Abstract

TRAIL é um agente terapêutico promissor para tumores malignos humanos. TRAIL, muitas vezes requer a disfunção mitocondrial, referida como a via do receptor de morte de Tipo II, para promover a citotoxicidade. No entanto, numerosas células malignas são resistentes a LIART, devido a inibição desta via mitocondrial. Usando células colangiocarcinoma como um modelo de resistência TRAIL, verificou-se que o bloqueio de sinalização Hedgehog sensibilizados estas células cancerosas para TRAIL citotoxicidade independente da disfunção mitocondrial, referidos como Tipo I de sinalização de receptor de morte. Esta mudança na exigência de TRAIL de Tipo II para tipo sinalização do receptor I de morte foi demonstrado pela falta de dependência funcional em Bid /Bim e Bax /Bak, componentes pró-apoptóticos da via mitocondrial. a sinalização de hedgehog modulada a expressão de inibidor ligada ao X de apoptose (XIAP), que serve para reprimir a via do receptor de morte Tipo I. siRNA alvo knockdown de

XIAP

imita sensibilização a morte TRAIL independente de mitocôndrias alcançado pela inibição Hedgehog. A regulação da expressão de XIAP de sinalização Hedgehog é mediada pelo oncogene relacionado glioma-2 (Gli2), um factor de transcrição a jusante de Hedgehog. Em conclusão, estes dados fornecem mecanismos adicionais que modulam a morte celular por TRAIL e sugerir inibição Hedgehog como uma abordagem terapêutica para neoplasias TRAIL-resistentes

Citation:. Kurita S, Mott JL, Cazanave SC, Fingas CD, Guicciardi ME, Bronk SF, et ai. (2011) Hedgehog Inibição Promove a Conversão de Tipo II Tipo I Cell Death Receptor Signaling em células cancerosas. PLoS ONE 6 (3): e18330. doi: 10.1371 /journal.pone.0018330

editor: Andreas Bergmann, da Universidade do Texas MD Anderson Cancer Center, Estados Unidos da América

Recebido: 04 de janeiro de 2011; Aceito: 25 de fevereiro de 2011; Publicado: 31 Março 2011 |

Direitos de autor: © 2011 Kurita et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health R01 Grants DK59427 (GJG), Divisão de Oncologia Research, Mayo Clinic Cancer Center, Mayo Clinic pâncreas SPORE P50 CA102701, e Mayo Clinic Center for Cell Signaling em Gastroenterologia NIDDK DK084567 P30 (MEF-Z) eo Fundação Mayo. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

de necrose tumoral relacionada factor de indução de apoptose ligando-(TRAIL), ligando uma morte potente que preferencialmente induz a apoptose em células transformadas, inicia a cascata de sinalização através da ligação de dois receptores de morte, DR4 (TNFRSF10A, também referidos como receptor de TRAIL 1) e DR5 (TNFRSF10B, também referido como receptor TRAIL 2 /KILLER /TRICK-2) [1]. agrupamento induzida por TRAIL e oligomerização de DR4 e DR5 resulta em alterações conformacionais dos domínios de morte dentro de suas caudas citoplasmáticas, facilitando o recrutamento e activação de caspases 8 e 10 dentro de uma morte induzir sinalização complexo (DISCO) [2], [3], [ ,,,0],4]. Se a activação destas caspases iniciadoras é suficientemente robusta, activam directamente caspase 3, que por sua vez resulta em morte celular por o chamado tipo I via do receptor de morte de apoptose [5], [6]. No entanto, se a magnitude da caspase 8 e 10 de activação não é suficiente para activar directamente a caspase 3, ainda TRAIL podem induzir apoptose através de clivagem da proteína de BH3 somente proapoptótica Bid para gerar truncada Bid (tBID). proteína tBid desencadeia a permeabilização da membrana exterior mitocondrial, promovendo a oligomerização de proteínas da família Bcl-2 pró-apoptóticos Bak e /ou Bax dentro desta membrana. Mitocondrial externa resultados permeabilização da membrana em egresso de proteínas pró-apoptóticas do espaço intermembranar mitocondrial (isto é, o citocromo c, Smac /DIABLO, HtrA2, FIA, e a endonuclease G), que culmina com a via mitocondrial da apoptose [7], [8 ]; a dependência de disfunção mitocondrial para a morte celular é referida como a via do receptor de morte Tipo II da apoptose [6]. sinalização do receptor de tipo I morte parece ser regulada ao nível de caspase 3-activação, enquanto que o tipo II, a sinalização do receptor de morte é regulada ao nível das mitocôndrias por membros da família de proteínas anti-apoptótico Bcl-2 [7], [8], [ ,,,0],9], [10]. TRAIL geralmente sinais através do Tipo II, via dependente de mitocôndrias [11], um caminho que é frequentemente inibida em cancros que resultam em resistência LIART [12], [13].

