Sumário

O interruptor transcriptómica recentemente descrito para um programa de mitose no cancro da próstata resistente à castração (CRPC) sugere que as proteínas mitóticos podem ser racionalmente alvo nesta fase letal da doença. Neste estudo, nós mostramos regulação positiva da fase mitose ao nível da proteína em nossa coorte de 51 casos CRPC clínicos e encontrou aberrações centrosomal também ocorrem preferencialmente no CRPC comparação com cancro da próstata hormono-sensível, de alta Gleason-grade não tratada (

P Art 0,0001). Perfil de expressão amostras CRPC quimioterapia-resistente (n = 25) foi realizada, e os resultados foram comparados com os dados da CRPC chemotherapy-naïve primário (n = 10) e casos de câncer de próstata hormônio-sensível (n = 108). Os nossos resultados mostraram enriquecimento de genes em fase de mitose e vias, com progressão para doença tanto resistente à castração e quimioterapia-resistente. O cinesina associada-centrómero mitótico (MCAK) foi identificado como um alvo em fase de mitose novo no cancro da próstata que foram sobre-expressos em vários conjuntos de dados de expressão genética CRPC. Encontramos a expressão do gene concordantes de MCAK entre o nosso pai e pares de xenotransplante CRPC murino e aumento da expressão da proteína MCAK com evolução clínica do câncer de próstata a um estágio da doença resistente à castração. Knockdown de MCAK prendeu o crescimento de células cancerosas da próstata, sugerindo a sua utilidade como um potencial alvo terapêutico

Citation:. Sircar K, Huang H, Hu L, Liu Y, Dhillon J, Cogdell D, et al. (2012) A mitose fase de enriquecimento com a identificação do mitótico Centromere-Associated Cinesina como um alvo terapêutico no cancro da próstata resistente à castração. PLoS ONE 7 (2): e31259. doi: 10.1371 /journal.pone.0031259

editor: Irina Agoulnik, Universidade Internacional da Flórida, Estados Unidos da América

Recebido: 10 de julho de 2011; Aceito: 04 de janeiro de 2012; Publicação: 17 de fevereiro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Sircar et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este artigo é apoiado por fundos institucionais do MD Anderson Cancer Center (KS). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Nenhum financiamento externo adicional foi recebida para este estudo

Conflito de interesses:. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O câncer de próstata é a segunda principal causa de. mortalidade específica por câncer nos Estados Unidos [1], com a maioria das mortes que ocorrem após falha da terapia de privação de androgênio quando o tumor cresce à medida que o câncer de próstata resistente à castração (CRPC), matando o paciente dentro de um período médio de 18 meses. quimioterapia à base de docetaxel foi estabelecido como o padrão de cuidado no CRPC, com uma pequena mas definitiva benefício de sobrevivência [2], [3]. Identificação de alvos para essa fase resistente à quimioterapia resistente à castração e do terminal da doença representa, portanto, uma necessidade não atendida no câncer de próstata [4], [5].

Um avanço recente e importante nesse campo foi a demonstração de que a andrógeno receptor activa um programa transcricional de fase distinta em mitose CRPC mas não em cancro da próstata sensível a hormonas (HSPC) [6], explicando parcialmente o sucesso relativo do docetaxel, um agente quimioterapêutico anti-mitótico utilizado para tratar CRPC. Estes resultados sugerem também que outras proteínas de fase mitose pode ser alvos potenciais para terapias de tratamento desta fase da doença.

Procurou-se primeiro validar a regulação positiva do programa transcricional de fase mitose ao nível da proteína em CRPC usando clínica CRPC e casos HSPC de alto grau. A seguir, compararam os perfis transcriptomic de amostras CRPC localizadas que estavam quimioterapia resistentes aos tumores sem quimioterapia anterior CRPC e cânceres de próstata hormônio-sensível. análise de caminho de dados de nossos espécimes in-house e bases de dados disponíveis publicamente identificados enriquecimento de genes relacionados com a mitose como a doença progrediu tanto uma fase resistente à castração e quimioterapia-resistente. O cinesina mitótico associada-centrómero (MCAK), cuja a expressão do gene foi regulada positivamente em vários conjuntos de dados de quimioterapia resistente CRPC, foi seleccionado para a validação clínica e funcional. a expressão da proteína MCAK foi associada com a progressão clínica do câncer de próstata, e sua knockdown prendeu o crescimento de células cancerosas da próstata.

