Abstract
Fundo
claudinas são conhecidas como proteínas de junções apertadas, e seu padrão de expressão no câncer gástrico ainda é controversa. A relação entre os padrões de proteínas de junções apertadas e proliferação do tumor expressão no câncer gástrico precoce ainda está longe de ser clara.
Objectivos
Para investigar os padrões de claudina-18 e Ki-67 em câncer gástrico precoce na frente invasiva e mucosa gástrica normal ao redor e investigar a função biológica da claudina-18 na proliferação e invasão das células cancerosas.
Métodos
Setenta e cinco por câncer gástrico precoce foram avaliadas lesões removidas através de ressecção endoscópica da mucosa ou ressecção submucosa endoscópica. Todas as lesões de câncer gástrico foram diagnosticados como adenocarcinoma diferenciado utilizando a Classificação japonesa de carcinoma gástrico. Para avaliar a proliferação epitelial, imunomarcação com Ki-67 foi realizada, e foi calculado o índice de marcação. Para avaliar a expressão de proteínas de junções apertadas epiteliais, foi realizada a coloração imunofluorescente de claudina-18. A imunorreactividade de claudina-18 foi graduada de acordo com o número de células coradas. análise de correlação foi realizada pelo coeficiente de correlação de Spearman. A transfecção de claudina-18 pequeno ARN interferente (siRNA) foi realizada em MKN74, uma linha celular de cancro gástrico claudina-18-positivas, para investigar o efeito da claudina-18 sobre a proliferação e invasão de células cancerosas.
resultados
Claudina-18 foi significativamente regulada no câncer gástrico em comparação com circundante mucosa normal gástrica ou metaplasia intestinal. O Ki-67 índice de marcação de câncer gástrico na frente invasiva foi inversamente correlacionado com o nível claudin-18, mas que, na lesão da mucosa não se correlacionou. Claudina-18 knockdown promoveu significativamente a proliferação de células MKN74 comparação com transfectadas com ARNsi de controlo. MKN74 invasão aumentou significativamente com claudina-18 siRNA transfecção comparação com transfecção controle siRNA.
Conclusões
Down-regulação da claudina-18 está associado com o potencial proliferativo na frente invasiva do câncer gástrico, sugerindo que tem um papel essencial na progressão do cancro gástrico
citação:. Oshima t, J Shan, Okugawa t, Chen X, Hori K, Tomita T et al. (2013) Down-Regulação da Claudina-18 está associado com a proliferativa e invasiva Potencial de câncer gástrico na frente invasiva. PLoS ONE 8 (9): e74757. doi: 10.1371 /journal.pone.0074757
editor: DunFa Peng, Vanderbilt University Medical Center, Estados Unidos da América
Recebido: 28 de maio de 2013; Aceito: 06 de agosto de 2013; Publicação: 20 de setembro de 2013
Direitos de autor: © 2013 Oshima et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Ministério da Educação, Cultura, Desporto, Ciência e Tecnologia do Japão através de um Grant-in-Aid para a Investigação científica (C) 2010-2012 (No. 22.590.691). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o câncer gástrico (GC) é a quarta neoplasia mais comumente diagnosticado ea segunda causa mais comum de mortalidade relacionada ao câncer em todo o mundo [1], [2]. Intramucosal GC pode ser tratado por tratamento curativo endoscópica. Além disso, o endoscópica da submucosa dissecção (ESD) técnica expandiu as indicações para o tratamento endoscópico e permitiu a ressecção em bloco de intramucoso grande e submucoso pouco invasiva precoce GCs [3]. Uma ressecção em bloco por ESD permite diagnóstico preciso da profundidade câncer [4].
junções apertadas (TJS) são domínios de membrana especializados na região mais apical do epitélio polarizado e células endoteliais [5]. Claudinas são as principais proteínas TJ; eles consistem de pelo menos 27 proteínas membros e são expressas de uma forma específica de tecido [6], [7]. Regulam permeabilidade paracelular e estabelecer polaridade celular epitelial, pela sua função de vedação [6], [8]. Um crescente corpo de evidências recentes sugerem que claudinas são componentes estruturais e funcionais chave de fios TJ [6], [9], e eles podem desempenhar um papel crucial na tumorigênese e inflamação [10], [11].