Aqui, demonstramos que a inibição da oncogênico via Hedgehog reprime a expressão de XIAP e sensibiliza células cancerosas a citotoxicidade TRAIL, usando células colangiocarcinoma como um modelo para estudar a resistência TRAIL. Estas células cancerosas abundantemente expressa proteínas da família Bcl-2, anti-apoptóticos, especialmente Mcl-1, a qual medeia a resistência TRAIL [14], [15]. Mcl-1 de inibição da via da morte celular mitocondrial é especialmente relevante para as células colangiocarcinoma como eles paradoxalmente expressar TRAIL

In vivo

, e provavelmente deve contornar continuamente citotóxica TRAIL sinalização para a sobrevivência [16]. Dada a dados emergentes implicando Hedgehog sinalização oncogénica na biologia do tumor gastrointestinal [17], [18], exploramos sinalização Hedgehog como um mecanismo de resistência para contribuir TRAIL por células cancerosas. Nós previamente relatado que a via de Hedgehog é constitutivamente activa nestas células e que a sua inibição sensibiliza células colangiocarcinoma a citotoxicidade TRAIL coincidindo com a sobre-regulação do receptor de TRAIL DR4 [19]. No entanto, não ficou claro como aumento da regulação do DR4 sozinho poderia superar a Mcl-1 bloqueio da via mitocondrial da apoptose. Neste estudo, demonstrámos que a sub-regulação de XIAP por inibição do ouriço converte Tipo II sinalização TRAIL a uma via de tipo I. Assim, nossos dados definir um mecanismo pelo qual a sinalização Hedgehog modula a morte celular induzida por TRAIL em células cancerosas e sugerem inibição desta cascata como potencial abordagem terapêutica para neoplasias TRAIL-resistentes ..

Materiais e Métodos

Ética Declaração

o Comitê IRB Clínica Mayo analisado e aprovado para estudos humanos do protocolo intitulado “análise da expressão do genoma de cholangiocarcinoma humana (CCC).” o comitê determinou que este constitui a pesquisa risco mínimo. Os dados foram analisados ​​de forma anónima.

Cultura celular

As linhas celulares colangiocarcinoma humanos, KMCH, HuCCT-1, e Mz-Cha-1, foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal de bovino, 100.000 unidades /L de penicilina, 100 mg /L de estreptomicina e 100 mg /L de gentamicina como descrito anteriormente [20], [21].

quantitativa de transcrição reversa-reacção em cadeia da polimerase (RT- PCR)

O ARN total foi isolado a partir de células usando o reagente TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA) e o ADNc foi preparado utilizando iniciadores aleatórios e Moloney vírus da leucemia murina de transcriptase reversa como anteriormente descrito em detalhe [22]. O produto de ADNc foi amplificado por PCR com ADN-polimerase Taq usando protocolos padrão. Os iniciadores de PCR são descritas na Tabela 1. Os iniciadores para o 18S ARN ribossomal (ARNr) foram adquiridos da Ambion Inc. (Austin, TX). PCR em tempo real foi realizado com o Roche LightCycler utilizando SYBR verde como o fluororo como previamente descrito [20]. O número de cópias de ARNm alvo em cada amostra foi normalizada como uma relação com o número de cópias para rRNA 18S no denominador.

A análise de imunotransferência

lisados ​​de células inteiras foram obtidos como previamente descrita por nós em detalhe [21]. As amostras de proteínas foram resolvidas por géis SDS-PAGE, transferidos para membranas de nitrocelulose e colocados a hibridar com os anticorpos primários indicados, a uma diluição de 1: 500 a 1: 1000. Os anticorpos secundários conjugados com peroxidase (Biosource International, Camarillo, CA) foram incubadas com uma diluição de 1: 3000 a 1: 5000. Os anticorpos ligados foram visualizados utilizando reagentes de quimioluminescência aumentada (Amersham, Arlington Heights, IL) e filme Kodak X-OMAT (Eastman Kodak, Rochester, NY). anti-soros primários foram aqueles criados para a actina, a proteína Bcl-2, Bcl-x, Mcl-1, e de Smoothened (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA: C11, B19, S18, S19, e H-300, respectivamente), Bid e cIAP-1 (R D Systems, Minneapolis, MN), Bim e XIAP (BD Biosciences, San Jose, CA), e c-IAP2 (Novus Biologicals, Littleton, CO). Para a quantificação da proteína XIAP por imunotransferência, os filmes foram analisados ​​por densitometria e a intensidade relativa do sinal do sinal de XIAP foram normalizados para a actina em três experiências separadas.

