Abstract

Fundo

O câncer de pâncreas é um dos mais mortais tipos de câncer com uma taxa de sobrevida em 5 anos de 6%. As opções terapêuticas são muito limitados e há uma necessidade médica não atendida para tratamentos seguros e eficazes. o metabolismo das células de câncer e mitocôndrias fornecer alvos inexploradas para esta doença. Recentemente, identificou uma nova classe de compostos, sais de trifenilfosfónio TP, com propriedades anti-cancro espectro de radiodifusão. Foi examinada a capacidade do nosso composto protótipo TP421- escolhido pelas suas propriedades fluorescentes -. Para inibir o crescimento de células de cancro do pâncreas e ainda mais investigados os mecanismos moleculares pelos quais ele exerce os seus efeitos anti-cancerígenos

Metodologia /principais conclusões

TP421 exibiu sub-micromolar IC

50 valores em todas as linhas celulares de cancro do pâncreas testados utilizando ensaios de MTT e formação de colónias. TP421 localizada predominantemente para a mitocôndria e induziu G

0 /G

1 prisão, a acumulação de ROS, e ativação de várias quinases regulada ao estresse. A caspase-1 e PARP clivagem foram observados, indicando uma resposta apoptótica, enquanto LC3B-II e p62 foram acumulado indicando a inibição da autofagia. Além disso, induzida TP421 de-fosforilação de moléculas-chave envolvidas na sinalização FAK adesão mediada que se correlacionaram com a inibição da migração celular.

Conclusões /Significado

TP421 é um composto representativo de uma classe nova e promissora de agentes direcionados-mitocondriais úteis para o tratamento do câncer pancreático. Por causa de seu único mecanismo de acção e eficácia maior desenvolvimento é garantido

Citation:. Shabaik YH, Millard M, Neamati N (2013) mecanicista avaliação de um novo pequena molécula segmentação mitocôndrias nas células do cancro do pâncreas. PLoS ONE 8 (1): e54346. doi: 10.1371 /journal.pone.0054346

editor: Aamir Ahmad, Faculdade de Medicina da Wayne State University, Estados Unidos da América

Recebido: 12 Julho, 2012; Aceito: 12 de dezembro de 2012; Publicação: 21 de janeiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Shabaik et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi financiado em parte por fundos do Prêmio mama Congressionally Directed Medical Research Program Cancer Concept eo Sharon e William Cockrell Cancer Research Fund Endowed. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de pâncreas é a quarta principal causa de mortes relacionadas ao câncer nos Estados Unidos com uma taxa de sobrevida em 5 anos global de 6% [1]. Desde 2005, o tratamento quimioterapêutico padrão é a administração de gemcitabina, um análogo de nucleósido, combinado com erlotinib, um inibidor de quinase [2], [3]. Gemcitabina tem como alvo a ribonucleótido-redutase causar o esgotamento das dNTPs e ainda é incorporado DNA causando uma tenda na síntese [4]. Por outro lado, erlotinib, pensou originalmente para alvejar o receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR), recentemente tem sido documentada como sendo um inibidor de multi-quinase [5]. O caminho para a atividade gemcitabina é suficientemente complicado, incluindo transportadores de captação e fosforilação intracelular levando a citotoxicidade, o que contribui para a baixa taxa baixa taxa de resposta em pacientes e o crescente desenvolvimento da chemoresistance [6]. Recentemente, tem sido proposto que PDAC estratificação em vários subtipos baseados nas diferenças moleculares pode determinar a resposta à quimioterapia [7]. Dois dos três subtipos definidos são representados entre as linhas celulares de cancro do pâncreas comumente usados, incluindo MIA PaCa-2, PANC-1 e HPAC que utilizamos em nosso estudo.

