Abstract

Fundo

Estudos recentes do genoma identificaram um locus de risco para o cancro colorectal em 18q21, que mapeia para o

gene SMAD7

. Nosso objetivo foi confirmar a associação entre

SMAD7

SNPs e risco de câncer colorretal no cólon multi-center Registro Familiar do Câncer.

Materiais e Métodos

23 SNPs marcação no

gene SMAD7

foram genotipados entre 1.592 famílias baseadas na clínica de base populacional e 253. As associações de câncer SNP-colorretais foram avaliadas em regressão logística multivariada

Resultados

Entre as famílias de base populacional, ambos SNPs rs12953717 (odds ratio, 1,29;. 95% de intervalo de confiança, 1.12- 1,49), e rs11874392 (odds ratio, 0,80; intervalo de confiança de 95%, 0,70-0,92) foram associados com risco de câncer colorretal. Estas associações foram semelhantes entre os populacional e as famílias baseadas na clínica, embora eles foram significativas apenas entre os primeiros. diferenças marginalmente significativas nas associações de câncer SNP-colorretal foram observadas por uso de drogas não esteróides anti-inflamatórios, tabagismo, índice de massa corporal e história de pólipos.

Conclusões

SMAD7

SNPs foram associados com o risco de câncer colorretal no cólon Registro Familiar do câncer. Não havia evidências que sugerem que a associação entre rs12953717 eo risco de câncer colorretal pode ser modificado por fatores como tabagismo e uso de drogas anti-inflamatórias não esteróides

Citation:. Jiang X, Castelao JE, Vandenberg D, Carracedo A, Redondo CM, DV Conti, et al. (2013) Variações genéticas em

SMAD7

está relacionado com Colorectal Cancer Risk no cólon Registro Familiar do Câncer. PLoS ONE 8 (4): e60464. doi: 10.1371 /journal.pone.0060464

editor: Amanda Ewart Toland, Ohio State University Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 20 de novembro de 2012; Aceito: 26 de fevereiro de 2013; Publicação: 03 de abril de 2013

Direitos de autor: © 2013 Jiang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo National Cancer Institute, National Institutes of Health, conceda # 5R01CA114472-02 e RFA # CA-95-011 e através de acordos de cooperação com os membros do Colon Registro Familiar Câncer e PIs: o registro familiar de câncer colorretal Australasian (U01 CA097735) ; a University of Southern California Familial Colorectal Neoplasia Collaborative Group (U01 CA074799); Registro Cooperativa Família Mayo Clinic de Estudos cancro do cólon (U01 CA074800); Registro Ontário de Estudos de Familial Câncer Colorretal (U01 CA074783); o Seattle Colorectal Registro Familiar Câncer (U01 CA074794); Universidade do Havaí Colorectal Registro Familiar Câncer (U01 CA074806); da Universidade da Califórnia, Irvine Centro de Informática (U01 CA078296); FIS PI12 /02125 Acción Estratégica de Salud del Instituto de Salud Carlos III; FIS Intrasalud (PS09 /02368); e da Fundação Botin. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Comentário do Editor de interesses concorrentes do Dr. John Baron: Dr. John Baron é um consultor a Bayer, e detém uma patente uso para o uso quimiopreventivo de aspirina com o Dartmouth College – “composições e métodos para prevenir Neoplasia esporádicos em Colon”, patente US no: 7.691.833, 6 de abril de 2010. Isso não altera a adesão dos autores a todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

Estima-se que a susceptibilidade herdada contribui para ~ 35% de todos os casos de câncer colorretal (CRC) [1]. O progresso recente através da aplicação de estudo de associação genômica ampla (GWASs) identificaram uma série de variantes comuns envolvidos na etiologia da CRC [2]. Dois GWAS [3], [4] identificaram um locus de risco para CRC em 18q21, que mapeia para

SMAD7

, um gene candidato funcional para CRC. Smad7 desempenha funções inibidoras do factor beta de crescimento de transformação (TGF-p) via de sinalização [5], [6], que está envolvida em muitos processos celulares e desempenha um papel importante no desenvolvimento e progressão do cancro [7]. Broderick et ai. [3] identificou três SNPs (rs4939827, rs12953717, rs4464148) em