A apoptose

A apoptose foi quantificada por coloração morfologicamente os núcleos com 4 ‘, dicloridrato de 6-diamino-2-fenilindole (DAPI). As alterações nucleares características da apoptose (

i.e.

. Condensação de cromatina e fragmentação nuclear) foram avaliados por microscopia de fluorescência utilizando excitação e emissão de comprimentos de onda de 380 e 430 nm, respectivamente. foi empregue caspase-3/7 actividade em culturas de células para avaliar a apoptose bioquimicamente e foi medida através da quantificação de libertação fluoróforo a partir do substrato de caspase-3/7 usando o Apo-ONE

TM homogénea de caspase-3/7 kit (Promega, Madison , WI).

RNA de interferência

a 21-nucleotide sequência de RNA de cadeia dupla específico complementar ao alvo mensagem foi utilizada para silenciar humana cIAP-1, XIAP, Bak ou Bax expressão. siRNAs validados segmentação cIAP-1 ou de XIAP foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology. siRNAs segmentação Bak ou Bax foram concebidos e sintetizados utilizando o software disponível no www.ambion.com e o kit Silenciador siARN Construção de Ambion (Austin, TX). As sequências de siRNA utilizados para inibir a expressão de Bak ou Bax foram como se segue:

Bak,

5′-AAG TAC GAA GAT TCT TCA AAT CCT GTC TC-3 ‘;

Bax,

5′-AAG ACG AAC TGG ACA GTA ACA CCT GTC TC-3 ‘(sequência de T7-promotor parcial está em negrito). Como um controlo, as células foram transfectadas com um duplex de ARN mexidos com a seguinte sequência: 5’-GTG AAC ATT TAT GTC AGA ACC-3 ‘. Resumidamente, células cultivadas em pratos de 6 cavidades foram transitoriamente transfectadas com 30 nM de ARNsi utilizando 5 uL /​​mL siPORT

TM NeoFX

TM (Ambion Inc.). a expressão da proteína alvo foi avaliada através da análise immunoblot após transfecção com o siRNA.

RNA hairpin curto (shRNA) para Bid foi da Sigma Aldrich [MISSÃO curto RNA hairpin plasmídeo lentiviral, visando Nucleotídeos 376-396, Genebank adesão # NM_001196 ]. Para gerar o Bim alvo construto shRNA, foi empregue o plasmídeo que contém o promotor pSSH1 H1 humana para a expressão de shRNA. Um modelo de ADN de cadeia dupla (5′-GAT CCC CGC AAT AGG CTT TAG GAA AAT TCA AGA GAT TTT CCT AAA GCC TAT TGC TTT TTG GAA A-3 ‘) foi inserido no plasmídeo pSSH1 após o promotor da ARN-H1. A inserção de ADN contém sentido e anti-sentido sequências (negrito) para o ARNm Bim e uma sequência de ligante 9-nucleótido, obtendo-se a transcrição de um shRNA segmentação Bim. Para a transfecção estável, as células foram transfectadas utilizando KMCH OPTI-MEM I (Gibco-Invitrogen, Carlsbad, CA) contendo 5 ul /ml de Lipofectamine 2000 (Invitrogen), e o ADN plasmídico 3 ug /mL. Quarenta e oito horas após a transfecção, o meio fresco contendo 2 mg /mL de puromicina para o plasmídeo foi adicionado shRNA segmentação Bid ou 1,2 g /L foi adicionado a neomicina para o plasmídeo shRNA segmentação Bim. Os clones sobreviventes foram separados utilizando anéis de clonagem e foram cultivadas individualmente. partículas lentivirais contendo shRNA para SMO foram construídos usando o Induzível H1 Lentivirus RNAi Sistema BLOCK-iT (Invitrogen), seguindo o protocolo do fabricante. Sequências (inseridos em pLenti4 /BLOCK-iT-DEST) foram descritos como anteriormente descrito por nós [19]. Para a transfecção estável, meio fresco contendo 10 ng /mL Blasticidine-S e 500 ug /mL de zeocina (Invitrogen) foi adicionado às células 48 horas após a transdução. Os clones sobreviventes foram separados utilizando anéis de clonagem e foram cultivadas individualmente. A expressão foi induzida com 1 mg /ml de tetraciclina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Após um período adicional de 48 horas as células foram usadas para experiências. supressão alvo foi avaliada através da análise immunoblot.