Entre as primeiras alterações moleculares do câncer de pâncreas subjacente é uma mutação K-ras constitutivamente de activação que ocorre em quase 100% dos casos de [8], [9]. Durante a transformação, K-ras sinalização unidades de proliferação celular excessiva e promove a sobrevivência. Tem sido proposto que a produção de energia mitocondrial é essencial no apoio células transformadas com Ras, que se tornam muito dependentes autofagia, um estado designado por “dependência autofagia”, para manter um pool saudável das mitocôndrias e do ciclo do TCA suficiente intermediários para apoiar a fosforilação oxidativa ( OXPHOS) [10], [11]. Notavelmente, em linhas celulares de cancro do pâncreas e amostras de doentes, o nível basal de autofagia é elevada, em comparação com as células normais e em células de outras linhas de células de tumor e correlaciona-se com piores resultados clínicos [10], [12]. Este fenótipo, característica das células transformadas com Ras, torna-os unicamente susceptível a perturbações da respiração mitocondrial e autofagia. De facto, a inibição farmacológica, assim como o silenciamento de genes-chave autofagia resultou com sucesso na redução do consumo de oxigénio e níveis de ATP mitocondrial intracelulares que conduzem a uma profunda inibição do crescimento do cancro do pâncreas, tanto in vitro como in vivo [10]. Portanto, a inibição da autofagia e segmentação mitocondrial poderia fornecer uma nova abordagem para o tratamento de PDACs que estão normalmente altamente refratários às quimioterapias disponíveis. De fato, tem havido um aumento recente do interesse para a segmentação mitocôndrias de células de câncer após o reconhecimento do seu estatuto bioenergético alterado como um contribuinte para a patogênese do câncer [13]. Por conseguinte, as mitocôndrias de segmentação tem emergido como um novo ideal para a terapia anti-cancro auxiliada em parte pelo conhecimento de conseguir a entrega precisa de medicamentos para o organelo. O uso de agentes direcionados mitocondriais para terapias anti-cancro apresenta um benefício adicional de actuar directamente sobre o principal regulador da morte celular programada no interior da célula e inteiramente ignorando as cascatas de sinalização a montante que são muitas vezes minaram [14]. Tem sido bem documentado que as mitocôndrias de células malignas exibem um potencial transmembrana mais elevada em comparação com células não-malignas, com diferenças de actividades enzimáticas, transportadores de electrões e estrutura de lípidos da membrana como potenciais causas subjacentes [15]. Explorando este atributo original levou à concepção de novos catiões lipófilos que podem preferencialmente acumular em mitocôndrias de células de tumor ao longo do tecido normal, devido ao aumento potencial transmembranar [15]. Conjugação de trifenilfosfónio (TPP) catiões para uma variedade de sondas de químicos e medicamentos é amplamente utilizado para atingir direccionamento específico para as mitocôndrias [16], [17], [18], [19], [20]. A vitamina E analógico TPP-marcado (MitoVES) tem sido extensivamente estudada por sua apoptose e as propriedades anti-angiogénicos, que são muito avançados em relação à do composto marcado-un dos pais, apoiando mitocondrial segmentação como uma abordagem viável para melhorar a eficácia de moderadamente ativos candidatos de drogas [20], [21], [22]. Alternativamente, os transportadores de distribuição de drogas, tais como dendrímeros e lipososmes foram modificados com catiões TPP e utilizada para entregar a carga para a mitocôndria [17], [23], [24], [25]. Quando estas transportadoras foram carregados com medicamentos quimioterápicos modelo incluindo paclitaxel ou doxorrubicina, a eficácia foi reforçada ao longo portadores não-alvo, indicando que a entrega para a mitocôndria pode melhorar a apoptose e citotoxicidade.

Temos anteriormente relatou a descoberta de uma nova classe sais de TPP que tem actividade anti-cancro de amplo espectro [26]. Estes compostos podem acumular-se nas mitocôndrias, em virtude das suas porções TPP carregados positivamente e o potencial negativo através das membranas mitocondriais [27]. Posteriormente, temos demonstrado que estes compostos são capazes de revoga a respiração mitocondrial e aumentando os níveis de superóxido mitocondriais. Mais importante ainda, que têm mostrado que esta classe de compostos pode inibir eficazmente o crescimento do tumor num modelo de xenoenxerto de cancro da mama ratinho nu com nenhuma toxicidade aparente [26]. Devido ao seu mecanismo único de mitocôndrias de ação visando ea dependência requintado de tumores Ras-driven sobre a função mitocondrial, procurou-se desenvolver esta classe de compostos, enquanto novos agentes contra o câncer de pâncreas. Além disso, dada a importância da autofagia para manter uma piscina saudável das mitocôndrias para suportar a sobrevivência e proliferação das células Ras transformados, a hipótese de que TP421 iria induzir a morte celular em células de câncer de pâncreas, de forma que envolva regulamentação autofagia das mitocôndrias.

