 2) Grupo Lacz (LEN-Lacz-infectados), e 3) (células não infectadas grupo CON). Ambos PCR em tempo real e Western blot confirmou que infectou com sucesso células T24 com o lentivírus e superexpressão de

infecção NDRG2

corretamente depois. Nós também verificada a expressão diferencial de proteínas que se correlacionaram com a fase do ciclo celular, apoptose e migração celular e invasão (proteína do ciclo celular: cyclinD1, CDK4; proteína apoptose celular: p21, a migração de células e proteínas invasão: MMP-2 e MMP-9) .

de inibição

Crescimento celular testes

in Vitro

Este teste incluiu ensaios MTT, ensaios de formação de colónias e análise de fluxo de citometria (FCA) (BD Biosciences, NJ). Cada ensaio foi aplicada a cada um dos três grupos (o controlo em branco; LEN-LacZ, o controlo negativo; e LEN-

NDRG2

, o grupo experimental). As experiências foram repetidas cinco vezes (1). ensaio MTT: Todas as células, incluindo os infectados, foram cultivadas em fase exponencial e isolada por tratamento com tripsina. As células viáveis ​​(2000 células /ml) foram inoculadas em placas de 96 poços e cada grupo tinha seis poços reduplicativa. Em diferentes pontos de tempo, o MTT foram adicionados 20 ul /poço (5 mg /ml) e incubou-se a 37 ° C durante 4 h. A reacção foi parada pela adição de 150 ul de dimetilsulfóxido (DMSO), seguido por agitação durante 10 min. Os valores de absorvância (A) foram medidos com um medidor de escala enzima autocinético (Bio-Rad, EUA) a 490 nm de comprimento de onda. As curvas de crescimento celular, em seguida, foram então desenhada com base nos valores médios de A (2). a formação de colónias de ensaio: As células foram semeadas em placas de seis -bem (200 células /poço) (em três poços em duplicado) e cultivadas a 37 ° C em 5% de CO

2. Após duas semanas, as células foram fixadas com metanol durante 20 min e em seguida coradas com Giemsa, durante 20 min. DDH

2O foi usada para lavar as células três vezes para se obter um fundo limpo. O número de colónias e o número de células em cada colónia foram contados e analisados ​​estatisticamente (3). células T24 (1 x 10

6 células /poço) foram plaqueadas em poços de seis placas de cultura com lentivírus infectados LEN-

NDRG2

: FCA. Três grupos de células foram recolhidos após 48 h e 72 h, respectivamente, e finalmente centrifugadas e fixadas em etanol a 95%. Após incubação durante a noite a 4 ° C, as células foram coradas com 0,5% propidiumiodide (10 uL) na presença de 0,01% de RNase A e 0,1% de Triton X-100, em seguida foram medidos com um citómetro de fluxo.

(A e B) ensaio de formação de colónias. Regulação positiva de

NDRG2

inibe a formação de colónia. (C) As curvas de crescimento de células T24 de células pelo método de MTT. Todos os ensaios foram repetidos de forma independente, pelo menos, três vezes. Os resultados são apresentados como a média ± DP (* = p 0,001).

migração e invasão Ensaios

ensaio de invasão com um ensaio de membrana e migração de Matrigel-revestido sem Matrigel membrana foram realizadas utilizando um Transwell-24 bem inserções (filtros de poros 8um, BD Biosciences, Bedford, MA), que foram realizados de acordo com as instruções do fabricante. As células em fase exponencial foram colhidas e ressuspensas (2 × 10

5 células /mL) em meio isento de soro, em seguida semeado e ressuspensas em meio de cultura 200 ul na câmara superior. Em seguida, o meio de cultura com 20% de FBS foi colocada no fundo do poço. O Transwell foram incubadas a 37 ° C e 5% de CO

2 ambiente durante a noite. As células T24 foram deixadas migrar através de uma porosa para a parte inferior da membrana. Após a incubação, as células na parte inferior da membrana foram fixadas com metanol durante 5 minutos e, em seguida, coradas com Kristallviolet. O número de invadir células ou a migração de células foi determinado por microscópio com uma ampliação de 400x em cada membrana e calculado o número médio de células por campo. Todos os ensaios foram repetidos pelo menos três vezes de forma independente.