Resultados

tumores CRPC mostram a expressão de proteínas de fase mitose aumentada e aberrações centrosomal comparação com de alto grau de HSPC

para validar o interruptor transcriptómica putativa para um programa de fase mitose em CRPC ao nível da proteína, utilizou-se a imunocoloração nuclear phosphohistone H3 como um marcador de fase mitose, como histonas são fosforilados na extremidade de profase e os seus picos de fosforilação na metafase [7]. Nós quantitativamente analisada seções tecido microarrays de HSPC e CRPC com o sistema de análise de imagem Ariol. Os nossos arranjos de tecido incluídos 557 núcleos e 250.000 núcleos de 75 casos clínicos. Os nossos resultados mostraram regulação positiva significativa de H3 phosphohistone no carcinoma prostático resistente à castração em comparação com HSPC (Figuras 1G-1I e Tabela S2). Estes resultados fornecem evidências de que proteínas de fase mitose são regulados positivamente no CRPC. Importante, tumores hormônio-sensível de alta qualidade com graus de Gleason de 4/5 também mostraram significativamente menor expressão H3 phosphohistone do que os tumores resistente à castração dos adenocarcinoma ou carcinoma de pequenas células histologia (P 0,0001) (Figura 1G-1J e Tabela S2) . Dadas as muito diferentes perfis de transcrição e comportamento clínico muito mais agressiva de alta Gleason grau (graus de Gleason 4/5) cancro da próstata em comparação com baixa Gleason-grade (Gleason grau 3) cancro da próstata, os nossos dados sublinha o carácter distintivo da CRPC de todo histológica subtipos de HSPC

hematoxilina e eosina (H e). -stained secções mostrando resistente à castração adenocarcinoma (A), carcinoma de pequenas células resistente à castração (B), e carcinoma da próstata de alto grau hormono-sensível ( C). adenocarcinoma resistente à castração imunocoradas com tubulina gama (D) e p-histona H3 (L). carcinoma de células pequenas resistente à castração imunocoradas com tubulina gama (E) e H3 p-histona (H). carcinoma da próstata de alto grau hormono-sensível imunocoradas com tubulina gama (F) e H3 p-histona (I). Os asteriscos indicam um aumento significativo de rotulagem para o marcador de fase mitose H3 p-histona (J) e marcador centrosomal gama-tubulina (K) no carcinoma da próstata resistente à castração em comparação com carcinoma da próstata de alto grau sensível a hormônio.

ao estudar a fase de mitose, que também analisou a abundância centrossoma, uma vez que centrossomas são jogadores-chave na divisão celular. Gama de tubulina, um nucleador de microtúbulos e marcador de amplificação do centrossoma, mostraram um aumento significativamente rotulagem citoplasmática na doença resistente à castração quando comparado com HSPC (P 0,0001) e de alto grau de HSPC (P = 0,008) (figuras 1D-1F e 1K e Tabela S3). Esta constatação está em sintonia com o papel conhecido da amplificação centrossoma e instabilidade genética na progressão de outros cânceres [8], [9], [10], [11].

A sobre-regulação do sistema mitótico CRPC tumores com progressão para resistência à castração e resistência à quimioterapia

Nós macrodissected células tumorais que eram resistentes à castração e quimioterapia resistente a partir de amostras cirúrgicas congelados não-metastáticos localizadas de 20 pacientes originais e cinco xenotransplantes derivados (Tabela S1). transcriptomic perfis de RNA total foi realizada sobre essas amostras de tumor e cinco amostras benignas da próstata que foram utilizados para normalizar os dados de expressão. Nossa dados brutos matriz é submetido a GEO (GSE 33277). Como os nossos dados foram derivados a partir de ambos os tumores de quimioterapia-resistente resistente à castração e docetaxel terminais, comparou-se o perfil de expressão de ARNm de amostras para que estes de amostras a partir de fases anteriores de progressão do cancro da próstata. Especificamente, foram comparados os nossos dados para dados de expressão genética pública derivados de HSPC não tratada (GSE 21032, n = 108) e quimioterapia anterior CRPC (GSE 6811, n = 10). Tais meta-análises são um desafio, dadas as inúmeras variáveis ​​que podem afetar a intensidade do sinal de hibridização. Para uma comparação mais confiável, nós escolheu especificamente conjuntos de dados localizados não-metastáticos HSPC e sem quimioterapia anterior amostras, CRPC que tinha sido normalizado para os dados a partir de amostras de próstata benigno centralizadas, ou onde os dados de expressão genética de amostras benignas da próstata que permitiram essa normalização foi fornecidas . Como esperado, verificou-se a sobre-expressão de genes em fase de mitose e percursos relativos a amostras não tratadas HSPC a partir do conjunto de dados de Memorial Sloan-Kettering Cancer Center (GSE 21032). Estes resultados estão de acordo com relatórios anteriores [6], mas usam conjuntos de dados e metodologias independentes.