SMAD7

associado com CRC e os rs4939827 SNP depois foi replicado como o escalão superior SNP em 18q21 por Tenesa et al. [4]. A associação entre rs4939827 e risco de CRC também foi confirmada em uma recente meta-análise [8]; No entanto, observou-se heterogeneidade significativa entre os estudos. Além disso, estas variantes de susceptibilidade foram encontrados para ser enriquecido em CRC familiar [9], [10]. Além disso,

SMAD7

expressão foi encontrado para ser menor em câncer colorretal do que em adenomas independentemente do 18q status de número de cópias [11] e do alelo de risco em rs12953717 foi significativamente associada com menor

expressão SMAD7

em linhas de células linfoblastóides [3], sugerindo que a expressão específica de alelo de

SMAD7

é provável que seja o mecanismo biológico subjacente à associação entre variações em 18q21 e o risco de CRC.

Dado o papel da SMAD7 em a via de sinalização TGF-β [12] ea significativa heterogeneidade entre estudo na associação relatada entre SMAD7 SNPs e risco de CRC, nós olhamos para confirmar a associação entre o

SMAD7

SNPs e risco de CRC em um grande família- estudo caso-controle com base com base na Colon multi-center Registro de Câncer Família (Colon CFR), e para examinar genes X interacções ambientais para identificar risco /fatores de proteção que podem afetar a associação entre SMAD7 SNPs e risco de CRC. Nosso desenho do estudo irmão caso não afetada foi mostrado para ser mais poderoso para controlar o efeito de confusão estratificação populacional e detectar interações gene-ambiente [13].

Materiais e Métodos

População do estudo

os dados para este estudo foram obtidos através da Colon CFR, um National Cancer Institute (NCI) registro -funded de casos de CRC, familiares não afectados, e os controles de base populacional. O registo é descrito em detalhe em Newcomb et al. [14] e Levine et ai. [15]. Resumidamente, o Colon CFR é um estudo colaborativo internacional, iniciada em 1997. Os participantes foram recrutados a partir de seis centros, incluindo centros na University of Southern California Consortium (Arizona, Cleveland Clinic, Colorado, Dartmouth, Minnesota, Carolina do Norte, e University of Southern California) , Havaí (Honolulu), Fred Hutchinson Cancer Research Center (Seattle, WA), Clínica Mayo (Rochester, MN), Cancer Care Ontario (Toronto, Canadá) e Universidade de Melbourne (Victoria, Austrália) usando de base populacional e clinic- estratégias de apuração base. Os casos foram recrutados em duas fases, de 1998 a 2002 (fase 1) e 2002-2007 (fase 2). Fase 2 indivíduos foram enriquecidos em casos mais susceptíveis de ter um histórico familiar de CRC. Todos os centros exceto Fred Hutchinson Cancer Research Center sobre-amostrado casos com vários parentes de primeiro grau relatando casos de CRC ou CRC diagnosticados menos de 50 anos para atingir famílias com excesso de risco CRC. De primeiro grau e alguns parentes de segundo grau com CRC também foram recrutados de famílias com vários casos de CRC. A amostra baseada em clínica representa famílias de casos múltiplos com alto risco de hereditário não-polipose câncer colorretal ou outros fenótipos CRC familiares.

No Colon CFR, controles populacionais só foram obtidos a partir de um dos Colon CFR locais (Fred Hutchinson Câncer Research Center), e o tamanho total da amostra (N = 429) é muito menor do que a dos controlos irmãos (N = 3,115). Para aproveitar ao máximo o uso dos dados genéticos disponíveis, nesta investigação foi utilizado um design de caso /inalterado o controle irmão [13] com os dados de ambas as famílias de base populacional e em clínicas em análises o efeito principal. Casos eram probandos e irmãos diagnosticados com CRC e os controles eram irmãos sem CRC, no momento da apuração. Diagnóstico de CRC foi baseada nas seis categorias de confirmação seguintes [14]: revisão patologista de lâminas; análise do relatório de patologia; relatório de registro de câncer ou registro (s) médico que indique o tratamento para o tipo específico de câncer; informar sobre uma certidão de óbito; auto-relato; e relatar por um parente. Portanto, o status afetado dos irmãos não foi estabelecida através de colonoscopia. Todos os casos foram entrevistados dentro de 5 anos de diagnóstico (76% dentro de 2 anos). Havia também alguns pares caso /controle baseados em clínica para análise estratificada para que todas as análises estratificadas usadas apenas as famílias de base populacional. Foram excluídos os gêmeos monozigóticos e indivíduos com idade desconhecida ou sexo, e incluíram apenas indivíduos brancos não-hispânicos. Além disso, nós também genotipados um conjunto aleatório de controles populacionais independentes (