O epitélio gástrico apresenta uma série de mudanças na expressão claudin de mucosa normal para metaplasia intestinal e adenocarcinoma. Embora GCs foram recentemente classificados pela expressão à base de mucina [12], [13], uma classificação com base GC-claudina tem também sido propostos [14]. Nós também têm relatado que a sub-regulação de claudina-3 foi relacionada com a proliferação de intramucosal GC [15]. Recentemente, camundongos knock-out claudin-18 foram mostrados para ter atrofia da mucosa gástrica e paracelular H
+ ion vazamento [16]. Claudina-18a2 mostrou-se frequentemente regulados negativamente em GC de um fenótipo intestinal, sugerindo que claudina-18a2 seria um bom marcador para a GC [17]. No entanto, a função biológica de claudina-18, que pode estar envolvido no comportamento de células de cancro, nunca foi examinado. Além disso, não é claro qual a característica de células GC na frente invasiva está relacionada com o crescimento rápido ou agressividade de invasão.
No presente estudo, o nível de expressão da claudina-18 em GC na frente invasiva e mucosa gástrica foi examinada circundante, pela primeira vez, e a correlação entre o nível de claudina-18 e o Ki-67 o índice de marcação (LI) em GC foi avaliada. O efeito da claudina-18 sobre a proliferação e invasão
in vitro
foi também examinada.
Materiais e Métodos
Os pacientes
Uma série consecutiva de 74 pacientes GC com início foram estudados (Tabela 1). Foram avaliadas as lesões GC (n = 75) que haviam sido submetidos a curativa EMR ou ESD. GCs com invasão de submucosa (n = 31) foram incluídos neste estudo. cancros duplas foram detectadas em apenas um paciente do sexo masculino. Todo o GC foram classificados como adenocarcinoma diferenciadas usando a Classificação japonesa de carcinoma gástrico [18]. anonimato paciente foi preservada. Este estudo foi realizado em conformidade com a Declaração de Helsinki e foi aprovado pelo comitê de Ética /Institutional Review Board de Hyogo College of Medicine. O sujeito deu consentimento informado por escrito.
Imunohistoquímica
As amostras foram fixados com solução de formol a 10% e embebidos em parafina. As secções foram cortadas a 3 m de espessura e corados com hematoxilina e eosina (HE). Para avaliar a proliferação epitelial, as amostras foram incubadas com anticorpo monoclonal Ki-67 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA), seguido por incubação com anticorpo secundário biotinilado cavalo anti-ratinho (Vector Laboratories, Burlingame, CA, EUA). O método do complexo de estreptavidina-biotina (Vector Laboratories) foi usado para visualizar a imunorreactividade. Os núcleos foram contrastadas com hematoxilina.
imunofluorescente Coloração de proteínas juncional
anti-claudina 18-anticorpo
policlonal de coelho (Invitrogen) e IgG de cabra anti-coelho conjugado com Cy3 (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove , PA, EUA), anticorpo secundário foram usadas para visualizar imunorreactividade. A especificidade da reacção foi testada por incubação com soro de coelho não-imune (Dako, Glostrup, Dinamarca).
A pontuação da coloração imunológica de Claudina-18 e Ki-67
A imunorreactividade foi avaliada pela dois observadores independentes (T.Ok., XC), e ambos estavam cegos para as características clínicas e os resultados clínicos associados a cada amostra. mucosa gástrica não neoplásicas sem a metaplasia intestinal (não-MI) e a metaplasia intestinal (GI) e regiões de cancro foram avaliadas. A imunorreatividade da claudina-18 foi graduada utilizando os seguintes critérios: 0, ausência de coloração da membrana; 1+, menos de 10% das células tumorais com mancha da membrana completa; 2+, 10% a 50% das células tumorais com coloração da membrana completa; 3+, mais do que 50% a 75% das células tumorais com coloração da membrana completa, forte; e 4+, mais do que 75% de células com coloração da membrana completa, muito forte. Cinco campos de alta potência foram analisados em cada região dos casos e a pontuação média foi calculada. Todas as secções foram contadas duas vezes para confirmar a reprodutibilidade dos resultados. O Ki-67 LI foi calculado após a contagem de 1000 células cancerosas.
pequeno RNA de interferência (siRNA) Experimentos Knockdown
Para siRNA silenciamento de claudina-18 humana, em-alvo mais SmartPool e um não siRNA controlo espec�ico foi comprado de Dharmacon, Inc. (Lafayette, CO, EUA). A linha de células MKN74 (Coleção japonesa dos recursos biológicos de Pesquisa Cell Bank, Osaka, Japão), que é
CLDN18
-positivo, foi selecionado para estudar os efeitos da claudina-18 knockdown na proliferação e invasão propriedades das células GC . As células foram transfectadas com 25 nM de ARNsi utilizando DharmaFECTTM3 (Dharmacon, Inc.). Os grupos de controlo e de ARNip de controlo foram tratadas com os reagentes de transfecção sem siARN e os reagentes de transfecção com o controlo não-específica siRNA, respectivamente. Os ensaios foram realizados após 3 dias as células foram transfectadas MKN74.