Materiais e Métodos

linhas celulares e Cultura Reagentes

MIA PaCa-2, PANC-1, BxPC-3 e linhas celulares de cancro pancreático HPAC foram comprados na American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA). MEF atg3 + /+ e atg3 – /- linhas de células de murino foram um presente da Masaaki Komatsu (Escola de Medicina da Universidade de Juntendo, Bunkyo-ku, Tokyo) [28]. HFF-1 linha de células de fibroblasto normal foi fornecido pelo Dr. Carla Grandori (Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, WA). Todas as linhas celulares utilizadas para a experimentação foram mantidas em cultura com menos de 35 passagens e testadas periodicamente para contaminação por micoplasma usando PlasmoTest ™ (Invivogen, San Diego, CA). MIA PaCa-2 e células PANC-1 foram mantidas em DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS; Gêmeos-Bioproducts, West Sacramento, CA). BxPC-3, MEF atg3 + /+ e atg3 – /- células foram mantidas em meio RPMI suplementado com FBS a 10%. As células foram mantidas em HPAC 01:01 mistura de meio F12 de Ham e meio DMEM suplementado com 5% de FBS. As células foram cultivadas a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO2. Para todas as experiências, as células em fase de crescimento exponencial foram lavadas com DPBS sem cálcio e magnésio, brevemente tripsinizadas em um pequeno volume de solução de 0,25% de tripsina-EDTA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), re-suspensas em meio de cultura completo , contadas manualmente e semeadas em placas estéreis e deixadas aderir durante a noite antes de tratar.

compostos

Todos os compostos foram armazenados como estoque de DMSO concentrado congelado a -20 ° C. As diluições foram preparadas em DPBS, sem cálcio e magnésio, e re-utilizado por um período máximo de 3 ciclos de congelamento-descongelamento. Os compostos foram adquiridos de LKT Laboratories Inc. (St. Paul, MN), Sigma-Aldrich Corp. (Saint Louis, MO) e Asinex Ltd. (Moscou, Rússia).

Ensaio de citotoxicidade

a citotoxicidade foi medida pela 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio (MTT) ensaio colorimétrico tal como previamente descrito [26].

Colony Formation ensaio

as células foram semeadas em placas de 6 poços (500-1000 células por cavidade, dependendo da linha celular) e deixada durante a noite para aderir. No dia seguinte, as drogas foram adicionadas aos poços durante 24 h após o que o meio foi substituído com meio isento de droga. As células foram incubadas durante 7-14 dias para permitir que as colónias se formar. As colónias foram coradas com uma solução de violeta cristal (0,05% de violeta cristal, 0,74% de formaldeído e 36% de metanol), lavados e depois trabalhada.

Trypan Blue Exclusão Ensaio

As células tratadas foram coletadas através de breve tripsinização e coradas utilizando uma solução de azul de tripano 0,4% (Lonza Group Ltd) de acordo com a recomendação do fabricante. As células foram contadas utilizando um hemacitómetro.

Alamar Blue celular Viabilidade Ensaio

As células foram tratadas idêntico ao ensaio de MTT descrito acima. No final do tratamento, azul de Alamar (Serotec AbD

©) foi adicionado às cavidades de acordo com a recomendação do fabricante. A fluorescência foi detectada em comprimentos de onda 560/590 ex /em.

Ciclo Celular Determinação

células tratadas com droga foram recolhidas através de tripsinização breve, e fixadas em etanol a 70% a -20 ° C durante pelo menos 4 h. Para a determinação do teor de DNA, as amostras foram centrifugadas e re-suspensas em DPBS contendo iodeto de propídio (50 ug /ml de concentração final) e RNase A (100 ug /ml de concentração final) e analisadas por citometria de fluxo.