A Universidade de conjunto de dados Tóquio (GSE 6811) é um dos muito poucos que inclui amostras sem quimioterapia anterior CRPC. Significado de microarray análise (SAM) comparando o grupo sem quimioterapia anterior CRPC com o nosso grupo de quimioterapia resistente CRPC identificados dois conjuntos de genes informativos que consistiu de 2.490 regulada e 2.121 genes regulados negativamente no grupo quimioterapia-resistente. Pathway Analysis destes dois conjuntos de genes efectuada utilizando Engenho Pathway Analysis demonstrado que várias vias de regulação do ciclo celular foram significativamente enriquecida no conjunto de genes regulada positivamente (Figura 2A). Em particular, o grupo resistente a quimioterapia exibiram sobre-expressão significativa da via envolvida-mitose (Figura 2B), como comparado com o grupo sem quimioterapia anterior (Figura S1). Além disso, a análise de sobreposição destes dois conjuntos de genes, tal como avaliada por um modelo de distribuição hipergeométrico (Figura 2C) usando genes obtidos a partir do banco de dados MSigDB mitose de fase (fase M) (https://www.broadinstitute.org/gsea/msigdb /index.jsp), mostrou apenas uma sobreposição significativa com os genes que foram regulados positivamente no grupo quimioterapia-resistente (n = 27;

P

= 5,0 × 10

-7). Os genes regulados negativamente no grupo resistente a quimioterapia não se sobrepõem de forma significativa com os genes da fase M (n = 9;

P

= 0,416). Esta observação foi confirmada por análise de genes set-enriquecimento (AGEE; https://www.broadinstitute.org/gsea/index.jsp, Versão 3.7), que mostrou que o conjunto de genes M-fase foi significativamente enriquecida na quimioterapia-resistente grupo a uma taxa de detecção falsa (FDR) de 10% (Figura 2D). Estas análises indicam que os genes e vias associadas a mitose pode estar envolvido na mediação de resistência à quimioterapia.

(A) vias de regulação do ciclo celular são significativamente aumentado no grupo CRPC quimioterapia-resistente (TX), quando comparada com a quimioterapia CRPC grupo -naïve. (B) Análise Ingenuity Pathway. (IPA) do conjunto de genes upregulated demonstra que a via canônica de funções mitóticas de quinase polo-like é significativamente associada com o grupo quimioterapia resistente CRPC (

P

= 0,004). O

P valor

é calculada pelo teste exato de Fisher. Os genes que são regulados positivamente no grupo resistente a quimioterapia CRPC e estão envolvidas nesta via são a vermelho com código de cores. Os outros genes que estão incluídos nesta via, mas não estão no conjunto de genes regulada positivamente são indicados em branco. (Ver texto para a identificação do gene upreguated definido em detalhes). (C) sobreposição significativa do gene regulada positivamente em tumores quimioterapia definido resistente CRPC com M-fase (n = 27,

P

= 5.00E-7), em comparação com o conjunto de genes regulados negativamente (n = 9,

