Abstract

O carcinoma hepatocelular (HCC) é a terceira principal causa de mortalidade relacionada ao câncer em todo o mundo. práticas padrão atual para o tratamento da HCC são menos do que satisfatório por causa de células-tronco cancerosas (CSCs) mediada por recorrência pós-cirúrgica. Por esta razão, tendo como alvo os CSCs ou as células de cancro com propriedades CSCs-tornou-se como uma nova abordagem para o tratamento da HCC. ABL exibe efeitos anti-tumorais em que atenua a proliferação, migração, invasão, angiogénese e de células cancerosas humanas. No entanto, as funções de GLA na regulação das propriedades CSCs-como em células de carcinoma hepatocelular, e os mecanismos moleculares subjacentes permanecem obscuros. Aqui verificou-se que as propriedades atenuadas GLA-CSCs como por microRNA-148a (miR-148a) a inibição mediada do factor de crescimento transformante beta (TGF-β) /Smad2 via de sinal em linhas celulares de carcinoma hepatocelular (HepG2, Huh-7, e MHCC97H). Com efeito, o GLA inibiu as activações /manifestações de ambos TGFp-induzida e a Smad2 endógena. Além disso, o GLA melhorou a expressão de miR-148a de um modo dose /tempo-dependente. MiR-148a, que visava a

Smad2

-3’UTR, diminuiu a expressão e função de Smad2. Knockdown de miR-148a aboliu a inibição induzida por ABL de TGF-β /via de sinal e as propriedades de Smad2-CSCs como em células de carcinoma hepatocelular. Nosso estudo descobriu um novo mecanismo que GLA inibe as propriedades CSCs-como de células de carcinoma hepatocelular por inibição miR-148a mediada por TGF-β /via de sinal Smad2, o que pode ajudar a identificar potenciais alvos para as terapias de HCC.

Citation: Jiang F, Mu J, Wang X, Ye X, Si L, Ning S, et al. (2014) O repressiva Efeito do miR-148a em TGF beta-SMADs Signal Caminho está envolvido na Glabridin-induziu a inibição das células-tronco do câncer Como Propriedades em células de carcinoma hepatocelular. PLoS ONE 9 (5): e96698. doi: 10.1371 /journal.pone.0096698

editor: Lian-Yue Yang, Xiangya Hospital da Universidade Central do Sul, China

Recebido: 02 de janeiro de 2014; Aceito: 10 de abril de 2014; Publicado em: 07 de maio de 2014

Direitos de autor: © 2014 Jiang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela National Science Foundation Natural da China (81171987, 30972507) e um projecto financiado pela Prioridade Academic Programa de Desenvolvimento das Instituições de Ensino Superior Jiangsu (PAPD). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o carcinoma hepatocelular (HCC) é o tumor maligno do fígado mais comum ea terceira principal causa de mortalidade relacionada ao câncer em todo o mundo [1]. práticas padrão atual para o tratamento da HCC, a ressecção cirúrgica e quimioterapia são menos do que satisfatório por causa da metástase e pós-cirúrgica recorrência [1]. Um conceito proposto para explicar as características dos tecidos neoplásicos é a existência de células auto-renovação, Caule-like, chamadas células-tronco cancerosas (CSCs) [2]. CSCs foram identificadas em vários cancros humanos, incluindo carcinoma hepatocelular. Dentro de um tumor, CCC, que constituem uma pequena porção de células neoplásicas, são definidas pela sua capacidade para produzir novos tumores [3]. Por esta razão, tendo como alvo as células cancerosas com propriedades CSCs-como tornou-se o novo caminho para o tratamento de cânceres de fígado humano.

A raiz do

glycyrrhiza glabra

(alcaçuz) tem sido utilizado para muitos séculos na Ásia e Europa como um antioxidante, antídoto, demulcente, expectorante e um remédio para a inflamação alérgica, bem como um agente aromatizante e edulcorante [4]. Glabridin [GLA, (

R

) -4- (3, 4-di-hidro-8, 8-dimetil) -2

H

, 8

H

-benzo [ ,,,0],1, 2

b

: 3, 4

b

‘] dipiran-3-il) -1, 3-benzenodiol] é um polifenóis de flavonóides e uma componente principal da fração hidrofóbica de alcaçuz extrair [5]. Em adição aos efeitos estrogénicos, GLA exibe uma ampla gama de actividades biológicas, incluindo neuro-protectora, cardiovasculares-protector, anti-inflamatórios, etc [5] – [7]. Estudos recentes indicam que ABL apresenta efeitos anti-tumorais, com atenuação da proliferação, migração /invasão, angiogénese e em células de cancro humano [8], [9]; No entanto, os efeitos do GLA nas propriedades CSCs, nas células de carcinoma hepatocelular, e os mecanismos moleculares subjacentes em permanecem obscuros.