eletroforética ensaio de desvio de mobilidade (EMSA)

extratos de células nucleares foram preparados usando reagentes NE-PER nuclear e citoplasmática de extração (Pierce, Rockford, IL) de acordo com as instruções do fabricante. Para EMSA, 20 ug de proteínas nucleares foram incubadas à temperatura ambiente durante 20 min em tampão de ligação (HEPES 25 mM, pH 7,5, NaCl 0,1 M, EDTA 2 mM, 6% glicerol, 0,1% de Triton X-100, de fenilmetilsulfonilo 0,1 mM flúor, ditiotreitol 0,4 mM, 0,5 mg /mL de poli (dl-dC), 0,5 mg /mL de esperma de salmão) com 0,04 pmol de oligonucleótido marcado Cy5.5-ADN de cadeia dupla (sintetizado pelo Mayo Clinic Genomics avançada tecnologia de núcleo, Rochester MN) que contém as sequências de ligação de tipo selvagem GLI putativos na região promotora do gene de XIAP humana

. os complexos proteína-ADN foram separados a partir da sonda de ADN não ligado por electroforese através de géis de poliacrilamida a 5% contendo 0,5X nativas Tris borato-EDTA. A fluorescência foi visualizada directamente no gel, utilizando um gerador de imagens fluorescentes Odyssey (Licor Biosciences, Lincoln, NE). Para ensaios de competição, um excesso molar de 200 vezes de oligonucleótido de cadeia dupla não marcada foi adicionada à mistura de reacção 20 min antes da adição da sonda fluorescente.

Cromatina imunoprecipitação

chip foi realizada a partir de células KMCH tratadas com 250 nM recombinante de sonic Hedgehog durante 5 horas usando DNA celular total cortado para -500 fragmentos pb, utilizando kit ExactaCHIP cromatina imunoprecipitação (R ​​ D systems) seguindo as instruções e amostras do fabricante foram pré-limpou usando pérolas de agarose além de salmão suspensão de esperma (Upstate, Lake Placid, Nova Iorque), antes da imunoprecipitação. primers de controlo positivo fornecidas pelo fabricante foram para o

Bcl-2

promotor (vinculado por GLI1 e Gli2) e a

GLI1

promotor (vinculado por Gli3). Primers para

XIAP

local promotor eu fosse, FORW: 5 ‘TTACTGCAGCCTCCAACTCC; Rev:. 5 ‘CATCTCTCCATGCTCTGAACTC

Análise Estatística

Todos os dados representam pelo menos três experiências independentes e estão expressos em média ± SE. As diferenças entre os grupos foram comparados usando ANOVA com Bonferroni correção post hoc

Materiais

Os reagentes foram adquiridos a partir dos seguintes fornecedores:. DAPI foi da Sigma; TRAIL humano recombinante e Sonic Hedgehog recombinante eram de R D Systems; anticorpo anti-humano de Fas (CH-11) foi de MBL International (Nagoya, Japão); cyclopamine era de LC Laboratories (Woburn, MA).

Resultados

inibição Smoothened down-regula a expressão cIAP-1 e XIAP

Dado um papel mecanicista crucial para o inibidor de apoptose proteínas (IAPs) na sinalização do receptor de morte [23] e o papel Hedgehog na sobrevivência celular, que se verificou inibir a primeira Smoothened (SMO), o componente de sinalização do complexo receptor de hedgehog, modula a expressão de IAP. O tratamento com ciclopamina, um inibidor farmacológica bem estabelecida de SMO [24], [25], diminuiu celular IAP-1 (cIAP-1) e IAP ligada ao X (XIAP) os níveis de proteína, mas não teve nenhum efeito sobre a proteína cIAP-2 expressão. A sub-regulação de XIAP era mais rápida, ocorrendo no prazo de 4 horas, enquanto que a perda de proteína cIAP-1 ocorreu apenas após 24 horas (Fig. 1a). O efeito farmacológico de ciclopamina foi validado usando shRNA alvo knockdown de SMO, um componente de sinalização do receptor de hedgehog, o que também diminuiu os níveis de ambas as cIAP-1 e XIAP proteína celular, mas não cIAP-2 (Fig. 1B). Para determinar se a inibição SMO afetado os níveis de mRNA ou agiu exclusivamente pós-transcricional,

cIAP-1 |,

cIAP-2

, e

XIAP

expressão de mRNA foi determinada após o tratamento cyclopamine ou shRNA para SMO. Ambos