P

= 0,416). (D) GSEA indicou que M-Phase foi significativamente enriquecida no grupo quimioterapia resistente CRPC pelo FDR. 10%

mitótico centrômero associada kinesin está associada com a progressão para a resistência à terapia, enquanto seu silenciamento inibe o câncer de próstata crescimento celular

o exame dos reguladores mitóticas especificamente alteradas em nossos dados transcriptomic conduziram à identificação de genes que codificam para a família kinesin mitótico de proteínas motoras como sendo regulada em amostras de quimioterapia resistente CRPC. Estes kinesins mitóticas foram também regulada em outros dois grandes conjuntos de dados de quimioterapia resistente CRPC da Universidade de Michigan (GDS 1439) e Memorial Sloan Kettering Cancer Center (GSE 21032). Foi selecionado o kinesin associada ao centrômero mitótico (MCAK) como um alvo no cancro da próstata porque era novo e havia superexpressão acentuada do gene MCAK (

P

= 1,55 × 10

-15) em localizada CRPC do conjunto de dados MD Anderson Cancer Center, em comparação com casos de hormônio sensíveis cancro da próstata (n = 108) a partir do conjunto de dados Memorial Sloan Kettering Cancer Center (GSE 21032). MCAK também foi regulada com progressão para CRPC metastático dentro da coorte Memorial Sloan-Kettering Cancer Center (

P

= 3,73 × 10

-10) (Figura S2). Além disso, encontramos a expressão concordantes de MCAK em ambos os nossos tumores CRPC pai humano e xenoenxertos de murino derivadas desses tumores (

r

= 0,428), conforme mostrado na Figura S3. Nós, subsequentemente, mensuradas a expressão da proteína MCAK por análise de imuno-histoquímica de microarrays de tecido de hormônio sensível-independente (n = 38) e (n = 51) dos casos resistente à castração. Encontramos coloração citoplasmática MCAK a ser significativamente associada com a progressão clínica da doença resistente à castração (P 0,0001). (Figuras 3A-D e Tabela S4)

seções imunocoradas-MCAK de adenocarcinoma resistente à castração (A) , carcinoma resistente à castração de células pequenas (B), e carcinoma da próstata sensível a hormonas (C). D) Um aumento significativo de rotulagem para o mitótico proteína associada ao centrômero MCAK com progressão para CRPC, indicadas por asteriscos.

Para determinar os efeitos de derrubar MCAK em HSPC e CRPC, foram utilizados dois conjuntos distintos de pequeno RNA de interferência (siRNA) específico para MCAK para silenciar a sua expressão em LNCaP hormono-sensível e linhas celulares de cancro da próstata C4-2B sem quimioterapia anterior resistente à castração. Ambas as linhas celulares CRPC e HSPC mostrou a expressão da proteína MCAK intrínseca abundante e ambos mostraram inibição do crescimento ao fim de 3 dias de MCAK knockdown com a primeira siRNA (Si-MCAK # 1) tal como avaliado por um ensaio MTT (Figura 4A-D) (C4-2B : 3 d, P = 5.45 × 10

-7, 4 d, P = 4,85 × 10

-10; 5 d, P = 3,78 × 10

-8; LNCaP: 3 d, P = 1,43 × 10

-3; 4 d, P = 3,86 × 10

-5; 5 d, P = 1,48 × 10

-5). resultados semelhantes no segundo conjunto de siRNA (2 si-MCAK #) são mostrados na Figura S4.

A) Western blot confirmando knockdown de MCAK por um si-MCAK #. Os lisados ​​de células inteiras a partir de células LNCaP transfectadas com Si-controlo (C) ou Si-MCAK # 1 (M) foram recolhidas a diferentes pontos de tempo após a transfecção, como indicado. Tubulina foi utilizada como controlo de carga. B) Ensaio de crescimento celular do MTT. As células LNCaP foram tratados da mesma maneira que em a), e depois de uma 24-h transfecção, 4.000 células foram semeadas em cada poço de uma placa de 96 poços (n = 10 para cada grupo) e o ensaio de MTT foi realizado em um 24 h intervalo. C) Western blot confirmando knockdown de MCAK com si-MCAK # 1. Os lisados ​​de células inteiras a partir de células transfectadas com C4-2B Si-controlo (C) ou Si-MCAK # 1 (M) foram recolhidas a diferentes pontos de tempo após a transfecção, como indicado. Tubulina foi utilizada como controlo de carga. D) Ensaio de crescimento celular do MTT. C4-2B células foram transfectadas com controlo-Si e Si-MCAK # 1, respectivamente. Após uma transfecção de 24 h, 4.000 células foram semeadas em cada poço de uma placa de 96 poços e incubou-se durante diferentes períodos de tempo, como indicado, seguindo-se o ensaio de MTT (n = 10 para cada grupo).