celular Os lisados ​​e Western Blotting Análise

cellswere tratada enxaguado com DPBS e lisaram-se em gelo pela adição de um pequeno volume de SDS contendo tampão de lise de células durante 15 min. Os lisados ​​foram recolhidos em tubos Eppendorf, sonicada em gelo para cortar o ADN, e quantificadas usando o ensaio de proteína RC DC (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Trinta microgramas de ligado celular foi carregada em cada faixa e sujeitos a SDS-PAGE e transferidos posteriormente para Immun-Blot membranas de fluoreto de polivinilideno (PVDF; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Resumidamente, as membranas foram bloqueadas em 5% de leite em TBST, seguido por incubação em anticorpo primário diluído em tampão de bloqueio apropriada a 4 ° C overnight.After, as membranas foram lavadas, foi adicionado anticorpo secundário apropriado durante 1 h à temperatura ambiente e finalmente lavada antes de imagem. Todos os anticorpos foram adquiridos a partir de qualquer Cell Signaling Technology Inc. (Danvers, MA) ou Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA). detecção de proteínas foi realizada utilizando Super Signal Oeste Dura substrato quimioluminescente (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) e fotografada em ChemiDoc ™ XRS + sistema (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Para todos os dados de Western blot, as imagens são blots representativos seleccionados a partir de pelo menos duas experiências independentes.

A medição dos níveis de peróxido de hidrogénio

A geração de peróxido de hidrogénio foi medida utilizando um ensaio de enzima Amplex Red. As células cultivadas em placas de 96 poços negras de fundo claro foram tratadas durante 4 h com a concentração desejada de droga em fenol-vermelho livre de DMEM suplementado com FBS a 10%. No final do tratamento, as células foram lavadas e lisadas em tampão de DPBS contendo 50 uM Amplex Red (Molecular Probes) e 0,1 unidades /mL de peroxidase de rábano (HRP, Sigma, St. Louis, MO) e incubadas durante 30 min a 37 ° C , protegido da luz. Após a incubação, a intensidade de fluorescência de cada poço foi detectada em 540/590 ex comprimentos de onda /EM.

Medição de superóxido Níveis ânion

Droga trataram células PACA-2 e BxPC-3 MIA foram brevemente manchado com indicador de vermelho MitoSOX mitocondrial dismutase (Invitrogen, Carlsbad, CA) seguindo intensidade recommendations.Fluorescence do fabricante foi medida utilizando citometria de fluxo, como previamente descrito [26].

Microscopia fluorescente de TP421 Localização subcelular

MIA PACA-2 e PANC-1 linhas celulares foram semeadas em dupla tampa de vidro Chambered (Nalge Nunc International, Rochester, NY) a uma densidade de 50.000 células /câmara e permitiu que durante a noite para aderir. No dia seguinte, as células foram tratadas com 2 uM TP421 por períodos de tempo de até 72 horas. Antes da imagiologia, as células foram coradas durante 15 minutos a 37 ° C usando 200 nM Mitotracker Red CMXRos ou 50 nM Lysotracker Vermelho DND 99 manchas organelo celular vivos (Life Technologies, Grand Island, NY) seguindo as recomendações do fabricante. células vivas foram visualizadas usando um Nikon DAIPHOT 300 microscópio invertido (Nikon Instruments, Melville, NY), equipado com DAPI e Cy3 blocos de filtros, peças 10x olho e 100x /1.3 Nikon lente de imersão em óleo e lâmpada de mercúrio de super alta pressão. Para evitar a fotodegradação, a exposição da amostra à luz foi minimizada durante a aquisição de imagem, envolvendo filtros de densidade neutra (ND2 e ND4) para limitar a intensidade de luz que atinge a amostra. As imagens foram captadas com uma câmara fotométricos CoolSnap 9 CCD (Roper Scientific, Ottobrun, Alemanha) e processados ​​usando Q-Capture Pro v 5.1.1.14 software de imagem (Imaging Corporation Q, Surrey, BC, Canadá).