XIAP

e

cIAP-1 | níveis de mRNA foram reduzidos pela inibição SMO (Fig. 1C). A relevância clínica de regulação IAP foi avaliada em tumores e amostras benignas adjacentes de pacientes com colangiocarcinoma. Um aumento de duas vezes na

XIAP

níveis de ARNm foi observada em tecido de tumor (Fig. 1D). Os níveis de

cIAP-1 | e

-2

não foram significativamente diferentes. Que

cIAP-1 | não é elevada em amostras de tumores apesar de o regulamento por Hedgehog (Fig. 1C) pode indicar adicional, como ainda desconhecidas fatores também contribuem para o controle da expressão IAP no tumor. Estes dados sugerem a via de sinalização Hedgehog regula

cIAP-1 | e

XIAP

expressão, mas que só

XIAP

níveis são elevados em amostras clínicas. Por isso, em grande parte focado em

XIAP

para o restante de nossos estudos.

A, Lisados ​​celulares

de células KMCH tratados com cyclopamine (5 M) durante os tempos indicados foram imunotransferidas para cIAP-1, cIAP-2 e XIAP. Actina foi utilizado como um controlo de carga.

B,

KMCH células foram transfectadas com um vector de expressão de shRNA induzível por tetraciclina segmentação Smoothened (shSMO) ou um vector de shRNA mexidos; shRNA expressão foi induzida durante 48 horas por tratamento com tetraciclina (1 mg /mL), seguido por imunotransf erência para cIAP-1, cIAP-2 e XIAP, utilizando lisados ​​de células inteiras.

C

, as células foram tratadas com o veículo, ciclopamina (5 uM), durante 24 horas, ou transfectada com shSMO como no painel

B de viajantes, em seguida, analisadas por em tempo real de RT-PCR para

cIAP-1 |,

cIAP-2 Comprar e

XIAP

usando RNA total.

D

, o ARN total a partir de amostras de tecido de qualquer um colangiocarcinoma (CCA) ou fígado benigno adjacente foi utilizado para avaliar

XIAP, cIAP-1, e cIAP-2

expressão de mRNA, e normalizada para 18S expressa como alteração dobra de benigno. Média ± SEM, * p 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001 comparado ao veículo

Gli2 liga-se ao

promotor XIAP

e regula a sua expressão

Para determinar se

XIAP

é transcricionalmente regulado por fatores de transcrição GLI Hedgehog-responsivos, buscamos 5 Kb região flanqueante 5 ‘do humano

gene XIAP

para o

GACCACCCAXXXXG

-3′ GLI consenso 5′- motivo de ligação. Dois promissores candidatos locais de ligação GLI (Fig. 2A) foram identificados a montante do

XIAP

local de início da transcrição (NM_001167) em posições -2820 /-2807 (Site I) e -1594 /-1581 (Sítio II ). Cada um tinha dois desemparelhamentos em comparação com a sequência de consenso [26]; Local I é idêntico ao sítio de nucleótidos validado 9-Bcl-2 GLI-ligação, Bs1 [27], enquanto O sítio II é idêntico ao local de ligação de DR4-GLI confirmada [19]. Realizamos experimentos de mobilidade ensaio de desvio de eletroforese. A ligação a ambas as sequências de ligação putativos GLI foi observada em extractos nucleares de células KMCH. O desvio de mobilidade da sonda CY 5,5-marcado pode ser impedida pela adição de um excesso molar de 200 vezes de sonda não marcada (concorrente; Fig. 2B). Dos três membros da família GLI, siRNA para Gli2 causou uma redução significativa da expressão de proteínas XIAP enquanto siRNA para GLI1 ou Gli3 não alterou os níveis de XIAP (Fig. 2C). Para verificar se GLIS ligam-se ao

promotor XIAP

, realizamos experimentos cromatina imunoprecipitação para avaliar ocupação do endógena

XIAP

promotor utilizando anticorpos para GLI1, Gli2 e Gli3. A ligação de Gli2 foi observada utilizando iniciadores que amplificam Site I (Fig. 2D). IgG de controlo não deu um produto, demonstrando a especificidade dos anti-soros usados, e sítios promotor-controlo positivo demonstrou o esperado ocupação por GLI1 e Gli2 (

Bcl-2

promotor), e Gli3 (

GLI1

promotor). Estes dados sugerem que Hedgehog regula diretamente

expressão de XIAP

pelo fator Gli2 transcrição de ligação para o site I no

XIAP

promotor.