Ensaio de Proliferação Celular
A proliferação celular foi determinada por um ensaio colorimétrico de viabilidade celular baseado na clivagem do sal de tetrazólio WST-1 por desidrogenases mitocondriais (Takara Bio Inc., Otsu, Japão). A absorvância do corante formazano formado, que se correlaciona com o número de células metabolicamente activas na cultura, foi medida a 450 nm 1 h após a adição do reagente.
Invasão Ensaio
invasão de células MKN74 foi ensaiada em 24 poços câmaras Biocoat Matrigel invasão (8 m; Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, EUA), de acordo com o protocolo do fabricante. As câmaras inferiores foram cheias com RPMI 1640 com 10% de FBS, e células (2 x 10
5) foram colocados nas câmaras de inserção, que continham RPMI 1640 sem FBS. Após 24 h de incubação, as células não-invasivos foram removidos com um cotonete. As células que migraram através da membrana e coladas à superfície inferior da membrana foram fixadas com formalina a 10% e coradas com hematoxilina. Para quantificação, as células foram contadas sob um microscópio em cinco campos aleatórios de alta potência. Os ensaios foram realizados em triplicado. Calculou-se a razão de invasão para controlar médio.
Análise Estatística
A avaliação estatística foi realizada utilizando SPSS13.0 (SPSS, Chicago, IL, EUA). análise de correlação foi realizada pelo coeficiente de correlação de Spearman (rs). As comparações múltiplas foram realizadas utilizando o teste de Kruskal-Wallis seguido pelo teste de Scheffe. comparações individuais foram realizadas pelo teste de Mann-Whitney.
P
. 0,05 foi considerado significativo
Resultados
A expressão de Claudina-18 em Mucosa Gástrica e Carcinoma
Um total de 75 casos de GC diferenciadas foram analisadas neste estudo. Os cortes foram corados com claudina-18, eo nível de coloração foi classificada. Claudina-18 foi detectada em níveis elevados em células epiteliais gástricas nas fronteiras lado apical e lateral em não-MI, mas não em células de adenocarcinoma primário ou diferenciados (Fig. 1A). Os níveis de claudina-18 foram significativamente mais baixos em células cancerosas do que em não-IM e IM, bem como significativamente menor no IM em comparação aos não-IM (Fig. 1B).
(A) coloração HE de mucosa gástrica com metaplasia não-intestinal (não-MI), metaplasia intestinal (GI), e cancro. Claudina-18 é detectado na mucosa gástrica com não-MI na fronteira membrana e a superfície lateral das células epiteliais, mas não com primário ou cancro. barra branca = 100 mm, Amarelo bar = 50 mm. (B) Claudina-18 nível é significativamente menor em GC do que em não-IM ou IM. O nível também é significativamente menor em IM do que em não-IM.
#
P Art 0,05 vs. IM. **
P
. 0,01 versus não-IM
Detecção de Claudina-18 em GCs com submucosa Invasão
casos GC representativos com invasão de submucosa mostrou que densa claudin-18 coloração era evidente na frente invasiva de células submucosa invadiu-câncer, e Ki-67 LI foi baixa na lesão (Fig. 2A). Em um caso com baixa claudin-18 coloração na frente invasiva de células de câncer invadiu submucosos, Ki-67 LI foi elevada na lesão (Fig. 2A).
coloração HE mostra casos de submucosa GC invasivo. Ki-67 núcleos positivos são detectados nas células cancerosas. O Ki-67 LI é baixa em caso de submucosa positiva claudina-18-coloração (3+) (à esquerda) e alta, num caso de claudina-18-submucosa coloração negativa (0) (direita). Barra = 100 um. (B) O Ki-67 LI é inversamente correlacionada com o nível de claudina-18 (rs = -0.550,
P
= 0,0010).