imunofluorescência coloração de

MIA células LC3B

PaCa-2 foram semeadas em lamelas de vidro com uma densidade de 50000 células e deixada durante a noite para aderir. No dia seguinte, as células foram tratadas com 2 TP421 uM na presença ou na ausência de 5 uM de rapamicina ou 10 uM de cloroquina, durante 18 h. No final do tratamento, o meio foi removido e as células foram lavadas com 500 mL de DPBS antes da fixação com formaldeído a 3,7% durante 15 min à TA. As células fixadas foram lavadas com 500 mL de DPBS anterior e posterior a permeablization com acetona arrefecida em gelo durante 5 minutos a -20 ° C. As lamelas foram bloqueadas durante 30 min com albumina de soro bovino 1% (BSA) em DPBS antes da incubação durante a noite a 4 ° C com anticorpo LC3B em 1% de BSA. O anticorpo foi removido e lamelas foram lavadas em DPBS com agitação suave. anticorpos Cy5 e Cy3-conjugado (GE Healthcare Lifesciences, Pittsburgh, PA) diluído em BSA a 1% foram incubadas com lamelas durante 2 h. As lamelas foram novamente lavadas em DPBS com agitação suave, seco ao ar e montadas em meio de montagem pré-limpos slidesusing vidro Prolong ouro anti-desvanecimento (Life Technologies, Grand Island, NY). As imagens foram obtidas utilizando um Lieca SP2 microscópio confocal (Leica Microsystems, Heidelberg, Alemanha) equipado com 488 árgon nm e 633 lasers krypton nm (potência do laser foi mantida a um mínimo de 50% do total) e software Leica Confocal v 2,61 ( Leica Microsystems, Heidelberg, Alemanha).

In vitro Migration Assay

a migração celular foi testada usando inserções de cultura de células de 24 poços de placas equipadas com membranas transparente de PET com 8 mm poros de tamanho (BD Biosciences, San Jose, CA). 7,5 × 10

4 carência de soro células MIA PaCa-2 foram semeadas na câmara superior em meios livres de soro e deixadas aderir levemente durante a noite. No dia seguinte, a migração foi estimulado com meio com FBS a 10% adicionado à câmara inferior. Os poços de controlo negativos receberam meio de soro de 1% em vez disso. TP421 amostras tratadas, recebeu 10% de FBS em meio a câmara inferior e o composto em meio isento de soro na câmara superior. Após 24 h, as células aderentes ao lado superior da membrana foram levemente desmantelada fora utilizando um Q-tip. As células no lado inferior da membrana foram coradas com corante nuclear de Giemsa durante 30 minutos à temperatura ambiente e lavou-se com água desionizada. Imagens das membranas coradas foram capturados a partir de campos representativos usando microscópio invertido Nikon com uma objectiva 10X.

Cicatrização de Feridas Ensaio

de cultura de tecidos tratados placas de 96 poços foram revestidas com colagénio I dissolvido em 0,2 N ácido acético (esterilizada por filtração) a uma concentração final de 45 ug /ml, durante a noite a 4 ° C durante a noite. No dia seguinte o excesso de colagénio foi removida, os poços foram lavados duas vezes com DPBS e bloqueadas com 2 mg /ml de BSA em DPBS durante 1 h à temperatura ambiente. Após o bloqueio, os poços foram novamente lavados DPBS. células PANC-1, em seguida, foram semeadas a uma densidade de 35.000 células /poço em meio de soro completo e deixadas a aderir durante a noite. Os meios foram alterados para meios isentos de soro e as células foram adicionalmente incubadas durante a noite. No dia seguinte, arranhões foram feitos usando a ponta de uma ponta de 200 ul e os poços foram lavados com DPBS. Tratados e os poços de controlo tratado com un recebeu 10% de FBS contendo meio e foi adicionado droga. poços de controlo negativo recebeu meio isento de soro. As feridas foram deixadas 24 h, para se fechar, no final do qual os poços foram lavados com DPBS, as células foram fixadas em metanol a 100% durante 10 minutos e coradas com corante nuclear de Giemsa durante 30 min. Finalmente, os poços foram lavados com água desionizada e wallowed para secar. As feridas foram fotografadas com um usando uma objetiva de 4X.