Discussão

neste estudo, nós estendemos os resultados de Wang et al [6], validando, ao nível da proteína, o interruptor transcriptomic a um programa de mitose em um conjunto independente de amostras clínicas CRPC e mostrando que as diferenças entre resistentes a castração e cancros da próstata sensível a hormonas não tratada são mantidas mesmo quando comparando altas Gleason cancros grau de próstata. Este é um achado importante, atendendo aos diferentes programas transcriptomic observados em cancros da próstata com baixos e altos graus de Gleason [12], que reflicta o seu comportamento clínico dramaticamente diferentes. Também mostrámos aberrações centrosomal para ocorrem preferencialmente em CRPC, em conformidade com a divisão celular anormal visto em outros cancros avançados. Estes resultados suportam o conceito de que CRPC é biologicamente distinta e não meramente uma extensão do câncer de próstata hormônio sensível de alta qualidade, apesar de suas semelhanças histológicas e propensão para a agressividade clínica.

Ao comparar perfis transcriptomic de amostras cirúrgicas CRPC que eram sem quimioterapia anterior com os nossos dados de quimioterapia resistente CRPC, encontramos o enriquecimento de proteínas de fase mitótico e caminhos nos tumores de quimioterapia-resistente. Entre os genes relacionados com a mitose, selecionamos a família kinesin mitótico de proteínas do motor para estudar-nos ainda mais especial MCAK, que não tenha sido previamente estudada em câncer de próstata. cinesinas mitóticas são conhecidos por desempenhar um papel crucial na regulação do aparelho do fuso mitótico durante a divisão celular. Eles estão envolvidos na proliferação celular e são regulados por Aurora-B cinase [13]. Progressão do pulmão, cérebro e cancro colorrectal [14] [15] tem sido associada com a expressão aumentada de cinesina, enquanto que a sua inibição resultou em paragem do ciclo celular na fase de mitose [16], [17]. Mitótico cinesina associada-centrómero é abundante nos centrossomas, despolimeriza microtúbulos, e medeia a transição de prometáfase a metafase [18], entre outras funções essenciais relacionadas com a segregação adequada cromossoma [19] durante a divisão celular. A sobre-expressão de cinesinas mitóticas, que são postulados funcionar por contrariar o efeito de estabilização dos microtúbulos de quimioterapia baseada em taxanos, tem sido associada ao docetaxel resistência no cancro da mama [20], e MCAK sobreexpressão tem sido causalmente relacionada com a resistência paclitaxel [21].

Segmentação kinesins mitóticas está surgindo, assim, como uma modalidade de tratamento atraente em cancros que são refratários às quimioterapias baseadas em taxanos que atuam sobre o fuso mitótico, uma vez que a inibição da cinesina proteínas do motor não visam directamente os microtúbulos. Além disso, cinesinas mitóticas não são expressos pelos neurónios [22] e são substratos pobres para a bomba de efluxo de P-glicoproteína [23], que resultam em neurotoxicidade e resistência a múltiplos fármacos limitante da dose de docetaxel. Assim, a inibição kinesin mitótico é hipótese para induzir a paragem do ciclo celular específico da mitose que podem complementar protocolos quimioterápicos atuais com menos efeitos colaterais [18].

Diferentes kinesins mitóticas servem a funções específicas, bem como o papel destas proteínas na cancro da próstata só tem sido explorada com respeito ao membro mais bem estabelecida desta família, cinesina proteína fuso (KIF11 /Eg5), cujo silenciamento foi mostrado para inibir o crescimento de linhas de LNCaP e células PC3

in vitro

e

in vivo

[24], [25]. ensaios clínicos de fase precoce em pacientes com CRPC usando a primeira geração inibidor Eg5, ispinesib, tiveram um sucesso limitado [26] [27]. No entanto, mais recente geração de inibidores Eg5 foram notificados a apresentar maior eficácia

in vitro

[28], e um terceiro ensaio clínico está actualmente a recrutar pacientes a partir de uma variedade de doenças malignas, incluindo cancro da próstata resistente à castração (# NCT01065025) .