A,

putativo GLI locais na região promotora do XIAP vinculativo. posições de nucleótidos foram contadas a partir do local de início da transcrição (SAT). Potenciais locais de ligação foram observadas como indicado pelas setas no esquema (I e II).

B,

extratos de proteínas nucleares foram isolados a partir de células KMCH. EMSA foi realizada utilizando oligonucleótidos de cadeia dupla Cy5.5-rotulados contendo as sequências de ligação GLI putativos dentro do promotor de XIAP humana e experimentos de competição com excesso de oligonucleotídeos frias molar de 200 vezes como descrito em “Materiais e Métodos”.

C

, proteína celular total foi isolado 48 horas após a transfecção transiente com o siRNA indicado contra membros da família GLI. a expressão da proteína XIAP foi determinada por imunotransf erência e o sinal foi quantificada por densitometria como uma razão para a expressão de actina.

D,

cromatina imunoprecipitação utilizando anti-soro para GLI1, Gli2, Gli3 ou um IgG controle foi realizada seguido por PCR usando primers flanqueando local I (341 pb) dentro do

região promotora XIAP

, como indicado. Como um controlo positivo, Chip foi realizada utilizando primers flanqueando o site

Bcl-2

promotor GLI-ligação (GLI1 e Gli2), ou primers flanqueando o sítio de ligação Gli3 dentro do

promotor GLI1

.

sensibilização pela inibição Hedgehog é independente de mediadores apoptóticos mitocondriais, Bid /Bim ou Bax /Bak

XIAP é um factor de discriminação fundamental para a conversão de tipo II para tipo I receptor de morte sinalização [9 ], assim, considerou-se a perda de proteína XIAP como um mecanismo pelo qual a inibição Hedgehog células colangiocarcinoma sensibilizados para TRAIL-induziu apoptose. Bid e Bim são intermediários chave de sinalização em Tipo II sinalização do receptor de morte pró-apoptótica [28], [29]. Com base nesta informação, o próximo apurado se a inibição Hedgehog células sensibilizadas a citotoxicidade TRAIL na ausência de Bid ou Bim. shRNA construções de direccionamento Bid e Bim eficiente derrubado os respectivos níveis de proteínas celulares (Fig. 3A). O silenciamento quase completa dos níveis de proteína lance ou Bim foi funcionalmente confirmada por aproveitando a observação de que Tipo Fas sinalização do receptor de morte II é dependente da Proposta ou Bim [30]. Com efeito, o Bid ou Bim knockdown foi suficiente para inibir a morte celular induzida por Fas pelo anticorpo agonista CH-11 (Fig. 3B e 3C), um clássico Tipo II via de morte celular [31]. Assim, se a morte celular induzida por TRAIL em células sensibilizadas com cyclopamine era dependente de sinalização do tipo II, em seguida, Bid ou Bim silenciamento deve proteger de forma semelhante a partir de citotoxicidade TRAIL. No entanto, apesar da ausência de Bid ou Bim, o cyclopamine inibidor de Hedgehog ainda sensibilizados células colangiocarcinoma humanos à morte celular induzida por TRAIL (Fig. 3D e 3E).

A,

análise Immunoblot foi realizada em lisados ​​de células inteiras obtidos a partir de células KMCH estavelmente transfectadas com o shRNA específica de segmentação

Bid

ou

Bim,

usando anti-soros indicada. Actina foi utilizado como um controlo de carga.

B

, as células transfectadas de forma estável com KMCH bid ou BIM-shRNA e as células parentais não transfectadas KMCH foram tratados com anticorpo agonista Fas CH-11 (100 ug /ml) durante 5 horas, seguido por coloração com DAPI. As células com morfologia apoptótica foram contadas. Média ± SEM, *** p 0,001 comparado com as células parentais tratados com CH-11.

C,

Em paralelo, a atividade da caspase-3/7 foi medida em células tratadas como no painel

B

. Média ± SEM, *** p 0,001.

D

, as células transfectadas de forma estável com KMCH bid ou BIM-shRNA foram pré-tratados com veículo ou ciclopamina (5 uM), durante 24 horas, e, em seguida, tratada com TRAIL (5 ng /ml) durante 5 horas seguido por DAPI coloração. As células com morfologia apoptótica foram contadas. Média ± SEM, *** p 0,001 comparado com células tratadas com TRAIL sozinho.