Crescimento Ensaios de Inibição

In Vivo

masculinos seis semanas de idade ratos nus BALB /c foram adquiridos a partir de Xangai Experimental Centro animal, Shanghai, China. O NDRG2 LEN-

grupo e células grupo LEN-LacZ foram colhidas e ressuspensas em 1 x PBS e a concentração foi ajustada a 5 x 10

7 por ml, solução de 200 ul de células (1 x 10

7 células) foram injectados subcutaneamente nos flancos da esquerda dos ratinhos nus. Os ratos foram divididos aleatoriamente em dois grupos: LEN-

NDRG2 Comprar e LEN-LacZ (n = 5 por grupo). Quando o tamanho médio dos tumores inoculados atingiu 300 mm

3 (conforme calculado pela equação: V [mm

3] = AB

2/2)

In vivo

, a murganhos foram sacrificados por espécimes de deslocamento e de tumores cervicais foram colhidas, fotografados e medidos para os seus volumes e peso. Os ratos foram anatomized para verificar se houve metástase para outros órgãos e linfonodo. A expressão de

NDRG2

proteína nos tumores inoculados de ratinhos nus foi detectado por Western blot. Outros marcadores para a expressão da proteína foi também medida, incluindo proteínas do ciclo celular: cyclinD1, CDK4; proteína apoptose celular: p21; migração celular e proteína invasão:. MMP-2, MMP-9

(A) T24cells infectado com LEN-

NDRG2

lentivírus eram mais obviamente preso em G0 /G1cycle. (B) as percentagens de células apoptóticas em LEN-

NDRG2

grupos foram maiores do que nos outros dois grupos (1-3). 48 h após a infecção (4-6); 72 h após a infecção; (1 e 4) branco de controlo (PBS); (2 e 5) LEN-LacZ; (3 e 6) LEN-

NDRG2

. Todos os ensaios foram repetidos de forma independente, pelo menos, três vezes. Os resultados são apresentados como a média ± SD

Grupo

NDRG2. (-)

NDRG2 (+)

X

2

valor

valor p

normal tissue312Bladder carcinoma59388.761 . 0.01Table 1. A expressão de NDRG2 no tecido da bexiga e da bexiga tecidos normais carcinoma

CSV Baixar CSV Análise

estatística

As análises estatísticas foram realizadas utilizando software SPSS17.0 (empresa SPSS, IN). Todos os dados estão representados como a média ± erro padrão derivada de pelo menos três experiências independentes. Para imunohistoquímica, diferenças entre os grupos foram validados utilizando testes de qui-quadrado e correlação de Pearson. A análise de variância (ANOVA), Student-Newman-Keuls (SNK) testes e teste não-paramétrico foram realizados para determinar se havia diferenças entre os resultados dos ensaios de

in vitro

e

in vivo

ensaios. A

P

-valor foram considerados estatisticamente significativos menor que 0,05.

Resultados

A frequência de expressão positiva da

NDRG2

em tecidos de carcinoma da bexiga foi 39,17 % (38/97), o qual foi menor do que nos tecidos normais da bexiga (80%, 12/15), (χ

2 = 8,761,

P

0,01) (Tabela 1).

expressão NDRG2

, freqüência e níveis, não foi correlacionada com sexo ou idade, mas foi inversamente correlacionada com o estádio patológico (r = -0,248,

P Art 0,05) (Tabela 2) . A imuno-histoquímica mostrou que

NDRG2

proteína positivo foi a coloração no citoplasma dos tecidos normais e carcinoma da bexiga (Figura 1A). Os níveis de

expressão NDRG2

no carcinoma da bexiga foram inversamente correlacionado com c-Myc no carcinoma da bexiga (r = -0,454,

P Art 0,001). (Figura 1B)

(A) O efeito da

NDRG2

superexpressão no ciclo celular G1 e apoptose reguladores como ensaiado por western blot. (B) A quantificação relativa da expressão da proteína, normalizados para níveis de GAPDH. A figura mostra a tendência de cada grupo, tal como indicado. Todos os ensaios foram repetidos de forma independente, pelo menos, três vezes. Os resultados são apresentados como a média ± SD (** p 0,01) ..