Correlação da Claudina-18 Nível e Ki-67 LI
o Ki-67 LI de GC na mucosa e submucosa foi determinada pela percentagem de núcleos Ki-67-positivas. Para determinar a correlação entre o Ki-67 LI eo nível claudin-18, foi realizada análise de correlação. O nível de claudina-18 expressão da mucosa não foi significativamente correlacionada com o Ki-67 LI (rs = 0,07,
P =
0,60). Por outro lado, o nível de expressão da submucosa claudina-18 estava significativamente correlacionada inversamente com a submucosa Ki-67 LI (RS = -0,550,
P
= 0,0010) (Fig. 2B).
Efeito da claudina-18 siRNA na proliferação e invasão das células GC
a linha de GC celular, MKN74, constitutivamente expresso claudin-18, eo nível de mRNA de claudina-18 foi significativamente reduzida em siRNA contra claudin- 18 (Fig. 3A). imunofluorescência com claudina-18 também diminuiu após a transfecção (fig. 3B). Em claudina-18 regulada para baixo MKN74, o crescimento celular foi aumentada significativamente (Fig. 4A), e a invasão das células foi significativamente aumentada (Fig. 4B).
(B) Coloração de claudina-18 é reduzido em 18 claudina-tratamento de siARN. Barra = 50 uM. Cada valor representa a média ± desvio padrão de 3 experiências independentes. **
P Art 0,01 vs. controlo ou controlar siRNA
(A) tratamento Claudina-18 siRNA induz significativamente a proliferação celular.. (B) Claudina 18 células transfectadas com siRNA MKN74 mostrar uma relação invasão significativamente maior comparado ao grupo controle ou controlar células transfectadas com siRNA. imagens típicas são apresentadas no topo. Barra = 500 um. Cada valor representa a média ± desvio padrão de 3 experiências independentes. **
P
. 0,01 vs. controlo ou controlar siRNA
Discussão
expressão alterada de claudinas na frente invasiva do submucosa pode estar relacionada com a progressão de GC. Estudos recentes sugerem que mesmo em pouco submucosa GC invasiva, sem linfático e vascular, a ESD pode ser viável como uma operação curativa [19]. No entanto, ainda não está claro qual os casos de submucosa ligeiramente GC invasiva pode ser seguido sem nova cirurgia após ESD. No presente estudo, verificou-se que houve uma correlação inversa entre o nível de claudina-18 e Ki-67 positividade na frente invasiva da submucosa GC invasivo, e que claudin-18 invasão celular GC regulamentado e proliferação. Ki-67 imuno-histoquímica foi substituído por contagem mitótica na avaliação da proliferação de células tumorais. Estudos têm demonstrado que o Ki-67 correlaciona-se com as células indiferenciadas e em doenças malignas metastáticas [20]. Neste estudo, GC, o EMR /ressecado ESD em que a indicação é limitada ao tipo diferenciado de GC foi estudada. Portanto, estes dados indicaram que o nível de Ki-67 na frente invasiva estava relacionado com células metastáticas em malignidades, e que a perda de claudina-18 foi um dos marcadores de agressividade GC e pode ser relacionada com o desenvolvimento de metástases, o que exige cirurgia adicional após o tratamento ESD
claudinas são anormalmente regulada numa variedade de tumores malignos, tais como a CG, carcinoma hepatocelular, carcinoma do trato biliar, cancro da mama, carcinoma de células renais, e mesotelioma [15], [21] -. [ ,,,0],25]. A mudança na claudinas nas junções está associada com a perda de aderência apertada e polaridade no epitélio. A perda de polaridade está associada com o aumento da proliferação celular e epitelial-mesenquimal de transição, enquanto as interrupções em complexos de junção apertados alterar as interacções célula-célula, que estão relacionados com a invasão e metástase [23], [26], [27]. Em estudos de observação, a diminuição da claudina-3 e -4 têm sido relatados em células GC na frente invasiva e foram correlacionadas com a progressão e metástase [14] do cancro. A sub-regulação de claudinas Também foi relatado em alguns outros tumores epiteliais, incluindo a perda de claudina-1 no cancro da mama [28] e o cancro do cólon [29], bem como a perda de claudina-7 no cancro da mama [30] e cabeça e pescoço câncer [31]. Em relação à invasão de células tumorais, a expressão reduzida de claudina-7 na frente invasiva foi encontrado para ser correlacionado com a profundidade de invasão e linfática em carcinoma de células escamosas do esôfago [32]. Embora claudin-3 e claudina-7 expressões eram mais baixos na frente invasiva do submucosa do que em lesões mucosas em nosso estudo anterior, claudin-3 e claudina-7 níveis na frente invasiva não se correlacionaram com o Ki-67 LI [15]. Por outro lado, claudina-18 na frente invasiva foi inversamente correlacionado com o Ki-67 LI no presente estudo. Estes dados podem ser relacionadas com os resultados que claudin-3 e claudin-4 não foram relacionadas com metástase ganglionar [33]. Além disso, estes estudos observacionais não pode explicar se essas mudanças afetam diretamente a invasão tumoral e metástase.