n

= 429) a partir de um dos sites CFR Colon (Fred Hutchinson Cancer Research Center). Um total de 1.923 casos (1.640 base populacional e 283-clínica com base) seus 3.115 controles irmãos não afetados e (2.621 de base populacional e 494 numa clínica) foram incluídos nas análises.

Ética

Todos os sujeitos assinaram um consentimento informado antes de fornecer dados para o CFR Colon. Aprovação ética para o estudo foi obtido a partir dos Conselhos de Revisão Institucional em cada local CCFR: University of Southern California Ciências da Saúde Institutional Review Board, Mount Sinai Hospital de Ética em Pesquisa Board, Universidade do Havaí Institutional Review Board, The University of Comitê de Ética Melbourne Central Pesquisa em Seres Humanos , Fred Hutchinson Cancer Research Center Institutional Review Board, e Mayo Clinic Institutional Review Board.

SNP Seleção e genotipagem

SMAD7

foi genotipados como parte de um estudo em curso de genes relevantes para a peroxidação lipídica e apoptose (5R01CA114472-02). Marcação de polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) foram selecionados usando o programa Snagger20 [16] para cobrir todos os SNPs com uma frequência menor alelo (MAF) de ≥0.05 ou superior com um r pairwise

2 de ≥0.80 na região que abrange cada gene de interesse, bem como 20 kb a montante e 10 kb a jusante do gene. Os blocos de desequilíbrio de ligação foram determinadas usando dados do HapMap Projeto Branco CEPH Internacional (residentes de Utah com ascendência da Europa setentrional e ocidental) população (HapMap, liberar 21, Julho de 2006; www.hapmap.org). Finalmente, três SNPs GWAS-identificados, rs4939827, rs12953717, rs4464148, também foram incluídos. SNPs foram genotipados na plataforma Illumina GoldenGate (Illumina, Inc., San Diego, CA) [17] na University of Southern California, Norris Comprehensive Cancer Center, instalação Molecular Genomics Core, utilizando DNA extraído de amostras de sangue [14]. medidas de controle de qualidade incluiu testes de desvios de Hardy-Weinberg (HWE) em brancos não-hispânicos, a inclusão de interplaca cego e repetições intraplaca, e misturando casos e controles em placas de genotipagem. SNPs foram excluídos da análise, se houvesse mais do que dois erros sobre os genótipos em replicado. rs4939827 marcador falhou na plataforma Ilumina e foi subsequentemente excluído. Nesta análise, nós relatamos resultados para 23 tSNPs em

SMAD7

. Um total de 133 pares duplicados cegos foram incluídos para genotipagem. Concordância para as amostras duplicadas foi 99%

microssatélites Instabilidade Testando

Todos os tumores disponíveis a partir do cólon Jeremy Jass Memorial patologia Banco do CFR foram ensaiadas para a instabilidade nas 10 microssatélites seguintes:. BAT25, BAT26, BAT40, BAT34C4, D5S346, D17S250, D18S55, D10S197, ACTC, e MYCL como descrito anteriormente [14]. Apenas os pacientes com resultados claros para pelo menos quatro marcadores foram incluídos. A instabilidade de microssatélites (MSI) de dados estavam disponíveis para 1.242 (64,4%) dos casos (1.106 de base populacional e 136-clínica com base). A instabilidade em 30% dos loci testado foi definida como a instabilidade microssatélite alta (MSI-H); instabilidade at 10% dos loci, mas 30% dos loci foi definida como instabilidade de microssatélites baixa (MSI-L); e aqueles com a instabilidade 0 loci foram categorizados como microssatélites estável (MSS).

Localização tumoral

localização do tumor foi obtido a partir do relatório da patologia e estava disponível para 1778 (92,1%) de casos ( 1.566 base populacional e de base clínica 212). cólon direito foi definida como o ceco através da flexão do baço; cólon esquerdo incluído no cólon descendente através do cólon sigmóide; tumores do reto incluiu a junção retossigmóide e reto.