Análise Estatística

Onde, p-valores indicados foram calculados utilizando o teste t de Student não pareado bicaudal com variâncias desiguais. Os valores de p inferior a 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

TP421 Mostra citotoxicidade rápida e potente em um painel de cancro do pâncreas celular Lines

Em nosso relatório inicial sobre a actividade anti-cancro desta classe de compostos foi descrita a sua citotoxicidade potente contra linhas celulares de cancro de linhagens diferentes [26]. Aqui, nós testamos a capacidade de um dos compostos de chumbo identificados forma a tela inicial, TP421, para induzir citotoxicidade e inibir a proliferação celular num painel de linhas celulares de cancro pancreático. Usando o ensaio de MTT, foi avaliado o efeito de 72 horas de exposição contínua a doses crescentes de TP421, TP187, TP197 e sobre o crescimento de MIA PaCa-2, BxPC-3, PANC-1 e de células HPAC linhas. Os resultados (Tabela 1) revelou citotoxicidade potente, com TP421 IC

50 valores na gama sub-micromolar em todas as linhas celulares testadas, independentemente das suas diferenças em estado de diferenciação ou o fundo genético mutacional. Estruturas dos compostos testados estão apresentados na figura de apoio (Figura S1). A porção TPP neste composto é essencial para a actividade de 7-dietilamino-4-metil-coumarina, um análogo estruturalmente idêntico de TP421 falta o radical TPP, não produziu citotoxicidade nas linhas celulares testadas. Foram examinados os efeitos das 24 h de exposição para TP421 na capacidade de formação de colónias de células MIA PaCa-2 em comparação com a gemcitabina e erlotinib (Figura 1). Os resultados confirmaram a capacidade do TP421 para inibir a proliferação de células

in vitro

para níveis comparáveis ​​com gemcitabina e muito mais potente do que o erlotinib. Para caracterizar adicionalmente as actividades citotóxicas de TP421, incubámos as células na presença ou ausência de uma gama de concentrações de TP421 para 0,25, 0,5, 1 ou 5 h, seguido por incubação em meio isento de droga para 24, 48 e 72 h. Em paralelo, células tratadas com uma exposição contínua a TP421 para 24, 48 e 72 h. No final da incubação foram avaliados a viabilidade celular por meio de MTT. Como esperado, o IC

50 de TP421 tinha uma correlação inversa com o tempo de tratamento, bem como a duração total do tempo de incubação, como se mostra na Tabela 2. No entanto Inesperadamente, observou-se que com os tempos de exposição muito curtos, tão breve quanto 15 min, TP421 foi capaz de atingir 50% de citotoxicidade, embora a concentrações mais elevadas (20 uM), indicando um efeito inicial muito rápida da droga. Curiosamente, descobrimos que para PANC-1 células tratadas desta maneira, menor tempo de exposição à droga reduziu consideravelmente a citotoxicidade do TP421. As curvas de sobrevivência comparando os tempos de exposição contínua e 0,25 h nas três linhas de células são mostradas na Figura 2.

Efeito de 24 h de exposição à droga na capacidade de formação de colónias de (A) MIA PaCa-2 e (B) BxPC -3. As imagens são representativos de três experiências independentes.

Dose curvas de sobrevivência de resposta para linhas de células tratadas com TP421 comparação da exposição continua (quadrados a cheio) para a exposição ao fármaco de 0,25 h, seguido por um meio de lavagem para fora (quadrados abertos) e incubação adicional. O tempo total de incubação é indicada entre parênteses. Os dados são média ± SD de três experiências independentes. concentrações TP421 são plotadas sobre uma base Log 10 escala.

TP421 citotoxicidade é seletiva para as células cancerosas

Seguindo a premissa de que TP421 iria acumular selectivamente em células cancerosas conduzido pelo potencial transmembrana superior, comparamos o efeito de TP421 sobre as características de crescimento da linha celular de fibroblastos normais HFF-1 contra três das linhagens de células do cancro do pâncreas. Tratar PaCa-2 e HFF-1 células MIA com uma gama de doses de TP421 durante 72 h revelou que distintamente mais elevada sensibilidade da linha celular de cancro pancreático para a droga (Figura 3A). Este foi ainda confirmada através da medição da percentagem de células mortas por tratamento acumulados TP421 que foi significativamente mais elevado nas células de cancro do pâncreas, em comparação com HFF-1 (Figura 3B). Além disso, utilizando o corante indicador azul de alamar, observou-se uma diferença de 4 vezes na inibição da proliferação de células MIA PaCa-2 em comparação com células HFF-1 seguinte período de incubação de 72 h com TP421 nas doses indicadas. (Figura 3C).