E

, linhas de células estáveis ​​KMCH foram tratados como no painel

D

, e depois de 5 horas /7 atividade foi medido 3-caspase. Média ± SEM, *** p 0,001 comparado com células tratadas com TRAIL sozinho.

F

, lisados ​​de células inteiras a partir de KMCH, HuCCT-1 e MZ-Cha-1 As células tratadas com veículo ou ciclopamina (5 uM) durante 24 horas foram analisados ​​por imunotransf erência utilizando anticorpos anti-Bcl-2, Mcl- 1, ou Bcl-x anti-soros. Actina foi utilizado como um controlo de carga.

L

, os lisados ​​celulares totais foram obtidos a partir de shBid-, shBim- e as células parentais não transfectadas KMCH tratados com veículo ou ciclopamina (5 uM) durante 24 horas e foram analisadas por imunotransf erência utilizando anticorpos anti-Bcl-2, Mcl- 1, ou Bcl-x anti-soros. Actina foi utilizado como um controlo de carga.

Como um desequilíbrio entre anti- e pró-apoptóticas proteínas da família Bcl-2 por ciclopamina poderia explicar os seus efeitos sobre a sensibilização de células à morte TRAIL, que perfilada esta classe de proteínas pela análise de imunotransf erência. Bcl-x

a expressão da proteína G foi significativamente menor em células KMCH do que as células HuCCT-1 ou MZ-Cha-1, mas nenhum dos três proteínas anti-apoptóticas (Bcl-2, Mcl-1, ou Bcl-x

L) foi alterada por tratamento ciclopamina (Fig. 3F). Ciclopamina também não alterou os níveis de proteína celular das proteínas da família Bcl-2, anti-apoptóticos em células transfectadas estavelmente com KMCH shRNA segmentação Bid ou Bim (Fig. 3G). Da mesma forma, a inibição SMO não altera BH3 apenas proteínas ou proteínas da família Bcl-2 pró-apoptóticos, Bax e Bak [19]. Tomados em conjunto, estes dados sugerem que a inibição da via de Hedgehog sensibiliza células colangiocarcinoma humanos para a citotoxicidade independente de TRAIL por um processo de proposta ou Bim ou alterações na expressão de proteínas de vários domínios da família Bcl-2. A independência da Proposta ou Bim sugeriu a possibilidade intrigante que cyclopamine pode sensibilizar células colangiocarcinoma para TRAIL através da conversão de sinalização apoptótica de um Tipo II para uma via de receptor de morte Tipo I.

Para testar esta hipótese, ao lado determinar se Hedgehog inibição converte Tipo de sinalização de receptor de morte II Tipo I sinalização. A condição sine qua non de Tipo I sinalização do receptor de morte é a falta de dependência de Bax e Bak [32]. knockdown eficiente dos níveis de proteína Bax e Bak foi conseguida por siARN de segmentação (Fig. 4A). Targeted knockdown da proteína Bax mais Bak funcionou para inibir a apoptose mediada por Fas por CH-11 (Fig. 4B e 4C), consistente com a sinalização do tipo II. TRAIL sozinho tinha um pequeno efeito apoptótico em células KMCH que foi eficientemente bloqueados por Bax /Bak silenciamento, o que indica que TRAIL normalmente mata as células colangiocarcinoma pela via Tipo II (Fig. 4D). No entanto, a apoptose induzida por TRAIL foi dramaticamente aumentada por cyclopamine (Fig. 4D e 4E). O aumento da apoptose era completamente (Fig. 4E) ou quase completamente (Fig. 4D) insensível à Bax /Bak silenciamento. Estes dados sugerem que a inibição do ouriço contorna resistência mitocondrial a citotoxicidade TRAIL através da conversão de uma sinalização do tipo II para tipo I uma via de sinalização.

A,

lisados ​​de células inteiras a partir de células transf ectadas transitoriamente com KMCH siRNA específico segmentação da Bax e /ou ARNsi Bak ou mexidos foram obtidos 48 horas após a transfecção e analisadas por imunotransf erência utilizando anticorpos anti-Bax, ou anti-soros anti-Bak. Actina foi utilizado como um controlo de carga.

B

, células KMCH transientemente transfectadas com Bax- e Bak-siRNA ou siRNA mexidos foram pré-tratados (24 horas) com o meio ou ciclopamina (5 uM) conforme indicado, em seguida, tratados com anticorpo agonista Fas CH-11 (100 ug /ml) durante 5 horas. As células com morfologia nuclear apoptótica foram contadas. A média +/- SEM; *** P 0,001.