clinico-patológica

nível de expressão de NDRG2

r-valor

p-valor

Características

– +

++

+++

Sexo Masculino 401173Female 1912500.320.759Age ≤60years231061 60 anos 361362- 0.0490.637Grade Papilloma10442Low22961High271020-0.2480.014Table 2. a relação entre a expressão de características NDRG2 e carcinoma da bexiga.

os dados são apresentados como o n (número de amostras). A significância estatística foi avaliada com o teste de coeficiente de correlação de Pearson. CSV Baixar CSV

Ambos western blot e PCR em tempo real mostrou que todas as três linhas celulares BC tinham níveis mais baixos de

expressão NDRG2

proteína e mRNA do que as células da bexiga humanos normais (SV-HUC-1). Entre as três linhas celulares BC, as células T24 apresentaram os menores níveis de expressão (Figura 2A, B).

(A) Análise da invasão de células T24 tratados com LEN-

NDRG2

. A capacidade de invasão foi estimada utilizando Transwell revestido com Matrigel. A invasão de LEN-

NDRG2

células do grupo foi significativamente menor do que nos outros dois grupos. ** P 0,001. (B) Análise de migração de células T24 tratados com LEN-

NDRG2

. A capacidade de migração foi estimada utilizando Transwell não revestido com Matrigel. A capacidade de migração de LEN-

NDRG2

células do grupo foi significativamente menor do que nos outros dois grupos. ** P 0,001. (C e D) expressão de MMP-2 e MMP-9 foram medidos após as células T24 foram infectadas com LEN-

NDRG2

. LEN-

NDRG2

reduzido grupo MMP-2 e MMP-9 expressão em comparação com os outros grupos (** p 0.01).

Group

G0/G1

G2/M

S

Apoptosis

Control48h62.42±2.053.55±0.5534.03±1.655.53±0.6272h69.84±2.602.79±0.4427.73±0.905.57±0.59LEN-LacZ 48h48h64.24±1.923.56±0.5632.21±0.666.49±1.2572h69.63±2.403.08±0.4027.29±0.616.52±1.17LEN-NDRG2 48h48h71.40 ± 0.378.50 ± 0.4720.10 ± 0.3010.25 ± 2.4372h77.61 ± 0.997.05 ± 0.1515.34 ± 0.1712.88 ± 3.01Table 3. A proporção de fase do ciclo celular e apoptose celular induzida por LEN- NDRG2 em células T24.

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(a) LEN-

NDRG2

suprimiu o crescimento de tumores em comparação com LEN-LacZ. Além do crescimento do tumor sem supressão, o grupo LacZ foi LEN- encontrado para ter metástases linfáticas. (B) curvas de crescimento do tumor. (C) Rácios de massas tumorais para massas de rato em diferentes grupos. (D) massas de tumores em dois grupos. as curvas e histogramas foram desenhados com base nos valores médios ( . n = 5) em dois grupos os resultados são apresentados como a média ± DP (*, ** p . 0,001)

foi demonstrado por microscopia de fluorescência que a eficiência da infecção foi alta sendo mais de 95% (Figura 3A). a análise por PCR em tempo real mostraram que os níveis de expressão de ARNm de

NDRG2

na LEN-

NDRG2

grupo foi significativamente mais elevada do que na LEN-lacZ (grupo negativo) e grupos CON (

P

0,05) (Figura 3B). A análise Western blot mostrou que a

NDRG2

nível de proteína no LEN-

NDRG2

grupo era mais elevada do que nos grupos CON (Figura 3C) LEN-LacZ e. O LEN-

NDRG2

também causou a superexpressão de

NDRG2

em células T24. A formação de curvas de crescimento de células e de colónias mostrou que a sobre-expressão de

NDRG2

poderia suprimir o crescimento de células T24 de mais do que nos outros dois grupos. Nos ensaios de curvas de crescimento celular, a inibição começou no terceiro dia e tornou-se obviamente mais posteriormente (F≥44.58,

P

0,01) (Figura 4). A FCA mostraram que as células T24 com LEN-

NDRG2

poderia aumentar a proporção de células em G

0 /G

1 em comparação com os grupos LEN-LacZ e controle negativo, indicando que o ovexpression de

NDRG2

tinha feito as células T24 para prender no ciclo G1 (48 h: F = 41,92,

P Art 0,01; 72 h: F = 24.11,

P

0,01). (Figura 5, Tabela 3.) O Western blot mostrou que a sobre-expressão de

NDRG2

downregulated CDK4 e cyclinD1, enquanto p21 regulam positivamente em células T24 (Figura 6a, b).