(a) O crescimento de células normais HFF-1 não é afectada, enquanto as células do cancro pancreático MIA PaCa-2 mostram grande morte após 72 h de exposição a doses crescentes de TP421. (B) TP421 induz uma maior morte celular em três linhas de células de cancro do pâncreas, em comparação com células HFF-1 como medido por exclusão de azul de tripano. (C) Proliferação de MIA PaCa-2, mas não HFF-1 é fortemente inibida por TP421 no ensaio de azul de alamar. Três experiências independentes foram realizados, imagens representativas são mostradas em (A), média ± desvio padrão são representados em (B) e (C). *, **, *** E **** indicam valor de p 0,05, p 0,01, p 0,001 e p 0,00005. Respectivamente

TP421 linhas celulares Detenções do cancro do pâncreas em G

0 /G

1 fase do ciclo celular em uma hora e dose-dependente Manner

a fim de elucidar o mecanismo pelo qual TP421 inibe a proliferação celular, avaliou seu efeito sobre o ciclo celular cinética. MIA PaCa-2 (Figura 4), PANC-1, BxPC-3, HPAC e (Tabela 3) as células foram tratadas com duas concentrações de TP421 para aumentar a duração de tempo e conteúdo de ADN foram analisadas utilizando citometria de fluxo. Extensiva G

0 /G

1 prisão foi observada em todas as linhas de células, apesar de pequenas diferenças em suas sensibilidades a TP421. Interessantemente, a distribuição do ciclo celular para PaCa-2 tratadas com células MIA os dois outros análogos, TP187 e TP197, TP421 assemelhou-se também com a prisão significativa no início e L

0 /L

1 (Tabela 3). Este resultado difere do L

2 /M e paragem da fase S induzida por estes compostos em linhas celulares de cancro não-pancreáticas [26], indicando um potencial efeito específico do tipo de tumor.

O efeito de tratamento TP421 sobre a distribuição do ciclo celular de células MIA PaCa-2 foi examinada numa dose e modo dependente do tempo. As células não foram tratados ou tratados com 0,1 e 1 uM TP421 para 24, 48 e 72 h. Histogramas descritos são representativos de três experiências independentes.

TP421 Localiza para estruturas mitocondriais com sustentada de retenção ao longo do tempo

TP421 pertence a uma classe de compostos contendo um cátion TPP conhecido por acumular nas mitocôndrias [27]. A fim de confirmar a localização mitocondrial, células PANC-1 foram tratados com 2 uM TP421 para vários períodos de tempo. Imediatamente antes de imagem, as células foram co-coradas com 200 nM de MitoTracker Red corante para marcar as mitocôndrias. Observou-se co-localização significativa que persiste durante até 72 h (Figura 5A), indicando que, de facto TP421 acumulado nas mitocôndrias e foi retida por um período de tempo prolongado. Como verificação secundário de localização mitocondrial procurou-se determinar o papel do potencial transmembranar mitocondrial na acumulação de TP421 em células. Usando a fenil-hidrazona ionóforo cianeto carbonil-4- (trifluorometoxi) (FCCP), utilizada para dissipar o potencial transmembranar mitocondrial, examinou-se o padrão de fluorescência TP421. Nós pré-tratados células PANC-1, durante 30 minutos com 10 uM FCCP seguido por uma incubação de 15 min com TP421. As células de controlo não recebeu qualquer FCCP e foram expostas a 15 min única TP421. Na presença de FCCP, foi observada uma fluorescência nitidamente TP421 difusa (Figura 5B), que não se assemelham a de localização mitocondrial, confirmando que, sob condições normais de TP421 acumulado dentro da mitocôndria conduzido pelo potencial transmembrana. Uma vez que tínhamos observado que 7-dietilamino-4-metil-coumarina não foi citotóxico para as células, exploramos ainda mais a relação entre a localização mitocondrial e TP421 citotoxicidade. Nós pré-tratados células MIA PaCa-2 durante 30 minutos com 10 uM FCCP, em seguida, adicionou-TP421 para um adicional de 30 min. No final da duração do tratamento, lavou-se as células e substituiu o meio para remover o excesso de fármaco e incubaram-se as células durante 24, 48 e 72 horas e a viabilidade da célula medida. Na presença de FCCP as células foram significativamente protegidos contra TP421 citotoxicidade (Figura 5C), indicando que a localização de mitocôndria era directamente responsável pela acção da nossa droga.