Análise Estatística

Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando a linguagem de programação R e SAS v9.1 (SAS Institute Inc., Cary, NC).

MAF foi estimada a partir dos dados de genótipos de controles populacionais não relacionados. desequilíbrio de ligação em pares entre SNPs foi estimada utilizando o quadrado do coeficiente de correlação (

R

2) e D-prime (D ‘) entre os marcadores. Também avaliamos Hardy-Weinberg para cada SNP. Sem desvios foram observados para todos os SNPs, excepto rs1873190. Entre os controles populacionais não relacionados, estatisticamente significativas redução do número de genótipos heterozigotos de rs1873190; foram observados (155 observada vs. 186 esperada sob HWE P exata = 0,0006). Os dados de genotipagem deste SNP mostrou separação genótipo clara com uma taxa de chamada de 98% e de concordância taxas de 100% entre as repetições.

Na análise dos efeitos principais, os dados baseados em clínica populacional e foram analisados ​​separadamente . Foi utilizada a regressão logística condicional multivariada com fratria como o fator de harmonização e controlado para a idade (contínua) e sexo. Foram avaliadas as associações SNP-CRC assumindo um modelo log-aditivo. Em todas as análises, o alelo menor frequência foi codificado como o alelo “risco” e os indivíduos foram atribuídos um 0, 1, ou 2 que representa o número de alelos de risco que possuíam para que SNP. Teste para a associação haplotípica foi realizada utilizando SAS /Genética e frequências de haplótipos foram estimados pelo algoritmo de Maximização da Expectação.

Entre as famílias baseadas na população, também examinámos a possibilidade de que a associação de SNP-CRC foi alterado por outra fatores, incluindo sexo, idade, uso de drogas não esteróides anti-inflamatórios não esteróides (AINE), tabagismo, consumo de álcool, índice de massa corporal (IMC), atividade física (média equivalente metabólico semanal (MET) horas de atividade física durante a vida adulta), história de diabetes, pólipos, e colite ulcerativa, e história familiar de CRC em um parente de primeiro grau, conforme relatado pelo probando. Todas as análises dentro dos estratos exposição foram especificados antecipadamente com base em indicações de potencial modificação de efeito na literatura. Para testar esta hipótese, variáveis ​​dummy representando exposição específica de cada estrato foram criados para estimar os resultados específicos de estrato em um modelo de regressão logística condicional única. Os valores P para interações foram estimados a partir de testes de razão de verossimilhança. Avaliamos também diferenças na associação por localização do tumor (direita, esquerda, reto /junção retossigmóide) e estado MSI (MSS, MSI-L e MSI-H) estratificando os conjuntos combinados sobre as características do tumor do caso. Nós atribuímos os conjuntos do MSI ou categoria tumor local do caso e incluiu termos de interação nos modelos de regressão logística condicional para estimar estes odds ratio específicas do estrato. Finalmente, consideramos se a inclusão de casos recrutados 2 anos após o diagnóstico resultou em estimativas tendenciosas e os resultados eram fundamentalmente inalterado após a exclusão desses casos (dados não mostrados)

Resultados

Tabela 1. mostra as características demográficas da população do estudo. Um total de 1.854 sibships foram incluídos neste estudo. Entre os participantes, 1.640 casos e 2.621 controles foram de base populacional e 283 casos e 494 controles foram baseados em clínica. Os dados para o local do tumor e do estado MSI estavam disponíveis para 1.778 casos e 1.242 casos, respectivamente.

Os resultados da análise SNP única são apresentados na Tabela 2. Os SNPs foram classificadas de acordo com sua posição no cromossomo 18. Supondo um modelo log-aditivo, um total de sete SNPs tinha um valor P inferior a 0,05; após a correção de Bonferroni para o número de SNPs testados no