(A) O efeito de

NDRG2

sobreexpressão no ciclo celular, apoptose e metástases reguladores tal como ensaiado por western blot. (B) A quantificação relativa da expressão da proteína, normalizados para níveis de GAPDH. As transferências de Western foram analisadas com o software Kodak Digital Science unidimensional. A figura mostra a tendência de cada grupo, tal como indicado. Todos os ensaios foram repetidos de forma independente, pelo menos, três vezes. Os resultados são apresentados como a média ± DP (* p 0,01).

ensaios de migração Transwell e ensaios de invasão de Matrigel Transwell revestidas foram realizados com células T24. As micrografias representativas foram tomadas a partir da superfície inferior do filtro Transwell, e as células que migraram ou invadidas foram coradas com Kristallviolet. Como mostrado na Figura 7A, o potencial invasivo, que é determinada pela capacidade das células para invadir uma barreira de Matrigel, foi também consideravelmente suprimida em

NDRG2

células (-overexpressing

P

0,01 ). Além disso, forçado expressão de

NDRG2

em células T24 suprimiu significativamente a sua migração através da Transwell (P 0,01). (Figura 7B)

Em ensaios de western blot, em comparação com o LEN-Lacz grupo e controlos em branco, o grupo de LEN-

NDRG2

pode suprimir a MMP-2, MMP-9 nível de expressão da proteína em células T24 (Figura 7C e D). MMP-2 e MMP-9 foram altamente expresso na metástase do cancro de bexiga, de modo que o

NDRG2

provável inibiu a metástase do cancro da bexiga através da regulação da expressão de MMP-2 e MMP-9.

as curvas de crescimento do tumor foi estabelecida através da medição do tamanho dos tumores. Todos os ratos pelados sobreviveram após injeções com lentivírus. As células T24 foram injectados 2 semanas mais tarde, o volume do tumor de dois grupos começaram a aparecer de forma diferente. A partir de três semanas, a diferença do volume do tumor começou a mostrar estatística significativa (F≥31.65, p 0,001) (Figura 8B). Em comparação com o grupo LEN-LacZ, o peso do tumor por LEN-

NDRG2

foi significativamente mais leve (F≥39.82, p 0,001) (Figura 8D). A razão entre o peso do tumor de peso do rato indicaram que a condição física dos ratinhos em LEN-

NDRG2

grupo foi muito melhor do que a dos ratos no grupo LEN-LacZ (f = 39,81, p 0,001) (Figura 8C), o que indica que a sobre-expressão de

NDRG2

poderia suprimir o crescimento de tumores. Após anatomizing os ratinhos, linfa ipsilateral metástases foram mostradas no grupo LacZ-LEN, mas há outros órgãos foram envolvidos; no entanto, no NDRG2 LEN-

grupo sem qualquer lesão metastática foi encontrada (Figura 8A). Western blot mostraram que o

NDRG2

proteína foi regulada nos tumores de LEN-

grupo NDRG2, e que a superexpressão de

NDRG2

subregulado cyclinD1, CDK4, MMP-2, MMP-9; e p21 upregulated

in vivo

(Figura 9A, B).

Discussão

Aproximadamente 75% de todos os doentes com cancro da bexiga reincidência nos primeiros 5 anos [14], este alta taxa de recorrência de cancro da bexiga e do seu potencial metastático significativa fizeram cuidado e prognóstico dos pacientes impugnável. Portanto, para aumentar a taxa de diagnóstico precoce e também para estabelecer novas abordagens terapêuticas são urgentemente necessários por meio de pesquisa de câncer de bexiga.

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é um gene supressor de tumor candidato, e uma série de estudos confirmaram que ela desempenha um papel importante na proliferação celular, apoptose e metástase [15,16]. Os resultados do presente estudo obtido a partir de cancro da bexiga apoiar estas conclusões iniciais.