Em resumo, nós mostramos o enriquecimento de vias de fase mitose e proteínas como o câncer de próstata progride para tanto um estado resistente à castração e quimioterapia-resistente. Foi examinado o papel de MCAK, pela primeira vez no cancro da próstata e mostraram que a expressão MCAK se correlaciona com a progressão clínica da doença. Além disso, foi demonstrado a inibição do crescimento em linhas de células de próstata resistente à castração silenciados-MCAK. Em conjunto, os nossos resultados sugerem que MCAK é uma proteína funcionalmente importante no cancro da próstata terminal. Estudos de acompanhamento com base no presente relatório deverá incluir o uso de inibidores sintéticos contra MCAK (por exemplo, a patente # 7.294.640, Merck) em modelos pré-clínicos e em futuros ensaios clínicos de câncer de próstata.

Materiais e Métodos

Ética declaração

hormônio sensível e amostras de tecido de câncer de próstata resistente à castração foram obtidos com a aprovação da dos conselhos de revisão institucional da Universidade do Texas MD Anderson Cancer Center (Houston, Texas) e da Universidade McGill (Montreal, QC, Canadá). As amostras de tecido usados ​​para desenvolver MDA CaP 79, MDA CaP 117-9, MDA CaP 124, MDA CaP 130, MDA CaP 149-1, e MDA CaP 180-30 xenoenxertos foram derivadas de amostras de tumores de espécimes cirúrgicos (cistoprostatectomia, prostatectomia radical ou exenteração pélvica) de um câncer de próstata resistente à castração primária progressiva. consentimento informado por escrito haviam sido obtidas de pacientes antes da aquisição da amostra, e as amostras foram processadas de acordo com um protocolo aprovado pelo MD Anderson conselho de revisão institucional, incluindo a aprovação do comitê de cuidados com os animais e utilização. Os números de protocolo laboratório que cobriam o uso dessas amostras são MDACC LAB 03-0336 e 09-0213 LAB.

amostras de tecido de pacientes

tecidos Molecularly perfilados foram derivadas de amostras de tumores congelados MD Anderson de pacientes com cancro e quimioterapia castração-resistente próstata (n = 20) e de controlos de tecido benigna da próstata (n = 5). As amostras de quimioterapia resistente resistente à castração foram retirados de cystoprostatectomies de salvamento ou exenterations pélvicos. xenoenxertos de murino derivadas de cinco destes 20 tumores mostrando adenocarcinoma histologia foram também avaliadas. Os dados clínicos das amostras genomicamente perfilados estão incluídos na Tabela S1. Quatro microarrays de tecido foram utilizados para validar dados genômicos e consistiu em amostras embebidos em parafina fixadas em formalina a partir de 58 pacientes com HSPC e 51 pacientes com CRPC.

perfil de expressão e análise

mRNA Tumor expressão era avaliada utilizando um kit de todo o genoma humano oligonucleótido de microarray da Agilent (Prod # G4112F) de acordo com o protocolo do fabricante e como descrito anteriormente [29]. Nossos dados CRPC foi normalizada para os valores médios de expressão genética de cinco amostras benignas da próstata para encontrar genes regulados positivamente ou regulados negativamente usando um valor da relação log 0,3 como ponto de corte para genes informativos presente em mais de dois terços dos casos. Nós comparamos o nosso perfil de expressão de dados para a Universidade de Michigan (GDS 1439), da Universidade de Tóquio (IGE 6811) e Memorial Sloan Kettering Cancer Center (GSE 21032) conjuntos de dados. Para estes conjuntos de dados, normalização foi realizada contra os seus controles internos (amostras benignos).

A análise imunohistoquímica

Padrão 3,3′-diaminobenzidina (DAB) imuno-histoquímica de microarrays de tecido foram realizadas com um Dako Além disso Autostainer (Dako), utilizando um rato anti-humana anticorpo monoclonal MCAK (Abgent AT2621a) na diluição de 1:50, um anticorpo fosfo-histoneH3 (Santa Cruz SC-8656) em 1:100 diluição, e um anticorpo gama-tubulina (Abcam AB27074) em 1:400 diluição, tal como descrito anteriormente [30]. A coloração para gama-tubulina e MCAK foi avaliada manualmente através da atribuição de um valor positivo por cento, para cada caso, com base na imunohistoquímica agregado de todos os núcleos de tecido que pertencem a esse caso.