-Claudin 18 é expresso principalmente no estômago e células epiteliais do pulmão. Claudina-18a2 é o formulário para o estômago, e as isoformas são ligeiramente diferentes. Em um relatório anterior, tipo gástrico claudin-18 foi perdido em GCs [17]. No entanto, durante a metaplasia intestinal, o padrão de expressão claudinas já que difere da do epitélio gástrico normais. O desaparecimento da claudina-18 foi encontrado para ser associado com metaplasia intestinal no estômago [17]. Portanto, a perda de claudina-18 de expressão em GC avançada [17] não pode simplesmente demonstrar o carácter do cancro. Mesmo no processo de progressão GC, o nível de expressão pode mudar. Para explorar a função destas moléculas-alvo, nós pensamos que era importante examinar tumores na mesma fase, e avaliou o nível de claudina-18, o que pode afetar a invasão e metástase, na submucosa ligeiramente lesões GC invasivos. Além disso, a mucosa gástrica claudina-18 pode não funcionar apenas em TJs, porque a localização expressa na superfície da célula não foi apenas a TJs. Investigações adicionais são necessárias para analisar expressões de proteínas TJ fisiológicos e fisiopatológicos na membrana lateral.
Para verificar se as alterações nos níveis claudina-18 na frente invasiva do submucosa contribuiu para a proliferação e invasão das células cancerosas, um siRNA abordagem foi usada para knockdown da proteína na linha celular MKN74 de GC, o que é positivo para claudina-18. Assim, o presente estudo mostrou pela primeira vez a função de claudina-18 no GC usando uma abordagem genética, e que a perda de claudina-18 estava envolvido em ambos proliferação e invasão das células GC. Juntamente com esses dados, perda de claudina-18 na frente invasiva do submucosa indicou a aquisição de características mais agressivas e poderá permitir a dissociação célula-célula durante a invasão. No entanto, uma limitação do estudo foi que apenas MKN74 poderia ser examinada, porque era a única linha de células de câncer gástrico diferenciada que expressa claudin-18, tanto quanto nós examinamos. Portanto, fenômenos semelhantes não pode ser reproduzido com outras linhas celulares de cancro gástrico.
Ambos up-regulação e infra-regulação da claudinas foram relatados para ser envolvido no processo de câncer [34], [35]. Para a análise da função de claudinas em células cancerosas, as abordagens genéticas para claudinas também têm sido relatadas em várias células de cancro. Knockdown da claudina-1 por siRNA resultou na inibição da migração de células de cancro do cólon em [36]. A sobre-expressão da claudina-6, claudina-7, ou claudina-9 aumentaram o potencial invasivo de uma linha celular de adenocarcinoma gástrico [37]. Tal proliferação induzida por claudina e invasão pode parecer um paradoxo, porque claudinas são conhecidos por estar envolvidos na selagem junções epiteliais. Estes dados controversos sugerem que as funções de claudinas são ambos subtype- e células de tipo específico.
Como limitação deste estudo, ainda não é claro que esta diminuição claudin-18 nível na submucosa frente invasiva é realmente envolvido na metástase do cancro, porque é difícil de seguir a história natural do início de GCs. No entanto, os dados deste estudo indicou que um menor nível de claudina-18 na frente invasiva foi associado com maior tendência proliferativa. É necessário avaliar prospectivamente se esta diminuição do nível de claudina-18 pode ser utilizado como um biomarcador prognóstico metastático e após a ressecção endoscópica num futuro estudo.
Em resumo, foi demonstrado pela primeira vez que claudina-18 é expressa heterogeneamente em frente da submucosa invasiva de GC no início, e a sub-regulação de claudina-18 está associada com o potencial proliferativo e invasivo da GC. Estes resultados indicam que claudina-18 tem um papel fundamental na progressão da GC e pode ser um candidato biomarcador da progressão da doença. A claudina-18 experimento knockdown confirmou que a supressão da juncional claudin-18 promoveu a proliferação e invasão das células GC.
Reconhecimentos
Agradecemos Ms. Noriko Kamiya para assistência técnica.