factor de crescimento transformante beta (TGF-β) é um regulador crítico envolvida no crescimento celular, diferenciação e desenvolvimento [10]. É também a citocina pró-fibrogênica hepático mais potente predominantemente produzido pelas células mesenquimais activada após lesão hepática crónica [11]. No início e desenvolvimento de vários tumores, TGF-β induz a transição epitelial-mesenquimal (EMT), que é um evento celular crítico na aquisição de propriedades CSCs do [12], [13]. Assim, os inibidores de TGF-β têm sido desenvolvidos para terapias anti-cancerosas [14], [15]. estudo indica que a inibição de blocos de TGF-β a geração de CSCs, o que aumenta a ação da quimioterapia contra o câncer de mama triplo-negativo [16]. No presente estudo, nós tratamos linhas HCC celulares (HepG2, Huh-7, e MHCC97H) por GLA para determinar as alterações moleculares precoces, com ênfase em propriedades CSCs-like e via de TGF-β.

Materiais e métodos

cultura de células e reagentes

linhas de células de carcinoma hepatocelular (HepG2 e Huh-7) e linha de células de fígado normal humana (L-02) foram obtidos a partir do Instituto Xangai de Biologia celular, da Academia chinesa de Ciências (Xangai, China). linha de células MHCC97H (células de carcinoma hepatocelular com alto potencial migratório) foi obtido a partir de Instituto do cancro do fígado, Hospital Zhongshan, Universidade Fudan, de Xangai, China. As células foram mantidas em 5% de CO

2 a 37 ° C em Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM, Life Technologies /GIBCO, Grand Island, NY) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS, Life Technologies /Gibco), 100 U /ml de penicilina, e 100 ug /mL de estreptomicina (Life Technologies /Gibco, Gaithersburg, MD). ABL (≥98.0% de pureza) foi adquirido de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, EUA). Todos os outros reagentes utilizados eram de grau analítico ou de grau mais elevado disponível.

da transcriptase reversa de reacção em cadeia da polimerase (RT-PCR)

O ARN total (2 ug) foi transcrito em ADNc utilizando inversa de AMV transcriptase (Promega, Madison, EUA). Os iniciadores utilizados são os listados na Tabela S1. A reacção de PCR foi avaliada, verificando os produtos de PCR em 2% w /v de géis de agarose. Bandas foram normalizados pela utilização de

desidrogenase gliceraldeído 3-fosfato (GAPDH)

para corrigir as diferenças no carregamento dos cDNAs.

quantitativo em tempo real da reacção em cadeia da polimerase (qRT-PCR)

o ARN total (1 ug) foi transcrito em cDNA utilizando TaqMan miARN Transcrição reversa Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA) com específicos de miARN anelada iniciadores reverso. As condições de reacção foram as seguintes: 42 ° C durante 15 min e 85 ° C durante 5 s. qRT-PCR foi realizado usando um kit de PCR TaqMan pela Applied Biosystems 7300 Sequence Detection System (Applied Biosystems) durante 40 ciclos de 95 ° C durante 15 s e 60 ° C durante 1 min. O

U6

snRNA foi usada como um controlo interno. Dobram mudanças na expressão de cada gene foram calculados por um ciclo limite comparativa método (Ct) usando a fórmula 2

-. (ΔΔCt)

Western blot

Os lisados ​​celulares foram separados por de sódio sulfato de dodecilo (SDS) electroforese em gel de poliacrilamida e transferido para fluoreto de polivinilideno (PVDF) membranas (Millipore, Billerica, EUA); os complexos imunitários foram detectados por quimioluminescência aumentada (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, EUA). Os anticorpos utilizados foram Smad2 e p-Smad2 (Ser 465/467, Cell Signaling Technology); GAPDH (Sigma). As manchas foram normalizadas por utilização de GAPDH para corrigir as diferenças na carga das proteínas.

formação esferoidal

não aderentes 24 poços pratos (Costar, EUA), as células tratadas (2 × 10

3) foram suspensas em meio definido, isento de soro composto de DMEM /F-12 (Gibco), 10 ng /ml de factor de crescimento básico de fibroblastos recombinante humano (bFGF, R D Systems, EUA), e 10 ng /ml de factor de crescimento epidérmico (EGF, R D Systems). As células foram cultivadas durante 10 dias, e, em seguida, contados sob um microscópio (Olympus, Tóquio, Japão).