imagem Automated análise

A phosphohistone núcleos H3-positivos foram avaliados quantitativamente usando análise de imagem automatizada com software Ariol de Imagiologia Aplicada (Genetix Ltd.). A, algoritmo de quantificação nuclear automatizada feitos sob medida usando o software Ariol foi elaborado com base nas variações de cor da mancha marrom nas células DAB-positiva em relação ao fundo negativo hematoxilina nuclear para atingir um por cento positivo por área pré-selecionada de representação em cada slide .

cultura celular

C4-2B células depositado no MD Anderson foram desenvolvidos após passagem em série de células LNCaP em hospedeiros castrados quando as células não eram mais responsiva à manipulação de andrógenos em animais (PMID: 8168083 ). As células LNCaP foram obtidas de American Type Culture Collection (Manassas, VA, EUA). Ambas as linhas celulares foram cultivadas em meio RPMI1640 suplementado com soro fetal bovino a 10%, a 37 ° C com uma atmosfera de 5% de CO

2.

estudos de xenoenxerto

As amostras de tecido utilizadas para desenvolver o MDA CaP 79, MDA CaP 117-9, MDA CaP 124, MDA CaP 130 e MDA CaP 149-1 xenoenxertos foram tecidos residuais de ressecção cirúrgica (cistoprostatectomia ou exenteração pélvica) da CRPC primária progressiva. peças tumorais pequenas foram implantados em bolsos subcutâneas de machos de 6 a 8 semanas de idade camundongos CB17 SCID (Charles River Laboratories). Desenvolveram tumores no prazo de 6 meses e foram mantidas nos ratinhos, como as células não poderiam ser cultivadas

In vitro

. Os métodos de transformação e de passagem de tumor utilizadas foram as mesmas que aquelas relatadas anteriormente (PMID: 18618013).

transfecção SiRNA

O ou células LNCaP C4-2B foram semeadas em uma placa de 6 poços a uma densidade de 5 x 10

4 células /poço e cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% FBS sob condições de cultura de tecidos normais. Após 20-24 h de incubação, siARN transfecção foi realizada utilizando o Reagente LipofectamineRNAiMax da Invitrogen (Invitrogen, Cat # 56532), seguindo o protocolo do fabricante. Dois conjuntos de Si-MCAK siRNA foram usadas para as experiências. SI-MCAK # 1 foi comprado de Ambion (Ambion, cat # 4390824) e o Si-MCAK # 2 foi adquirido a partir de Dharmacon (Chicago, IL, EUA, cat # L-004955-00). O Universal controlo negativo # 1 ARNip a partir de Sigma (Cat # SIC-001) foi utilizada como um controlo. A concentração final do siARN foi de 50 nM.

A análise Western blot foi obtido

anticorpo monoclonal

MCAK de Abgent (Cat # AT2621a) e ambos β-actina (Cat # SC-1616) e β-tubulina (cat # SC-9104) foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EUA). Western blot foi realizada tal como descrito [31]. Resumidamente, os extractos celulares contendo 30 ug de proteína foram separadas por 10% de electroforese SDS-PAGE, transferidos para membranas Hybond ECL de nitrocelulose (Amersham Pharmacia Biotech) ou membranas de fluoreto de polivinilideno (Cat # IPVH20200) da Millipore (Millipore Corporation, Cat. # IPVH20200) , bloqueadas em 5% de leite desnatado em 1 × solução salina tamponada com Tris mais 0,05% de Tween-20 (pH 8,0) e sondadas com anticorpos primários em concentrações de 1:1000 para MCAK e 1:2500 para β-actina ou β-tubulina. Os anticorpos secundários foram utilizados a concentrações de 1:10,000. As proteínas foram visualizadas utilizando o SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Prod # 34708) ou SuperSignal Oeste Femto sensibilidade máxima de substrato (Prod # 34096) de Pierce (Pierce Chemical, Rockford, IL, EUA).