SMAD7

gene, apenas dois SNPs, rs11874392 e rs12953717, permaneceu significativamente associada com o risco CRC entre as famílias de base populacional. Cada alelo menor (T) do SNP rs12953717 foi associado com um aumento significativo do risco de CRC (odds ratio-OR, 1,29; 95% de intervalo de confiança-CI, 1,12-1,49), enquanto que cada um alelo menor (T) de rs11874392 foi associada com um risco estatisticamente significativamente reduzido de CRC (OR, 0,80; 95% CI, 0,70-0,92). Estas associações foram semelhantes entre as famílias de base populacional e as famílias baseadas na clínica, embora eles só foram significativas entre as famílias de base populacional com seu tamanho de amostra maior. Os dois SNPs foram altamente correlacionados entre si (D ‘, 0.999; R

2, 0,661). Em uma análise de regressão logística, a inclusão de rs11874392 não melhorou significativamente o ajuste do modelo sobre isso com rs12953717 sozinho (P = 0,88). Análise de rs12953717 e rs11874392 revelou que CT e TA foram os haplótipos mais comuns (Tabela 3) e apenas TA foi associado com maior risco de CRC (P = 9,0 × 10

-5). Haplótipo CA não foi associada a risco de CRC (P = 0,53). Não foram observadas associações significativas para o SNP rs4464148 ou outros SNPs avaliados em

SMAD7

após o ajuste para testes múltiplos.

Entre as famílias de base populacional, avaliou a associação entre rs12953717 e risco de CRC após estratificação por risco relacionados /fatores de proteção (Tabela 4). Observamos diferenças modestas e marginalmente significativas na associação da doença pelo uso de AINEs, tabagismo, IMC e história de pólipos. As associações mais fortes foram observados entre os usuários atuais AINE, não /ex-fumantes, os indivíduos com excesso de peso (25≤BMI 30) e indivíduos com diagnóstico prévio de pólipos, respectivamente. Não houve diferenças estatisticamente significativas na associação SNP-CRC de acordo com sexo, idade, consumo de álcool, atividade física, diabetes, e colite ulcerativa. O efeito da rs12953717 parecia ser mais forte entre os indivíduos sem uma história familiar de CRC do que entre aqueles com história familiar; no entanto, essa diferença não foi estatisticamente significativa (P = 0,39). Quando a associação entre rs11874392 e risco de CRC foi examinado, não foram observadas diferenças semelhantes, mas menos pronunciadas pelos fatores acima.

Nós também analisou a possível heterogeneidade do efeito SNP pela localização do tumor e do estado MSI ( tabela 5). Foram observadas as associações mais fortes para câncer de cólon distal e MSI-L /tumores MSI-H do que para outros tumores; No entanto, nem diferença foi estatisticamente significativa.

Para abordar viés de sobrevivência potencial devido à inclusão de casos entrevistados até 5 anos após o diagnóstico, que repetiu as análises dos efeitos principais, incluindo apenas probands entrevistados dentro de 2 anos de diagnóstico e seus irmãos não afetados e os resultados eram fundamentalmente inalterados (dados não mostrados).

Discussão

de acordo com os dois GWAS [3], [4], encontramos uma associação estatisticamente significativa entre dois

SMAD7

polimorfismos, rs12953717 e rs11874392 e CRC neste grande estudo de caso-controle de base familiar. Observamos as sugestões de que a associação de rs12953717 e risco de CRC podem ser modificados pelo uso de AINEs, tabagismo, IMC e história de pólipos.

A variante causal subjacente para a associação entre 18q21 variação e risco CRC permanece desconhecida. Pittman et ai. [11] relatou que um C a G SNP em 44.703.563 bp, um SNP em forte desequilíbrio de ligação com outras variações genéticas em torno 18q21, pode ser a variante funcional responsável pela 18q21-associados variações no risco de CRC através diferencial

SMAD7

expressão e subsequente sinalização de TGF-β. Em comparação com o alelo C, o alelo de risco L forma complexos mais fracas proteína-ADN com extractos nucleares e foi associada com uma expressão reduzida de

SMAD7

na colorectum. No entanto, ainda não está claro como essas alterações podem promover a carcinogênese. Tem sido sugerido que

SMAD7

pode induzir tumorigenicidade por bloqueio da inibição do crescimento induzida por TGF-β e apoptose [18]. A expressão de

SMAD7

é muito baixa em tecidos epiteliais, mas é sobre-regulada em vários tipos de câncer. A sobre-expressão de

SMAD7

foi mostrado para inibir a indução de TGF-β-mediada de heme oxigenase-1 endógeno (

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