C,

células KMCH foram tratados como no painel

B

e da atividade da caspase-3/7 foi medida após 5 horas. A média +/- SEM; *** P 0,001

D

, células KMCH transientemente transfectadas com Bax- e Bak-siRNA ou siRNA mexidos foram pré-tratados com veículo ou ciclopamina (5 uM), durante 24 horas, e, em seguida, tratada com TRAIL (5 ng /mL), durante 5 horas. As células com morfologia nuclear apoptótica foram contadas. Média ± SEM, # p 0,05 e *** p 0,001 comparado com as células transfectadas com ARNsi mexidos e tratados com TRAIL.

E

, células KMCH transientemente transfectadas com ARNsi indicados e tratadas como no painel

D

, foram ensaiadas depois de 5 horas de caspase-3/7 actividade. Média ± SEM; *** P . 0.001

Knockdown de

XIAP

sensibilizados células colangiocarcinoma para TRAIL-induziu apoptose apesar da inibição de proposta

Em seguida, determinou-se a relevância funcional de expressão de XIAP em células de cancro utilizando estes knockdown de

cIAP-1 | ou

XIAP.

direccionamento eficiente de cIAP-1 e em proteína XIAP expressão foi confirmada por análise de imunotransf erência (Fig. 5A-alvo ARNsi ). Consistente com relatórios anteriores [33], [34], [35], [36], knockdown de

XIAP

sensibilizado significativamente as células a citotoxicidade TRAIL, enquanto knockdown de

cIAP-1, apenas

modestamente sensibilizados as células à morte celular induzida por TRAIL, medido quer morfologicamente (Fig. 5B) ou bioquimicamente (Fig. 5C). Assim, a regulação da expressão de XIAP é um mecanismo potencial pelo qual a sinalização Hedgehog impede TRAIL citotoxicidade.

células KMCH foram transfectadas com siRNA mexidos ou siRNA específico para

cIAP-1 | ou

XIAP

.

A

, foram preparados lisados ​​de células inteiras para immunoblotting a partir de células KMCH 48 horas após siRNA transfecção.

B

, Quarenta e oito horas após a transfecção, como no painel

Um

, as células foram tratadas com TRAIL recombinante humana (5 ng /ml) ou meio durante 5 horas. As células foram então coradas com DAPI e as células com morfologia nuclear apoptótica foram contadas e expressas como uma percentagem de núcleos totais.

C,

Em paralelo, as células foram transf ectadas e tratados com TRAIL como no painel

B

, e após 5 horas a actividade da caspase-3/7 foi medido. Média ± SEM, * p 0,05; ** P 0,01; *** P . 0.001

Os dados acima são consistentes com um interruptor de Tipo II Tipo I apoptose mediada pelo receptor por inibição SMO; inibição SMO parece mediar essa opção pela expressão do gene XIAP

-regulação para baixo. Para testar esta interpretação dos dados, foi elaborado experimentos para verificar se knockdown de proteína XIAP foi suficiente para converter sinalização TRAIL, uma via independente de mitocôndrias do tipo I. Nós empregamos uma pequena molécula inibidora de Bid, BI-6C9, para contornar a morte celular dependente da mitocôndria [37]. Em primeiro lugar, para confirmar que o BI-6C9 morte celular funcionalmente inibida neste sistema, as células foram pré-KMCH tratada com BI-6C9 ou veículo (DMSO), seguido por anticorpo agonista Fas. Na verdade, a inibição farmacológica de proposta pelo BI-6C9 foi suficiente para reprimir a apoptose induzida por Fas. Mais uma vez, a inibição SMO não afectou a apoptose por tratamento de CH-11 (Fig. 6A). Em contraste, BI-6C9 não funcionalmente inibir a morte celular induzida por TRAIL em células tratadas com cyclopamine (Fig. 6B). Importante, siRNA dirigido contra XIAP células também sensibilizados para a apoptose induzida por TRAIL, e BI-6C9 não reduzir a morte celular (Fig. 6C). Assim, a inibição SMO, ao diminuir os níveis de proteína XIAP celulares, converte Tipo II TRAIL de sinalização de receptor de morte para uma via de Tipo I; um efeito recapitulou por siRNA alvo knockdown de

XIAP

.

,

células KMCH A foram incubadas durante 24 horas em meio ou cyclopamine (5 M), seguido por tratamento com veículo (DMSO, concentração final de 0,1% v /v) ou o inibidor de Bid, BI-6C9 (10 ^ M) durante 1 hora. *** P 0,001; *** P 0,001;