ensaios de proliferação celular

a proliferação celular foi determinada por um ensaio MTT de absorvância. As células transfectadas com ARNsi de controlo (SI-controlo) ou MCAK siRNA (Si-MCAK) foram tripsinizadas a partir das placas às 24 h após a transfecção e 4000 células em 200 ul de meio completo foram semeadas em cada poço de uma placa de 96 poços ( n = 10). As células foram deixadas a aderir durante 24 h em meio completo, e o ensaio de MTT foi realizado a intervalos de 24 h, subsequentemente. Depois de 2,5 h de incubação com 50 uM de reagente MTT, em condições normais de cultura de células, os poços foram esvaziados por aspiração de vácuo, e 200 ul de DMSO foi adicionado a cada poço. A absorvância foi medida a 590 nm com um leitor de microplacas. (MRX; Danatech Laboratório)

A análise estatística

Os dados são expressos como a média +/- D.P. As análises estatísticas foram realizadas utilizando

t

-teste e o posto de soma Wilcoxon teste de Student. As diferenças de médias foram avaliadas utilizando um bicaudal

t

-teste, assumindo variâncias desiguais. A value≤0.05 P foi considerado estatisticamente significativo.

Informações de Apoio

Figura S1. vias

mitoses não estão associados com o gene regulada negativamente fixado na quimioterapia de doença resistente a CRPC. Ingenuity Pathway Analysis (IPA) do conjunto de genes regulados negativamente mostra que a via canônica de funções mitóticas de quinase polo-like não é significativamente associada com o grupo quimioterapia resistente CRPC (

P

= 0,16). O

P valor

é calculada pelo teste exato de Fisher. Os genes que são regulados negativamente no grupo quimioterapia resistente CRPC e estão envolvidos nesta via estão em verde com código de cores. Os outros genes que estão incluídos nesta via, mas não estão incluídos no conjunto de genes regulados negativamente são indicadas em branco

doi:. 10.1371 /journal.pone.0031259.s001

(TIF)

Figura S2.

Aumento dos níveis de transcrição MCAK com progressão para CRPC. (A) MCAK mostra upregulation transcriptomic no CRPC localizada (

P

= 1,55 × 10

-15) e (B) CRPC metastático (

P

= 3,73 × 10

– 10) em comparação com HSPC

doi:. 10.1371 /journal.pone.0031259.s002

(TIF)

Figura S3.

Concordância da expressão do gene MCAK entre xenotransplantes CRPC rato (MDA-79, MDA-117, MDA-130, MDA-149) e seus tumores pai humanos correspondentes (

r

= 0,428).

doi: 10.1371 /journal.pone.0031259.s003

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Figura S4. inibição

Crescimento de LNCaP e as células C4-2B por si-MCAK # 2. A) Western blot confirmando knockdown de MCAK por si-MCAK # 2. Os lisados ​​de células inteiras a partir de células LNCaP transfectadas com Si-controlo (C) ou Si-MCAK # 2 (M) foram recolhidas a diferentes pontos de tempo após a transfecção, como indicado. Actina foi utilizado como controlo de carga. ensaios de crescimento de células B) MTT. As células LNCaP foram tratados da mesma maneira que em a), e após 24 h a transfecção, 4.000 células foram semeadas em cada poço de uma placa de 96 poços (n = 6 para cada grupo) e seguido pelo ensaio de MTT. C) Western blot confirmando knockdown de MCAK com si-MCAK # 2. Os lisados ​​de células inteiras a partir de células transfectadas com C4-2B Si-controlo (C) ou Si-MCAK # 2 (M) foram recolhidas a diferentes pontos de tempo após a transfecção, como indicado. Actina foi utilizado como controlo de carga. * Indica as bandas não específicas. D) Ensaios de crescimento celular do MTT. C4-2B células foram transfectadas com controlo-Si e Si-MCAK # 2, respectivamente. Após uma transfecção de 24 h, 4.000 células foram semeadas em cada poço de uma placa de 96 poços e incubou-se durante diferentes períodos de tempo, como indicado, seguindo-se o ensaio de MTT (n = 5 para cada grupo)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0031259.s004

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Tabela S1.

Abreviaturas: CXPX – cistoprostatectomia; PE – exenteração pélvica; RTU – ressecção transuretral; TAB – bloqueio total de andrógeno (Lupron + Casodex); LHRH – Lupron; ORCH – orquiectomia bilateral; XRT – terapia de radiação. * Componente de carcinoma de pequenas células foi perfilado de um pequeno tumor histologia mista de células /adenocarcinoma

doi:. 10.1371 /journal.pone.0031259.s005

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Tabela S2.