Anchorage-independente crescimento

placas de agar mole foram preparadas em placas de 24 poços com sub camadas de agarose a 0,70% em meio DMEM suplementado com FBS a 10%. Para testar as suas capacidades de crescimento das colónias em agar mole, as células foram colocadas em placas em triplicado a uma densidade de 1 x 10

3 em 2 ml de 0,35% de agarose através da base de ágar. As culturas foram alimentadas de três em três dias; depois de 14 dias, as colónias foram contadas sob um microscópio (Olympus).

celular transfecção

Anti-con, anti-miR-148a, Con-mímica e-miR-148a mímica eram sintetizado por células RiBoBio Co. foram transientemente transfectadas usando o reagente Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, EUA) durante 12 h, de acordo com o protocolo do fabricante. Para o ensaio de recuperação do gene, após as células MHCC97H foram transfectadas por anti-miR-148a durante 12 horas, que foram cultivadas em meio DMEM fresco suplementado com 10% FBS (Gibco), 100 U /ml de penicilina, e 100 ug /ml de estreptomicina (Gibco ) por mais 24 h, seguido por transfectadas com Con-mímica ou miR-148a-mímica para 12 h.

repórter luciferase ensaio

O pGL3-

Smad2

-3 ‘construção UTR-Luc foi comprado de Biologia Shuntian (Shanghai). O plasmídeo phRL-TK (usado como controlo interno para a eficácia de transfecção e a citotoxicidade dos produtos químicos de teste) contendo o gene da luciferase de Renilla foi adquirido a Promega. Resumidamente, as células HepG2 foram plaqueadas em 24 poços de placas de cultura de células. As células proliferaram até 60 a 80% de confluência após 24 h de cultura. Anti-con ou anti-miR-148a foi co-transfectado com o repórter constrói respectivamente, usando reagente Lipofecamine 2000 (Invitrogen) de acordo com o protocolo do fabricante. Após um período de incubação de 12 h, o meio de transfecção foi substituído. Em seguida, depois as células foram tratadas por 0 ou 20 uM de GLA durante 24 h, foram colhidas, lavadas com PBS (pH 7,4). As células foram lisadas com tampão de lise passiva (Promega). Os lisados ​​celulares foram analisados ​​imediatamente com uma placa de luminómetro de 96 poços (Berthold Detection System, Pforzheim, Alemanha). As quantidades de luciferase e de Renilla luciferase foram medidas com o Kit de luciferase dupla Reporter Assay System (Promega) seguindo as instruções do fabricante. Os valores da actividade da luciferase para cada lisado foram normalizadas para a actividade de luciferase de Renilla. A actividade relativa foi convertido em indução vezes acima do valor de controlo do veículo.

A análise estatística

valores, os quais foram apresentados como médias ± DP.

t

provas de um estudante, e uma análise de uma via de variância (ANOVA), seguido de

t

teste de Dunnett foram usadas para avaliar as diferenças significativas entre os grupos.

valores P Art 0,05 foram considerados estatisticamente significativos

Resultados

GLA atenua as propriedades CSCs-como em células de carcinoma hepatocelular

Para determinar as concentrações de. GLA usando em nosso estudo, nós expusemos HepG2 ou células L-02 a 0, 5, 10, 20, 40, ou 80 mM de ABL para 24, 48 ou 72 h. Como se mostra nas Figuras. S1A e S1B, não houve nenhum efeito detectável de 10 ou 20 uM de GLA na viabilidade de células, nem em células de carcinoma hepatocelular (HepG2), nem nas células normais do fígado (L-02). Por isso escolhemos estas concentrações para uma investigação mais aprofundada.

Um aumento da exposição de propriedades CSCs-como desempenha um papel fundamental na iniciação, desenvolvimento e evolução de câncer diversificada, incluindo HCC [2].

CD44

,

CD90

,

CD133

, e

EpCAM Quais são os marcadores de superfície celular de células-tronco de câncer de fígado [17] – [19] , além disso,

Oct-4

e

BMI-1 Quais são os genes-chave “stemness ‘em CSCs de vários tipos de câncer [13], [20]. Aqui, tal como mostrado na Figura. 1A e 1B, o GLA diminuiu as expressões destes genes em células HepG2 em uma maneira dependente da dose; Enquanto isso, as expressões diminuídos de células HepG2

CD44 Comprar e

EpCAM

também foram observados em mais duas células de carcinoma hepatocelular (Huh-7 e MHCC97H).

(A) foram tratados por 0, 10, ou 20 pM ABL durante 72 h. análises de

CD44

,

EpCAM

,

CD133

,

CD90

,

Oct-4

RT-PCR, e

BMI-1