células PANC-1 (A) tratadas com TP421 e coradas com MitoTracker Red (MTR) revelam extensa co-localização de TP421 e corante marcador mitocondrial. células (B) PANC-1 pré-tratados com FCCP mostrar a localização não-TP421 mitocondrial. (C) Redução a citotoxicidade de TP421 em PaCa-2 MIA células pré-tratadas com FCCP é visto em 24, 48 e 72 h. Os dados são média ± SD de três experiências independentes. * Indica p . 0,01

TP421 Tratamento Induz mitocondrial e citosólica Acúmulo de Espécies Reativas de Oxigênio

TP421 diminui a capacidade respiratória mitocondrial e aumenta superóxido (O

2

– ) acumulação de [26]. No entanto, em comparação com O

2

-, peróxido de hidrogénio (H

2O

2) é um ROS relativamente mais estáveis ​​e de membrana permeável que podem causar lípido, proteína e os danos do ADN e participa transdução de sinal [29]. Portanto, nós examinamos o nível de H

2O

2 em células de câncer de pâncreas após o tratamento TP421. MIA PaCa-2 e células BxPC-3 foram tratados com doses crescentes de TP421 durante 4 horas seguida de uma breve incubação com 50 ^ M Amplex Red, na presença de 0,1 unidades /ml de HRP. Na presença de HRP, Amplex Red reagente reage com H

2O

2 numa estequiometria 01:01 para produzir resorufina altamente fluorescente. A intensidade de fluorescência resultante foi medida a comprimentos de onda de excitação e emissão de 540 nm e 590 nm, respectivamente. Como esperado, o tratamento resultou em um aumento de 2,5 vezes em H

2O

2 níveis em BxPC-3 na maior concentração de TP421 com uma boa correlação entre H

2O

2 níveis e dose de TP421 utilizado (Figura 6A). Por outro lado, um aumento semelhante na fluorescência não podia ser detectada em células MIA PaCa-2 (dados não mostrados). Para determinar se a falta de H

2O

2 acumulação nestas células foi devido a uma ausência de O

2

– geração, foi utilizado um ensaio vermelho MitoSOX [26] para medir o nível de mitocondrial O

2

– em MIA PaCa-2 e comparou-a BxPC-3. Ambas as linhas de células tratadas com doses crescentes de TP421 durante 4 h exibiu 3-5 vezes de aumento em O

2

– nível (Figura 6B) e esses níveis permaneceram elevados às 24 h (dados não mostrados). Isto sugere que a falta de H

2O

2 acumulação observada em células MIA PaCa-2 não foi devido a deficiente O

2

-produção nestas células.

O efeito de tratamento TP421 sobre os níveis de (a) H

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2 e (B) mitocondrial o

2

– em células BxPC-3 e MIA PaCa-2 foram medidos usando as sondas fluorescentes Amplex vermelho e MitoSOX vermelho, respectivamente. (C) Efeito do pré-tratamento antioxidante sobre a citotoxicidade de TP421 em células PANC-1. *, ** E *** indicam p 0,05, p 0,005 e p . 0.001, respectivamente

Como excessiva ROS é conhecido por levar à morte celular, examinamos ainda mais o potencial papel protector de um antioxidante. células PANC-1 foram pré-tratadas com 15 mM de

N-acetil-cisteína

L- (NAC), durante 2 h antes da adição de TP421. Na sequência de uma incubação de 24 h a extensão de citotoxicidade foi determinada pela MTT. Antioxidante pré-tratamento pode proteger as células de TP421 citotoxicidade induzida por até 35% (Figura 6C) e resultados semelhantes foram observados em células MIA PACA-2 e BxPC-3 (dados não mostrados).

TP421 Tratamento Activa Stress induzida Pathways

Dada a forte acumulação de ROS após o tratamento TP421, a hipótese de que, estresse celular vias JNK, p-38 e ERK, será ativado [30], [31], [32]. MIA PaCa-2 e células BxPC-3 foram tratados com doses crescentes de TP421 durante 4 h, ou com 5 uM de 1-8 h e a activação da cinase foi avaliada por Western blotting.