Nós demonstramos que

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desempenha um papel importante no cancro da bexiga que é semelhante ao seu papel em outros tumores malignos. Resultados Imuno-histoquímica mostrou que o nível de expressão positiva de

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em tecidos de carcinoma de bexiga foi significativamente menor do que nos tecidos normais da bexiga. Os níveis de expressão de

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diminuiu à medida que o grau de malignidade de carcinoma da bexiga aumentou. Descobrimos também que a expressão de

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foi inversamente correlacionada com c-Myc, semelhante ao observado em outras células tumorais. Enquanto isso, o

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níveis de expressão em linhas celulares de cancro da bexiga (T24, 5637 e BIU-87) foram inferiores a linha de células de bexiga normal (SV-HUC-1).

Os lentivírus têm sido demonstrou ser adequado para a terapia de genes, porque podem estabilizar integrar-se no genoma do hospedeiro para proporcionar a expressão a longo prazo do gene alvo, em adição, os lentivírus foram confirmados para ser progressivamente segura pelo desenvolvimento de sistemas plasmídicos parciais para produção de vector para impedir a geração do vírus da replicação competente [17].

as investigações realizadas por Liu et al. indicou que

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foi um novo gene alvo, que é regulada por p53 e

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níveis de mRNA e proteína pode ser sobre-regulada de um modo dependente da p53. E eles relataram, ainda, que o silenciamento de

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atenua apoptose mediada por p53 [18]. Enquanto isso, foi relatado que o

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poderia up-regular a expressão de p53 em células de câncer de mama [19]. Estes dados sugerem fortemente que o

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foi um fator importante na regulação da apoptose de células tumorais. Enquanto isso, o CDC20 foi regulado por p53 para inibir as células cancerosas malignas crescer [20]. A ciclina D1 desempenha um papel importante no ciclo da célula, liga-se a cinases dependentes de ciclina (CDK4 /6), e promove a fosforilação de RB1, orquestrar a progressão através do ponto de restrição G1 [21].

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pode regular a expressão de proteínas (p21, cyclinD1 e CDK4) em células de câncer de bexiga através de up-regulação da p53. Usamos mediada por lentivírus

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estratégia superexpressão para inibir a proliferação de células T24, para promover sua apoptose ambos

in vitro

e

in vivo

; Este mecanismo foi demostracted através da regulação da expressão das proteínas p21, CDK4 e cyclinD1, que são importantes na apoptose e ciclo celular.

Recentemente, vários relatórios sugerem que

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pode desempenhar um papel vital na inibição da metástase do tumor. Relata-se que

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poderia antagonizar a transformação do crescimento invasão de células tumorais mediada por factorβ1 especificamente por regulação negativa da expressão da metaloproteinase de matriz 2 e laminina 332 componentes da via, com supressão concomitante de actividade de GTPase Rho em carcinomas hepatocelulares [22 ]. A MMP-2 e MMP-9 foram alta expressão no cancro da bexiga músculo-invasivo e cancro da bexiga metastático [21,23]. Neste estudo, o ensaio de Western Blot demonstrou que LEN-

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em células T24 foi associada com uma redução significativa na expressão de MMP-9 e ligeiramente reduzida de MMP-2 sugerindo que a expressão

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-overexpression pode regular a expressão de MMP-2 e MMP-9 e inibir a capacidade de invasão de células cancerosas da bexiga metastáticas. Esta conclusão foi apoiada por ambos

in vivo

e

in vitro

ensaios. Nós suspeitamos que a expressão de

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significativamente suprime o MMP-2 e MMP-9, regulando a sinalização de NF-kB nas células de cancro da bexiga [24].

Em conclusão, temos demonstrou o papel antioncogenic de

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no desenvolvimento e na invasão de cancro da bexiga. Desde

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está implicada em muitos aspectos da progressão do tumor, incluindo o crescimento celular, regulação do ciclo celular, invasão e migração, ele representa um alvo terapêutico promissor para o cancro da bexiga. No entanto, mais investigações ainda são necessários para elucidar o mecanismo de

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. As pesquisas nesta direção irá, finalmente, proporcionar novos métodos para o diagnóstico precoce, o romance terapia e monitor de pós-operatório de câncer de bexiga.